绝对定量简易操作流程
绝对定量pcr标准品
绝对定量pcr标准品绝对定量PCR标准品。
绝对定量PCR（Absolute Quantitative PCR）是一种用于测定DNA或RNA在样本中的精确数量的技术。
在绝对定量PCR实验中，标准曲线是非常重要的，它可以帮助我们将PCR测得的Ct值转化为目标DNA或RNA的绝对数量。
而标准曲线的制备离不开绝对定量PCR标准品的使用。
一、绝对定量PCR标准品的选择。
在选择绝对定量PCR标准品时，我们需要考虑标准品的稳定性、纯度和准确性。
一般来说，我们可以选择由合成DNA或RNA片段构建的标准品，也可以选择经过精确浓度测定的基因片段。
无论选择哪种标准品，都需要确保其稳定性和准确性，以保证实验结果的可靠性。
二、绝对定量PCR标准品的制备。
制备绝对定量PCR标准品需要进行一系列的稀释操作，以得到一系列已知浓度的标准品溶液。
在制备过程中，需要严格控制每一步的操作，确保标准品的稀释系列是准确的。
此外，为了避免污染，制备过程中需要使用无核酸酶的纯水和无核酸酶的试剂。
三、绝对定量PCR标准品的储存。
制备好的绝对定量PCR标准品需要进行分装和储存。
为了确保标准品的稳定性和准确性，我们需要将其分装成小份，并在-20℃或更低温度下储存。
在分装和储存过程中，需要注意避免反复冻融和长时间曝光于室温下，以免影响标准品的稳定性。
四、绝对定量PCR标准品的应用。
制备好的绝对定量PCR标准品可以用于建立标准曲线，进而用于绝对定量PCR实验中目标DNA或RNA的绝对数量测定。
在使用标准品建立标准曲线时，需要按照一定的浓度梯度进行稀释，并进行PCR扩增。
通过测定PCR扩增产物的Ct值，我们可以绘制标准曲线，并据此将待测样本的Ct值转化为目标DNA或RNA的绝对数量。
绝对定量PCR标准品在绝对定量PCR实验中起着至关重要的作用，它的选择、制备、储存和应用都需要严格控制和操作。
只有在标准品的质量可靠、稳定性好的情况下，我们才能获得准确可靠的绝对定量PCR实验结果。
绝对定量简易操作流程
绝对定量简易操作流程applied biosystems StepOne/StepOnePlus荧光定量PCR仪绝对定量实验简易操作流程绝对定量实验简易操作流程SDS 2.2StepOne/StepOnePlus定量PCR仪绝对定量实验简易操作流程绝对定量实验简易操作流程1.双击桌⾯图标，或从Start > All Programs > Applied Biosystems > StepOne Software> StepOne Software V2.2开启软件。
进⼊主界⾯后选择Advanced Setup 。
2.进⼊Setup下的Experiment Properties界⾯：2.1输⼊实验名称（Experiment Name）2.2选择仪器型号2.32.3在实验类型中，选择Quantitation-Standard Curve2.4选择试剂种类2.5选择运⾏模式3.进⼊Setup下的Plate Setup界⾯，设置基因（Target）及样本（Sample）：3.1在左边界⾯中设置基因及样本。
利⽤按钮添加新的基因，并在Target Name中编辑基因名称，Reporter和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。
对于Quencher的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的⾮荧光淬灭基团（如BHQ），请选择None。
也可以利⽤其他按钮保存（Save Target）或删除（Delete Target）已添加的基因。
利⽤按钮添加样本，在Sample name中编辑样本名称。
3.2在右边界⾯中进⾏样品板的排布。
利⽤⿏标单选或拖曳以选择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在Task选项中指定该反应孔的类型（S 代表标准曲线数据点，U代表未知样本，N代表阴性对照）。
3.3设置标准曲线：利⽤⿏标单选或拖曳以选择反应孔（⼀般情况下，每个梯度设置三个副孔），⽽后勾选左侧的基因，在Task选项中选择S，然后在Quantity中输⼊拷贝数。
定量PCR的实验流程及注意事项
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
扩增子设计
● 扩增子长度：75-200bp ● 避免二级结构 ● 利用mFold 分析二级结构
借助熔解曲线分析结果
10,000 copies of input nucleic acid
80 copies
Amplicon
Nonspecific product
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
好的引物及扩增子设计
● 提高扩增反应的效率 ● 提高反应的特异性、减少非特异性扩增 ● 提高产量和灵敏度 ● 减少多重PCR的交叉影响
准确、可重复的结果
引物设计
● 避免二级结构 ● GC含量控制在50-60% ● 连续的G或C不超过3个碱基 ● 5’末端不含G
通过引物设计提高特异性
