引物设计注意事项
qpcr引物设计原则和注意事项
qpcr引物设计原则和注意事项
qPCR引物设计原则和注意事项
qPCR引物设计是指为了检测特定基因序列而设计的一种引物，是实现qPCR技术的关键技术之一。
引物设计的准确性和准确性直接影响qPCR的精确性、可靠性和重复性。
qPCR引物设计的原则是：1）选择被检测序列的5’端两个核苷酸作为引物的开始；2）采用20-23bp的长度，保证引物的灵敏度和特异性；3）引物的Tm值应位于55-60°C，以确保引物有足够的结合力；4）尽量避免引物中存在重复序列；5）尽量避免引物中存在非特异性结合位点。
在设计qPCR引物时，应注意以下几点：1）选择被检测基因序列的特定位置作为引物的起始位点；2）计算引物的Tm值，以确保引物的结合力；3）避免引物中存在重复序列及其它非特异性结合位点；4）加入引物的标记磷酸，以增加引物的特异性；5）检查引物序列中是否存在致突变的核苷酸；6）检查引物序列中是否存在非特异性结合位点。
总之，qPCR引物设计是一项重要且复杂的技术，设计者必须特别注意以上原则和注意事项，以确保设计出的引物具有足够的特异性和灵敏度，以实现qPCR的准确性和可靠性。
引物设计的要求
引物设计的要求
首先，引物设计的要求包括引物长度和序列的选择。
引物长度一般在18-25碱基对之间，太短的引物可能导致特异性不高，而太长的引物可能
导致扩增效率低下。
同时，引物的序列应该是与目标DNA片段互补的，以
确保引物能够在目标DNA上进行合成。
其次，引物设计的要求还包括引物的GC含量。
GC含量过高或过低都
可能导致PCR扩增效率下降，因此通常希望引物的GC含量在40-60%之间。
此外，引物的GC含量也会影响PCR产物的熔解温度，更高的GC含量会使
得熔解温度升高。
因此，在引物设计中，需要根据需要来调整引物的GC
含量，以适应实验条件和目标DNA的特性。
此外，引物设计的要求中还包括引物的特异性。
引物应该能够特异性
地与目标DNA片段结合，而不与其他DNA序列结合。
为了提高引物的特异性，可以使用基因组数据库进行引物序列的BLAST比对，以确保引物序列
只与目标DNA片段匹配。
最后，引物设计的要求还包括引物的纯度和浓度。
引物的纯度应该高，以避免引物之间的杂交和非特异性扩增。
引物的浓度要适当，通常在10-100 pmol/μl之间，以确保引物能够充分参与PCR反应。
总之，引物设计的要求包括引物长度和序列的选择、引物的GC含量、引物之间的配对性、引物的特异性以及引物的纯度和浓度。
满足这些要求
可以提高PCR反应的效率和特异性，从而得到准确可靠的实验结果。
pcR引物设计注意事项
ORF (Open reading frame ) 开放阅读框是基因序列的一部分，包含一段可以编码蛋白的碱基序列，不能被终止子打断。
CDS(coding sequence)序列是编码序列，是用来编码蛋白质的那段序列，是mRNA的一部分.通常外显子指的是编码蛋白序列.严格地说,外显子是指保留在初级ｍＲＮＡ中不被剪切掉的区域,包括5’非翻译区(5’UTR)、编码序列和3’非翻译区(3’UTR)。
所以mRNA的外显子的概念应该要大于CDS序列的范畴何谓PCR？PCR引物设计时有哪些注意事项（1）聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction）。
（2）PCR引物设计原则1设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。
设计引用有一些需要注意的基本原理：②引物长度②GC含量，一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。
若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。
③退火温度退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。
一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。
④避免扩增模板的二级结构区域选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。
用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol 时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
⑤与靶DNA的错配⑥引物末端引物3’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。
circRNA引物设计2024
circRNA引物设计2024circRNA引物设计2024circRNA（circular RNA）是一类特殊的非编码RNA，其结构呈环状，不同于传统的线性RNA。
近年来，circRNA的研究逐渐受到人们的关注。
circRNA具有稳定、高度保守以及高表达等特点，被认为在生物体内具有重要的功能。
在circRNA的研究中，引物设计是非常关键的一步，本文主要介绍circRNA引物设计的方法及相关注意事项。
circRNA的引物设计可分为两种情况，一种是用于检测circRNA的存在和表达水平，另一种是用于研究circRNA的功能或定位等。
对于前一种情况，在circRNA的引物设计中，可以根据circRNA的序列信息，使用经典的PCR引物设计方法进行设计。
一般而言，引物长度应控制在18-25个碱基对之间，GC含量应在40-60%之间。
此外，由于circRNA具有环状的结构，因此引物的设计应考虑到这一特点。
首先，引物的序列应该处于circRNA的环内部，这样才能够在PCR反应中成功扩增目标circRNA序列。
其次，引物的两端应具有一定的互补性，以确保引物在环内结合。
最后，引物的设计应尽量避免与线性RNA序列互补，以防止引物在扩增过程中与线性RNA发生非特异性结合。
