发酵工程课程设计PPT课件
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第五节发酵工程简介ppt课件
灭菌
• 发酵工程所用的菌种大多是单一的纯种， 整个发酵过程中不能混入杂菌。为什么呢？
– 在发酵过程中如混入其他微生物，将与 菌种形成竞争关系，对发酵过程造成不良 影响。
– 例如：如果在谷氨酸发酵过程中混入放 线菌，则放线菌分泌的抗生素就会使大量 的谷氨酸棒状杆菌死亡。
灭菌
• 那如何防止杂菌的污染呢？
发酵过程（中心阶段）
检测进程，满足营养需要； 严格控制温度、pH、溶氧、 转速等
灭菌
杀灭杂菌（胞体、 孢子及芽孢）
扩大培养和接种
2、培养基的配制
• 这种培养基从组成成分和物理性质上看属于 哪种培养基?
– 从物理性质上成看分是液体培养基，从化学酸成碱分度上看是天 然培养基。问题1：在工业生产过程中常采用这种天然成 豆分饼作水为解营液养、物玉质米的浆液、体尿培素养、基磷，酸这在发p酵H：生7产—中8有什么 二好氢处钾呢、？氧化钾、硫酸镁、生物素
谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径
谷氨酸棒状杆菌在一定 的条件下能够利用环境 中的营养物质来合成谷 氨酸。
在工厂里是 怎样应用谷氨酸 棒状杆菌来生产 谷氨酸的？
• 菌种选育
分离纯化
自然界选种、诱变育种、菌 体：过滤、沉淀
基因工程、细胞工程 代谢产物：蒸馏、萃取、离子
交换
培养基配制
根据培养基的配制原 则制备，实践中需多 次试验
– （1）根据不同的菌种，应选择不同的材料配 制培养基。配制的培养基应满足微生物在碳源、 氮源、生长因子、水、无机盐等方面的营养要求， 并为微生物提供适宜的pH。
– （2）培养基的营养要协调，以利于产物的合 成。
3、灭菌
• 配制好培养液后，是否可以立即加入菌种？
– 不能 – 需要进行灭菌
发酵工程PPT教学课件
15、分解代谢：又称异化作用，是指由复杂的营养物质分 解成简单化合物的过程。
16、合成代谢：又称同化作用，是指由简单化合物合成复 杂的细胞物质的过程。
一 17、代谢控制发酵：是利用遗传学的方法或其他生物化学
、 方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，
概 述
使有用目的产物大量生成和积累的发酵。
容
稀释
表型 → 出现表型
2、发酵
（1）发酵生物反应器
二 、
① 类型 p203：搅拌式生物反应器、鼓泡式反应器、
发 气升式反应器
酵
工
② 优点：染菌率极低、发酵设备大型化、利用生物
程 的
技术提高了产量和降低了本、提高了产品的回收率和
内 质量
容
③ 要求：内壁与管道焊接部位都要求平整光滑、无
裂缝、无塌陷，便于测量器内的温度、pH值和氧气含量
一 、
有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化
概 的生物化学过程。
述
21、膜生物反应器：利用膜的阴留性能将生物催化剂限制
在膜组件的固定空间，供给所需的底物和营养物，即可在
固定空间内进行生物反应，而产生的产物造成真空膜，进
入膜的另一侧空间，脱离生物催化剂，达到了生物反应与
产物分离同时进行的目的。
始的。当时主要是以酒精发酵、甘油发酵和丙醇发酵等为
一 、
主。20世纪40年代，弗莱明发现了青霉素，开始采用深层
概 发酵法大量生产。此后，链霉素等几十种重要的抗菌素相
述 继问世，带动了抗菌素工业的诞生。发酵工业由无氧条件
下的发酵发展到了有氧发酵。
长期以来，几乎都是以碳水化合物作为发酵的原料，
而到60年代增加了正烷烃、醋酸、醇类和天然气等。发酵
发酵工程课上优质课件(35张PPT)
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(2)倒平板操作 操作过程如图所示，操作时要待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近进行。
制备固体培养基最后要将平板倒置，其主要目的是防止培养皿皿盖上的水珠滴入培 养基造成污染。
• 4. (2). 糖类是主要的能源物质，可以为酵母菌的生长、繁殖提供 能源物质，还可以作为酒精发酵的原料 葡萄皮上附着有野生的 酵母菌 醋酸菌大量增殖，进行醋酸发酵
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典例分析解读
1.(2018·全国Ⅰ，37)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。 在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答 下列问题： (1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制__细__菌____的生长， 加入了链霉素的培养基属于_选__择___培养基。 (2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除 氮源外，还有_碳__源__、__无__机__盐___(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物 大分子有__蛋__白__质__、__核__酸____(答出两点即可)。
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3.微生物在传统发酵技术中的应用
项目
果酒和果醋的制作
腐乳制作
作用菌类
果酒：酵母菌 果醋：醋酸菌
毛霉
原理
①酵母菌在无氧条件下将葡 毛霉将蛋白质、
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(2)倒平板操作 操作过程如图所示，操作时要待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近进行。
