cDNA差示分析法

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双向电泳
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等电聚焦
等电点
SDS-聚丙烯酰胺 分子质量
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等电聚焦
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蛋白质在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳 定的线性pH梯度中电泳。蛋白质分子在偏离其等电 点的pH条件下带有电荷，因此可以在电场中移动； 当蛋白质迁移至其等电点位臵时，其净电荷数为零， 在电场中不移动，据此将蛋白质分离。
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第4步：
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反应体系中剩 余的dNTP和残留 的少量ATP在 Apyrase的作用下 发生降解。
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第5步：
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加入另一种dNTP，使第2－4步反应重复进行，根据获 得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。
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●23Leabharlann ●一、通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个 染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的 RFLP或RAPD分子标记。
二、通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶 和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的 RFLP标记。通过染色体步移技术将位于这两个标 记之间的基因片段克隆并分离出来。 三、根据基因功能互作原理鉴定目的基因。
代表性差异分析
representational difference analysis RDA
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RDA
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RDA法充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模 板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低 cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特 异扩增了目的基因片段。
分子生物学
大连大学生物工程学院 迟彦
SNP概述
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单核苷酸多态性
( single nucleotide polymorphism ,SNP) ： 基因组序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态 性。
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正常情况下，由于探针5端荧光基团和3端猝灭基团 紧邻在一起，供体所发荧光由于其光谱在空间上接 近受体染料而被猝灭，只有当两者分离时才能检测 到供体所发出的荧光。
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Taqman 技术
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该技术的基本原理是利用Taq 酶的5′核酸外切酶活性,在这 个PCR反应中除了两个传统 的PCR引物P1 、P2 外,还有 第三个引物P3 即等位特异性 Taqman探针,含有待检测的 SNP位点,特异结合在P1结合 位点的下游。P3探针的5′端 和3′端分别标有荧光基团和猝 灭基团,因P3的3′端被猝灭基 团封阻而不能以自身为引物 进行扩增。
离子化的气体中每个分子带有一个或更多的正电荷， 这些气体肽段在电场中被加速后到达检测器的时间 由肽段的质量和其所带电荷数的比值(m /z)决定。
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生物质谱的一般流程
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蛋白酶解成肽段
肽段分离 离子进入质谱，得到质谱图 用计算机软件将质谱图与蛋白数据库进行比对，从 而鉴定出蛋白。
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分子信标技术
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分子信标由称为“茎”(stem)和“环”(loop) 的两部 分构成,茎部分是由寡核苷酸探针两端互补的序列形 成的,又可称之为手臂,环则是探针的中间部分,其序 列和待扩增的目的片段互补并含有要检测的SNP 位 点。
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因此，用特定限制性核酸内切酶分离转录产物中具 有基因特异性的9-10个碱基的核苷酸序列并制成标 签。
将这些序列标签连接、克隆、测序后，根据其占总 标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。
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原位杂交技术 in situ hybridization, ISH
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FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种 重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如 果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所 用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复 性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。
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Gateway大规模克隆技术
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图位克隆
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是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测 体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进 行定位或相对定量研究的一种手段。
分为RNA原为杂交和染色体原位杂交
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RNA原位杂交
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RDA
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因为试验对象（Tester）和供试探针（Driver）在接 受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平 均长度256bp的代表群（representation），保证绝 大部分遗传信息能被扩增。 每次T减D反应中两者 物质的量比就要求达到1：100或更高，经过2-3次重 复，T群体非特异性序列几乎没有偶然逃脱的可能 性。
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蛋白质的质谱分析技术
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基质辅助激光解吸附电离-飞行质谱仪 MALDI-TOF
电喷雾质谱ESI-MS
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从2D胶中分离得到的或其他来源的蛋白质酶解成小 肽后与基质混合，将样品混合物点到金属靶表面上 并使之干燥结晶，然后用激光轰击，将呈离子化气 体的待分析物从靶表面喷射出去。
用放射性或非放射性（地高辛、生物素等）标记的 特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存 在与探针互补的mRNA 分子，两者杂交产生双链 RNA，就可通过检测放射性标记或酶促免疫反应显 色，对该基因的表达产物在细胞水平上做出定性定 量分析。
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荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH)
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单体型（Haplotype)：
位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位 点被称作单倍型。 相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体信息传递给后 代。
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SNP分类
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基因编码区SNP（cSNP）
同义cSNP 非同义cSNP 基因调控区SNP （pSNP） 基因间随机非编码区（rSNP）
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SNP检测技术
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基因芯片
Taqman 技术 分析信标 焦磷酸测序
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Taqman 技术原理
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探针设计上，利用荧光共振能量转换 （FRET）技 术，探针5和3端分别用特殊的染料标记，称为供体受体染料对或引爆-猝灭 染料对。
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