在引物设计中，可以借助一些在线工具和软件，如Primer3、NCBI Primer-Blast等，来辅助设计引物。
对于后一种情况，circRNA的引物设计相对复杂一些。
首先，需要考虑引物的选择和设计要与circRNA的功能或定位相关。
例如，如果研究circRNA在细胞质中的功能，引物的设计则需要能够在细胞质中扩增circRNA的序列；如果研究circRNA的定位，引物的设计则需要与目标细胞器或亚细胞结构相关。
此外，还需要注意引物的设计要避免与其他相关的RNA互补，以确保引物的特异性。
在引物设计中，可以根据circRNA的序列特点和已有的研究数据来选择和设计合适的引物。
引物的设计及修饰
1.引物设计的基本原则是什么？引物设计的下列原则供您参考：1)引物最好在模板cDNA 的保守区内设计。
2)引物长度一般在15-30碱基之间。
3)引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃。
4)引物3′端要避开密码子的第3位。
5)引物3′端不能选择A，最好选择T。
6)碱基要随机分布。
7)引物自身及引物之间不应存在互补序列。
8)引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。
9)引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
10)扩增产物的单链不能形成二级结构。
11)引物应具有特异性。
2.常用引物设计软件有哪些？常用的软件有Oligo6和Primer Premier5.0。
引物设计软件是根据引物设计的指导意见设计而成。
其实，PCR扩增的成败最关键的是反应模板的制备和反应条件的控制。
引物设计软件的缺点是，有时判断为该基因没有一段区域满足标准引物的要求。
金斯瑞为您提供以下引物设计相关软件：引物计算工具引物设计工具测序引物设计软件Real-time PCR引物设计软件3.文献上找到的引物和探针序列能否直接使用？通常国外的文献可信度比较高，可直接使用；但为了保险起见，最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证；或者再进一步用引物设计软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析，这样更有利于您对整个实验的把握。
4.如何计算引物的Tm值？Tm值的概念：DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度，亦即DNA变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度(Tm)。
金斯瑞采用以下方法计算Tm 值：长度为20mer及以下的引物，Tm计算公式为：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)。
但这个公式只适用于14~20个碱基的引物，引物的TM值还与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲溶液的离子强度等有关。
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm=0.41(%of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；%of GC：引物GC含量；%of GC=GC个数/引物总碱基数5.常见的引物修饰的有哪些?修饰说明3)强烈建议用RNase-free的TE(pH8.0)buffer溶解探针，这样得到的探针溶液更稳定，保存时间更长。
基因引物设计的注意事项
基因引物设计的注意事项
1. 嘿，一定要注意引物的特异性啊！就好比你去参加一个聚会，可不能找错了对象，得找到那个独一无二的才行啊！比如说设计针对某个特定基因的引物，要是特异性不强，那不就跟在一堆人里瞎找一样嘛，那可不行！
2. 还有哦，引物的长度也很关键呀！太短了就像小矮人一样没啥力气，太长了又会变得很笨拙。
就像挑扁担，太短挑不起来，太长又不好掌控。
比如设计一个合适长度的引物，才能发挥出最佳效果呀！
3. 千万别忽视引物的退火温度哦！这就像是给菜调味一样，温度不合适，味道就不对啦！比如在某个实验中，如果退火温度不合适，那结果可能就一塌糊涂咯！
4. 哎呀呀，要考虑引物之间的互补性呀！可别让它们自己就黏糊到一块儿去了。
这就跟两个人老在那腻歪，不好好干活一样。
像如果引物之间互补过度，那还怎么好好进行实验呢！
5. 要注意引物不能有二级结构呀！要是有了，那可不就像路中间有个大石头一样挡路嘛。
比如说一个设计不当有二级结构的引物，肯定会影响反应的进行啦！
6. 你知道吗，引物的 GC 含量也不能马虎！这就像做饭盐放多放少一样重要。
要是 GC 含量不合适，那实验可能就搞砸啦！就像某次实验，因为引物的GC 含量没把握好，结果就不尽如人意呀！
7. 最后啊，一定要多检查几遍引物的设计呀！这就和出门前照镜子一样，要反复确认没问题才行。
你可不想因为引物设计有漏洞而导致一切努力白费吧！所以，一定要认真对待基因引物设计的这些注意事项哦！
我的观点结论就是：基因引物设计的这些注意事项真的超级重要呀，每个环节都要用心去对待，这样才能得到满意的结果呀！。
引物注意事项
引物注意事项引物是分子生物学和遗传学研究中常用的一种技术工具，它们通常用于PCR、测序、杂交等实验中。
选择合适的引物对于实验结果的准确性以及实验效率都有着非常重要的影响。
因此，在使用引物时，需要注意以下几点事项：1. 引物设计：在选择引物时，需要根据所需扩增的目标基因序列来设计引物。
引物应该具有较高的特异性，即只与目标基因序列特异性结合，而不与其他非特异性序列结合。
同时，引物的长度和GC含量也需要根据实验需要进行合理设计，一般引物长度在18-25个碱基对之间，GC含量在40%-60%之间比较适合。
2. 引物纯度：引物的纯度对扩增反应的效果有着直接的影响。