制备固体培养基最后要将平板倒置，其主要目的是防止培养皿皿盖上的水珠滴入培 养基造成污染。
• 4. (2). 糖类是主要的能源物质，可以为酵母菌的生长、繁殖提供 能源物质，还可以作为酒精发酵的原料 葡萄皮上附着有野生的 酵母菌 醋酸菌大量增殖，进行醋酸发酵
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典例分析解读
1.(2018·全国Ⅰ，37)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。 在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答 下列问题： (1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制__细__菌____的生长， 加入了链霉素的培养基属于_选__择___培养基。 (2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除 氮源外，还有_碳__源__、__无__机__盐___(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物 大分子有__蛋__白__质__、__核__酸____(答出两点即可)。
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3.微生物在传统发酵技术中的应用
项目
果酒和果醋的制作
腐乳制作
作用菌类
果酒：酵母菌 果醋：醋酸菌
毛霉
原理
①酵母菌在无氧条件下将葡 毛霉将蛋白质、
《发酵工程绪论》PPT课件
h
22
一、发酵工程的特征
（p13）
1、原料：发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他 农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源 就可进行反应。可以利用废水和废物等作为发酵 的原料进行生物资源的改造和更新。
2、菌种：微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过 变异和菌种选育，可以获得高产的优良菌株并使 生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规 方法难以生产的产品。
h
10
4、发酵的现代概念
• 利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程， 统称为发酵。
h
11
利用微生物的特点：
• 发酵工程所利用的微生物：细菌、放线菌，酵母菌和霉菌等。 • 利用微生物的特点：
(1)对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大的适应能力。 (2)有极强的消化能力。 (3)有极强的繁殖能力。
h
16
（三）发酵工程产品的类型
• 酒精类饮料、醋酸和面包，而且生产胰岛素、 干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等多种食品 、医疗保健药物；
• 天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂等农用 生产资料；
• 氨基酸、香料、生物高分子、酶以及维生素； • 单细胞蛋白等微生物菌体。 • 生物能 • 微生物冶炼 • （p3 ）
病用的疫苗等。 • 特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率
最高阶段，生长稳定期产量最高。
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30
2、微生物代谢产物发酵
• 包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。 • 对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢
产物。 • 各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来
发酵工程 ppt课件
100%
酵母菌
单细胞真菌，具有真核细胞结构 ，有产孢子繁殖和水生、好气性 生长及醇发酵和糖发酵等类型。
80%
霉菌
丝状真菌的俗称，意即多细胞的 真菌，在自然界中广泛存在。
微生物的营养需求
水
微生物细胞的主要组成部分， 是良好的溶剂，能维持酶活性 ，参与代谢反应。
无机盐
参与细胞构成和代谢反应，对 细胞的渗透压平衡和酸碱平衡 起着重要作用。
利用发酵技术生产面包、啤酒 、酸奶等食品。
医药工业
生产抗生素、疫苗、干扰素等 生物药物。
化学工业
生产燃料、化学品、塑料等物 质。
环境治理
利用微生物处理废水、废气， 实现环境保护和治理。
02
发酵工程的基本原理
微生物的种类与特性
80%
细菌
根据形态可分为球菌、杆菌、螺 旋菌等，根据对人类的关系可分 为致病菌、条件致病菌和益生菌 。
细胞分离
通过离心、过滤等技术将菌体从发酵液中分离出 来。
产物纯化
通过一系列的分离纯化技术，如蒸馏、结晶、色 谱等，将产物纯化至所需的规格和纯度。
04
发酵工程的应用实例
酒精发酵Βιβλιοθήκη 010203
酒精发酵简介
酒精发酵是一种通过酵母 菌将糖类物质转化为乙醇 的过程，广泛应用于酒精 饮料、化工等领域。
酒精发酵工艺流程
提高产物的产量与质量
代谢工程
通过代谢工程手段，对微生物的代谢途径进行优化，提高目标产 物的产量和纯度。
过程控制
采用先进的传感器和在线监测技术，实时监测发酵过程，实现精 准控制，提高产物质量。
降低生产成本与环境污染
节能减排技术
采用新型发酵设备，提高设备利用率和能源利用效率，降低能耗和碳排放。
发酵工程六PPT课件
.
24
二、人工控制微生物代谢的手段
（一）生物合成途径的遗传控制
代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改变代谢 通路、降低支路代谢总产物的产生或切断代谢途径及提高 细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。
1、代谢缺陷型菌株
2、利用抗代谢类似物的突变积累氨基酸
3、产物降解酶缺失突变株
4、细胞膜组分的缺失突变
.
30
生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，生物素在低于亚适浓度之
前有，利例增于加谷1：生氨谷物酸氨素的酸有合棒利成杆于；菌丙（酮生酸物的素羧缺化陷产型生）草生酰产乙谷酸氨，酸进而
生物素是催化脂肪酸生物合成的初始酶乙酰辅酶A羧化酶的 辅酶，该酶催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A，再 经一系列转化合成脂肪酸，而脂肪酸又是构成细胞膜磷脂 的主P要EP成分，因P此y生r 物素可间A接cC地o影A 响细胞膜的透性。
真核微生物细胞里，各种酶系被细胞器隔离分布，使
其代谢活动只能在特定的部位上进行，如与呼吸产能有 关的酶系集中于线粒体内膜上，DNA合成的某些酶位于 细胞核里。
.
5
（二）代谢流向的调控
微生物在不同条件下可以通过控制各代谢途径中某个酶促反应的速 率来控制代谢物的流向，从而保持机体代谢的平衡。
1、由一个关键酶控制的可逆反应
第六章 发酵机制及发酵动力学
第一节 发酵工程微生物的基本代谢及产物代谢 第二节 微生物代谢调节机制 第三节 糖代谢产物的发酵机制 第四节 氨基酸和核苷酸发酵机制 第五节 抗生素发酵机制 第六节 微生物发酵动力学
.
1
本章要求
掌握初级与次级代谢的产物 掌握微生物代谢调节的方式 掌握酶活性被抑制的方式 了解发酵产物的发酵机制及发酵动力学抑制来自抑制DE
发酵工程 ppt课件
同时，也可以把发酵的微生物分离出来，通过人工培 养，根据不同的要求去诱发各种类型的发酵，获得所需的 发酵产品。
Louis Pasteur 1822-1895
• Paster最终使科学界信服在发酵过程中酵母所遵循的规律
• 其后不久，科赫(Koch)建立了单种微生物分离和纯培养技 术，利用这些技术研究炭疽病时，发现动物的传染病是由 特定的细菌引起的。从而得知，微生物也和高等植物一样， 可以根据它们的种属关系明确地加以区分，从此以后，各 种微生物纯培养技术获得成功。单种微生物分离和纯培养 技术的建立，是食品发酵与酿造技术发展的一个转折点。
• 18世纪后期，Ha nsen在Calsberg 酿造厂建立了酵 母纯种培养技术
发酵工程 ppt课件
科赫 (Koch)
科赫的主要贡献
➢ 发明了固体培养基并用其纯化微生物等一系列研究方法的创立。
➢ 创造了细菌染色方法。 ➢ 发现了许多病原菌，为以后研究药物和寻找治疗方法提供了依据。
证实炭疽病因 — 炭疽杆菌 发现结核病原菌—结核杆菌
spirillum (螺旋菌 )
spirochaeta 发酵工程 ppt课件 (螺旋体 )
Some particular bacteria morphology
亮发菌的形态 示丝状特殊形态
发酵工程 ppt课件
细菌分裂方式是裂殖，根据其核的分 裂方式不同分无丝分裂核有丝分裂等。
❖生存环境：温暖潮湿、富含有机物的地方，都有大量细菌活
它描述酵母作用于果汁 或麦芽浸出液时产生气泡 的现象。产生气泡的现象 是由浸出液中的糖在缺氧 条件下降解而产生的二氧 化碳所引起的。
发酵工程 ppt课件
发酵工程
发酵工程(fermentation engineering):研究发酵工业生产过程 中，各个单元操作的工艺和设备的一门科学。具体包括菌种选 育、菌体生产、代谢产物的发酵以及微生物机能的利用等。
Louis Pasteur 1822-1895
• Paster最终使科学界信服在发酵过程中酵母所遵循的规律
• 其后不久，科赫(Koch)建立了单种微生物分离和纯培养技 术，利用这些技术研究炭疽病时，发现动物的传染病是由 特定的细菌引起的。从而得知，微生物也和高等植物一样， 可以根据它们的种属关系明确地加以区分，从此以后，各 种微生物纯培养技术获得成功。单种微生物分离和纯培养 技术的建立，是食品发酵与酿造技术发展的一个转折点。
• 18世纪后期，Ha nsen在Calsberg 酿造厂建立了酵 母纯种培养技术
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科赫 (Koch)
科赫的主要贡献
➢ 发明了固体培养基并用其纯化微生物等一系列研究方法的创立。
➢ 创造了细菌染色方法。 ➢ 发现了许多病原菌，为以后研究药物和寻找治疗方法提供了依据。
证实炭疽病因 — 炭疽杆菌 发现结核病原菌—结核杆菌
spirillum (螺旋菌 )
spirochaeta 发酵工程 ppt课件 (螺旋体 )
Some particular bacteria morphology
亮发菌的形态 示丝状特殊形态
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细菌分裂方式是裂殖，根据其核的分 裂方式不同分无丝分裂核有丝分裂等。
❖生存环境：温暖潮湿、富含有机物的地方，都有大量细菌活
它描述酵母作用于果汁 或麦芽浸出液时产生气泡 的现象。产生气泡的现象 是由浸出液中的糖在缺氧 条件下降解而产生的二氧 化碳所引起的。
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发酵工程