在购买引物时，需要选择质量可靠的生产商，并确认引物的纯度和质量，并进行必要的质检，确保引物的质量符合实验要求。
另外，在实验中使用引物前，也需要对引物进行适当的纯化处理，以确保引物的纯度。
3. 引物浓度：在实验操作中，需要根据实验要求调配合适浓度的引物溶液。
一般情况下，引物的浓度在10-100μM之间比较适合。
引物的浓度过高或过低都会影响PCR扩增的效果，因此需要根据实验需要进行合理的调整。
4. 引物储存：引物的储存条件对于引物的稳定性和活性有着重要的影响。
一般情况下，引物需要保存在干燥、阴凉、避光的条件下，避免长时间暴露在高温、阳光下。
另外，在制备引物溶液时，也需要避免多次冻融，以保证引物的稳定性。
5. 引物使用量：在实验中使用引物时，需要根据实验要求合理确定引物的使用量。
一般情况下，引物的使用量会影响到扩增效果和实验成本，因此需要在实验前对引物的使用量进行合理估计和计算，以确保实验的顺利进行。
6. 引物的合成：在一些特殊实验中，有时需要对引物进行修饰或合成，以满足实验的特殊要求。
在这种情况下，需要选择合适的引物合成技术和合成商，确保引物合成的质量和效果达到实验要求。
总之，引物在分子生物学和遗传学研究中起着非常重要的作用，选择合适的引物并注意引物的质量、纯度、浓度、储存和使用等方面的事项，对于实验结果的准确性和稳定性有着重要的影响，因此在使用引物时需要特别注意以上事项，以确保实验的顺利进行和结果的准确性。
引物设计注意事项
引物设计注意事项引物设计在基因的相关研究中极其重要，其中自己比较熟悉的一点是基于引物设计的全长cDNA文库的构建。
全长cDNA序列的获取是一个十分困难的过程，因此这类数据在GeneBank库中存储较少。
在过去的试验中，常见的方法是利用PCR对mRNA序列进行多次扩增，尽可能地获得“全长”的cDNA序列，但是这样的方法很难得到完整的UTR区域。
自2000后，发展较迅猛的一个方法是日本一个研究所的“Oligo-capping"方法。
该方法的过人之处在于：为mRNA的设计了两个不同的引物。
在3‘UTR区域，PolyA信号的存在可以很方便地设计对应的引物，在5’UTR区域，该方法用一段寡聚核甘酸代替mRNA的帽子结构，从而很容易地设计出对应的引物。
从理论上讲，这种试验方法可以得到100％的全长cDNA，但是试验中多种因素的制约，使得该方法得到的cDNA中约有50％～80%的全长cDNA。
如果试验生物学家能够解决这个难题，那么生物信息中对基因组的研究将会有很大的飞跃。
汗ing，偶没有做过相关的试验，算是抛砖引玉了，，表砸我。
基本PCR引物设计参数引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
特异性是指发生错误引发的频率。
特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。
①引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制。
如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。
引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。
为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。
总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。
每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
引物设计首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
引物设计应注意如下要点：1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 (22)bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2. 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，如GGG或CCC，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。
而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
非配对结构最好出现在引物中间。
另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败，3’端尽量不含互补碱基。
5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法。
6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。
引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8. 对引物的修饰一般是在5’端。
引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA 序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
9.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
10.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。
否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
11. 扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP 对扩增的成功是有帮助的。