发酵工程(fermentation engineering):研究发酵工业生产过程 中，各个单元操作的工艺和设备的一门科学。具体包括菌种选 育、菌体生产、代谢产物的发酵以及微生物机能的利用等。
《发酵工程课程设计》PPT课件
影响大肠杆菌高密度发酵的因素
• 培养基 • 溶氧浓度 • PH • 温度 • 代谢副产物
• 培养基
• 高密度发酵对基质中营养源的种类和含量比要求 较高，如碳源和氮源的比例偏小，会导致菌体生 长旺盛，造成菌体提前衰老自溶；比例偏大，那 么菌体繁殖数量少，细胞代谢不平衡，不利于产 物积累。
• 葡萄糖是高密度发酵中常用的碳源，但浓度过高， 会产生乙酸，因此要保证较低的葡萄糖浓度。
复原糖的测定
复原糖是具有羰基〔＞ C ＝ O 〕的糖，能将其他 物质复原而其本身被氧化。 (1) 复原糖在碱性条件下加热，在酒石酸钾钠存在 的情况下，可以定量地将二价铜离子复原为一价 铜离子，即产生砖红色的氧化亚铜沉淀，其本身 被氧化。具体反响如下：
(2) 氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵复原，复原 型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝 色复合物即砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与 复原糖含量〔即被复原的 Cu 2 O 量〕成正比， 用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后用做标准， 就可测得样品中复原糖含量。
• 测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数法 、平板菌落计数法、称重法、比浊法等。
• 本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与 混浊度成正比，因此，可利用光电比色计测定菌 悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测得的 光密度值〔OD 值〕与其对应的培养时间作图， 即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。现已有 直接用试管就可以测定OD 值的光电比色计,只要 接种一支试管，定期用它测定，便可做出该菌的 生长曲线。
• 本实验采取溶氧反响调节措施，具体操作如下：发酵初始 维持电机转速300rpm以便对菌体维持较小的剪切力，通 气量维持在12L/min左右。由于本实验缺少调节空气流量 的电子阀装置，对空气流量只能采取手动设置，随着菌体 的大量繁殖，溶氧浓度迅速下降，当溶氧低于20%时，手 动调节空气流量直至最大，18L/min。而后采取提高搅拌 转速方法，提高溶氧，具体操作为当溶氧低于20%时，发 酵控制器输出信号，驱动电机每次提高转速20转，直至转 速到达最高转速，1500rpm。
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4
大肠杆菌介绍
5
• 肠埃希氏菌(E. coli) 通常称为大肠杆菌，是Escheric 在1885年发现的
• 大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖 组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没 有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工 程中的运载体
• 大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。
6
发酵工程课程设计
10生物技术第二组
1
小组成员
• 候云彩2 • 李 彬2 • 张媛媛2 • 殷雅楠2 • 任二硕2 • 邵 冲2 • 许乃安2 • 邢利明2 • 魏永杰2
2
• 课题
大肠杆菌的高密度发酵
• 要求 50L发酵罐
3
大纲
• 大肠杆菌介绍 • 发酵介绍 • 高密度发酵介绍 • 实验数据及条件的确定 • 发酵流程与控制 • 发酵注意事项
• 发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的， 反应的专一性强，因而可以得到较为单—的代谢 产物
12
三种发酵操作方式介绍
• 分批发酵 • 连续发酵 • 分批补料发酵
13
分批发酵
• 分批发酵又称为分批培养，是指在一个密 闭系统内投入有限数量的营养物质后，接 入少量的微生物菌种进行培养，使微生物 生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生 长周期的微生物培养方法。
28
(2) 氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原 型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝 色复合物即砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与 还原糖含量（即被还原的 Cu 2 O 量）成正比， 用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后用做标准， 就可测得样品中还原糖含量。
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• 溶氧浓度 • 随着发酵时间的延长，菌体密度迅速增加，溶氧
浓度随之下降，细胞的生长减慢。特别是高密度 发酵的后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大 ，发酵罐各项物理参数均不能满足对氧的供给， 导致菌体生长极为缓慢，外源蛋白的表达量也较 差。 • 在发酵过程中保证适宜的溶氧浓度，必须确定发 酵罐的通气量和搅拌速度。
19
影响大肠杆菌高密度发酵的因素 • 培养基 • 溶氧浓度 • PH • 温度 • 代谢副产物
20
• 培养基 • 高密度发酵对基质中营养源的种类和含量比要求
较高，如碳源和氮源的比例偏小，会导致菌体生 长旺盛，造成菌体提前衰老自溶；比例偏大，则 菌体繁殖数量少，细胞代谢不平衡，不利于产物 积累。 • 葡萄糖是高密度发酵中常用的碳源，但浓度过高 ，会产生乙酸，因此要保证较低的葡萄糖浓度。 • 氮源、微量元素和无机盐对细菌的生长繁殖和外 源蛋白的表达也有很大影响。
16
高密度发酵介绍
17
• 高细胞密度发酵(high cell density cultivation，HCDC)是指在一定条件和培养 体系下，获得最多的细胞量，由此更多地 或更高效地获得目的产物。即利用一定的 培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使 菌体密度较普通培养有显著提高，最终提 高产物的比生产率(单位体积单位时间内产 物的产量)。
14
连续发酵
• 连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添 加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养 液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发 酵过程。 连续发酵可分为单罐连续发酵和 多罐串联连续发酵等方式。
15
分批补料发酵
• 连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添 加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养 液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发 酵过程。 连续发酵可分为单罐连续发酵和 多罐串联连续发酵等方式。
22
• PH
• 大肠杆菌利用葡萄糖产酸产气，特别是大 量的乙酸和二氧化碳，使pH降低，必须调 节pH在适宜的范围。
23
• 温度
• 培养温度在适宜的范围，对于温控诱导表 达的基因工程菌来说，诱导时机和持续时 间对于重组蛋白的产量由很大影响。
24
• 代谢副产物
• 乙酸 二氧化碳 • 葡萄糖的浓度超过某一阈值，会产生乙酸
，或者比生长速率过高，供氧不足，也会 产生乙酸。为降低培养基中代谢副产物的 积累，可采用流加补料的措施，或保持适 当的比生长速率，或在培养基中添加某些 氨基酸。
25
实验数据及条件的确定
26
首先了解几种测定方法 还原糖的测定方法 氨基酸的测定方法 大肠杆菌生长曲线测定
27Βιβλιοθήκη 还原糖的测定还原糖是具有羰基（＞ C ＝ O ）的糖，能将其他物质还 原而其本身被氧化。 (1) 还原糖在碱性条件下加热，在酒石酸钾钠存在 的情况 下，可以定量地将二价铜离子还原为一价 铜离子，即产 生砖红色的氧化亚铜沉淀，其本身 被氧化。具体反应如 下：
18
• 通常认为菌体密度超过50 g(DCW)/L即为高 密度发酵。根据Riesenbere计算，理论上 大肠杆菌发达到酵所能的最高菌体密度为 400 g(DCW/L)，考虑到实际情况中的种种 条件限制，Markel等认为最高的菌体密度 为200 g(DCW/L)，此时发酵液的25%充满 了长3μm，宽1μm的大肠杆菌，发酵液粘度 很高，几乎丧失流动性。
• 大肠杆菌在生物技术中的应用：大肠杆菌作为外 源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简 单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传 工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛， 最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系
• 在培养基培养时无需添加生长因子，向培养基中 加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有 金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在
7
• 在这里必须指出的是，处于生物安全考虑，生物 工程用的菌株是在不断筛选后被挑选出的菌株。 这些菌株由于失去的细胞壁的重要组分，所以在 自然条件下已无法生长。甚至普通的清洁剂都可 以轻易地杀灭这类菌株。这样，即便由于操作不 慎导致活菌从实验室流出，也不易导致生化危机。
8
发酵介绍
9
• 有机物被生物体氧化降解成氧化产物并释放能量的过程统称为生物氧 化.微生物生理学把生物氧化区分为呼吸和发酵，呼吸又可进一步区分 为有氧呼吸和无氧呼吸。因此，发酵是生物氧化的一种方式。
• 工业生产上笼统地把一切依靠微生物的生命活动 而实现的工业 生产均称为“发酵”
10
• 借用理工大学的发酵工程课件来对发酵设备进行 直观的认识
11
发酵的特点
• 发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物 化学反应，反应安全，要求条件也比较简单。