引物合成1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步，将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
它不能有效去除比目的片段短的小片段。
实际上，它是一种脱盐的作用。
这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。
对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。
◆OPC纯化：OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge 柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。
OPC法纯化的DNA纯度大于95%。
适用于40mer以下引物的纯化。
◆PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA 片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。
PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。
◆HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。
纯度可以大于99%。
主要用于短链和修饰引物的纯化。
该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。
3.引物的OD数如何定量？引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。
测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。
DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。
需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。
4.定量不准是怎么回事儿？（1）生产人员定量错误。
（2）分装没有问题，但引物抽干或收样过程中，引物干粉可能意外丢失。
（3）系统误差，10%左右为允许误差。
引物工作浓度范围很宽，少许偏差不影响实验。
（4）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。
验证标2OD引物量是否准确，简单的做法是：加入1ml水，彻底溶解混匀后，取100ul, 加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm, 此时光吸收的读数为0.2。
5.需要什么级别的引物？引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。
根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增< 45base OPC>45 base PAGE诊断PCR扩增< 40base OPC, PAGEDNA测序20base左右OPC亚克隆，点突变等根据实验要求定OPC, PAGE，HPLC 基因构建（全基因合成）根据实验要求定PAGE反义核酸根据实验要求定PAGE修饰引物根据实验要求定PAGE, HPLC6.最长可以合成多长的引物？引物越长，出现问题的概率就越大。
我们合成过120base的引物，但是产率很低。
除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。
7.需要合成多少OD数？根据实验目的确定。
一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。
如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。
但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。
做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。
片段越长, 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。
超出需要之外的OD 数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。
8.如何检测引物的纯度？实验室方便的作法是用PAGE方法。
使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。
加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。
600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。
9.如何计算引物的浓度？引物保存在高浓度的状况下比较稳定。
引物一般配制成10-50pmol/ul。
溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD 数是否一致。
一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。
引物的分子量可以从合成报告单上获得。
如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。
注意：1 OD260= 33 ug/ml.10.如何计算引物的Tm值？引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
11.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。