• 发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产 品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进 行反应。
大肠杆菌介绍
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• 肠埃希氏菌(E. coli) 通常称为大肠杆菌，是Escheric 在1885年发现的
• 大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖 组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没 有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工 程中的运载体
• 大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。
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发酵工程课程设计
10生物技术第二组
1
小组成员
• 候云彩2 • 李 彬2 • 张媛媛2 • 殷雅楠2 • 任二硕2 • 邵 冲2 • 许乃安2 • 邢利明2 • 魏永杰2
2
• 课题
大肠杆菌的高密度发酵
• 要求 50L发酵罐
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大纲
• 大肠杆菌介绍 • 发酵介绍 • 高密度发酵介绍 • 实验数据及条件的确定 • 发酵流程与控制 • 发酵注意事项
• 发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的， 反应的专一性强，因而可以得到较为单—的代谢 产物
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三种发酵操作方式介绍
• 分批发酵 • 连续发酵 • 分批补料发酵
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分批发酵
• 分批发酵又称为分批培养，是指在一个密 闭系统内投入有限数量的营养物质后，接 入少量的微生物菌种进行培养，使微生物 生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生 长周期的微生物培养方法。
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(2) 氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原 型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝 色复合物即砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与 还原糖含量（即被还原的 Cu 2 O 量）成正比， 用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后用做标准， 就可测得样品中还原糖含量。
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• 溶氧浓度 • 随着发酵时间的延长，菌体密度迅速增加，溶氧
浓度随之下降，细胞的生长减慢。特别是高密度 发酵的后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大 ，发酵罐各项物理参数均不能满足对氧的供给， 导致菌体生长极为缓慢，外源蛋白的表达量也较 差。 • 在发酵过程中保证适宜的溶氧浓度，必须确定发 酵罐的通气量和搅拌速度。
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影响大肠杆菌高密度发酵的因素 • 培养基 • 溶氧浓度 • PH • 温度 • 代谢副产物
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• 培养基 • 高密度发酵对基质中营养源的种类和含量比要求
较高，如碳源和氮源的比例偏小，会导致菌体生 长旺盛，造成菌体提前衰老自溶；比例偏大，则 菌体繁殖数量少，细胞代谢不平衡，不利于产物 积累。 • 葡萄糖是高密度发酵中常用的碳源，但浓度过高 ，会产生乙酸，因此要保证较低的葡萄糖浓度。 • 氮源、微量元素和无机盐对细菌的生长繁殖和外 源蛋白的表达也有很大影响。
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高密度发酵介绍
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• 高细胞密度发酵(high cell density cultivation，HCDC)是指在一定条件和培养 体系下，获得最多的细胞量，由此更多地 或更高效地获得目的产物。即利用一定的 培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使 菌体密度较普通培养有显著提高，最终提 高产物的比生产率(单位体积单位时间内产 物的产量)。
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连续发酵
• 连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添 加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养 液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发 酵过程。 连续发酵可分为单罐连续发酵和 多罐串联连续发酵等方式。
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分批补料发酵
• 连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添 加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养 液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发 酵过程。 连续发酵可分为单罐连续发酵和 多罐串联连续发酵等方式。
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• PH
• 大肠杆菌利用葡萄糖产酸产气，特别是大 量的乙酸和二氧化碳，使pH降低，必须调 节pH在适宜的范围。
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• 温度
• 培养温度在适宜的范围，对于温控诱导表 达的基因工程菌来说，诱导时机和持续时 间对于重组蛋白的产量由很大影响。
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• 代谢副产物
• 乙酸 二氧化碳 • 葡萄糖的浓度超过某一阈值，会产生乙酸
，或者比生长速率过高，供氧不足，也会 产生乙酸。为降低培养基中代谢副产物的 积累，可采用流加补料的措施，或保持适 当的比生长速率，或在培养基中添加某些 氨基酸。
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实验数据及条件的确定
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首先了解几种测定方法 还原糖的测定方法 氨基酸的测定方法 大肠杆菌生长曲线测定
27Βιβλιοθήκη 还原糖的测定还原糖是具有羰基（＞ C ＝ O ）的糖，能将其他物质还 原而其本身被氧化。 (1) 还原糖在碱性条件下加热，在酒石酸钾钠存在 的情况 下，可以定量地将二价铜离子还原为一价 铜离子，即产 生砖红色的氧化亚铜沉淀，其本身 被氧化。具体反应如 下：
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• 通常认为菌体密度超过50 g(DCW)/L即为高 密度发酵。根据Riesenbere计算，理论上 大肠杆菌发达到酵所能的最高菌体密度为 400 g(DCW/L)，考虑到实际情况中的种种 条件限制，Markel等认为最高的菌体密度 为200 g(DCW/L)，此时发酵液的25%充满 了长3μm，宽1μm的大肠杆菌，发酵液粘度 很高，几乎丧失流动性。
• 大肠杆菌在生物技术中的应用：大肠杆菌作为外 源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简 单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传 工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛， 最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系
• 在培养基培养时无需添加生长因子，向培养基中 加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有 金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在
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• 在这里必须指出的是，处于生物安全考虑，生物 工程用的菌株是在不断筛选后被挑选出的菌株。 这些菌株由于失去的细胞壁的重要组分，所以在 自然条件下已无法生长。甚至普通的清洁剂都可 以轻易地杀灭这类菌株。这样，即便由于操作不 慎导致活菌从实验室流出，也不易导致生化危机。
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发酵介绍
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• 有机物被生物体氧化降解成氧化产物并释放能量的过程统称为生物氧 化.微生物生理学把生物氧化区分为呼吸和发酵，呼吸又可进一步区分 为有氧呼吸和无氧呼吸。因此，发酵是生物氧化的一种方式。
• 工业生产上笼统地把一切依靠微生物的生命活动 而实现的工业 生产均称为“发酵”
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• 借用理工大学的发酵工程课件来对发酵设备进行 直观的认识
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发酵的特点
• 发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物 化学反应，反应安全，要求条件也比较简单。
• 发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产 品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进 行反应。