● BLAST ● 使用SYBR Green方法时考虑到以后采用探针法 ● 进行多重PCR的可能 ● 测试多个引物对 ● 选择无引物二聚体且扩增效率最高的引物对
未知样品 标准品梯度 阳性对照 阴性对照 基因组对照
● 校准生物学误差：看家基因 ● 降低其余误差： 样品重复实验
重复
● 定量PCR中样本（包括对照及标准品）一般需要3个重复 ● 一般重复间允许的差异≤0.5Ct（理想的状态≤0.25Ct） ● 理想的重复:
¾ 准备反应体系master mix, 包括样本 ¾ 使用热启动taq酶，避免非特异产物的扩增 ¾ 分装mix时使用一个枪头 ¾ 充分旋涡震荡5秒以上
2 19-荧光定量PCR仪绝对定量实验操作pdf
绝对定量实验操作1.设计实验：a.指定未知样本，准备标准曲线，并确定重复数。
b.使用Primer Express（引物设计）软件设计引物和探针。
2.提取总RNA:3.使用High Capacity cDNA Archive Kit（大容量cDNA库试剂盒）从总RNA生成cDNA：a.准备反转录(RT)预混试剂。
b.向反应板的每个反应孔中吸取以下体积的液体，准备cDNA库反应板：50μL反转录(RT)预混试剂30μL无核酸酶水20μL RNA样本确保对于每次50μL PCR扩增反应，从总RNA转化为cDNA的质量为10至100ng，体积5μL。
c.使用为两步法或一步法反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法给出的各项参数值，设计热循环。
d.在−20°C温度下贮存cDNA，直到使用时。
4.准备PCR扩增预混试剂。
5.准备反应板：a.在反应板上作上标签，确保为每个目标序列包括一组标准样本。
标准样本必须与目标序列同在一个反应板上。
b.吸取50μL适当的PCR扩增预混试剂（含cDNA），滴入反应板的每一个反应孔中。
c.将反应板置于冰上直到准备好将其装入定量PCR仪。
6.创建绝对定量反应板文件：a.选择File>New。
b.从Assay下拉列表中，选择Absolute Quantification(StandardCurve)（绝对定量，标准曲线），然后单击Next>。
注意：不能使用相对定量(RQ)反应板文件执行绝对定量(AQ)实验分析，反之亦然。
存储在绝对定量和相对定量反应板文件中的信息不可互相交换。
c.将探针添加到反应板文件中，然后单击Next>。
d.为每个孔指定探针和任务，然后单击Finish。
7.在Well Inspector窗口（依次选择View>Well Inspector）中，输入样本名。
8.开始绝对定量(AQ)程序：a.选择Instrument选项卡。
默认情况下，显示两步法反转录-聚合酶链反应方法中PCR步骤的标准PCR条件。
219-荧光定量PCR仪绝对定量实验操作pdf
219-荧光定量PCR仪绝对定量实验操作pdf绝对定量实验操作1.设计实验：a.指定未知样本，准备标准曲线，并确定重复数。
b.使用Primer Express（引物设计）软件设计引物和探针。
2.提取总RNA:3.使用High Capacity cDNA Archive Kit（大容量cDNA库试剂盒）从总RNA生成cDNA：a.准备反转录(RT)预混试剂。
b.向反应板的每个反应孔中吸取以下体积的液体，准备cDNA库反应板：50μL反转录(RT)预混试剂30μL无核酸酶水20μL RNA样本确保对于每次50μL PCR扩增反应，从总RNA转化为cDNA的质量为10至100ng，体积5μL。
c.使用为两步法或一步法反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法给出的各项参数值，设计热循环。
d.在?20°C温度下贮存cDNA，直到使用时。
4.准备PCR扩增预混试剂。
5.准备反应板：a.在反应板上作上标签，确保为每个目标序列包括一组标准样本。
标准样本必须与目标序列同在一个反应板上。
b.吸取50μL适当的PCR扩增预混试剂（含cDNA），滴入反应板的每一个反应孔中。
c.将反应板置于冰上直到准备好将其装入定量PCR仪。
6.创建绝对定量反应板文件：a.选择File>New。
b.从Assay下拉列表中，选择Absolute Quantification(StandardCurve)（绝对定量，标准曲线），然后单击Next>。
注意：不能使用相对定量(RQ)反应板文件执行绝对定量(AQ)实验分析，反之亦然。
存储在绝对定量和相对定量反应板文件中的信息不可互相交换。
c.将探针添加到反应板文件中，然后单击Next>。
d.为每个孔指定探针和任务，然后单击Finish。
7.在Well Inspector窗口（依次选择View>Well Inspector）中，输入样本名。
8.开始绝对定量(AQ)程序：a.选择Instrument选项卡。
绝对定量
Applied Biosystems, MicroAmp, Primer Express, ROX, and VIC are registered trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US and/or certain other countries.
Authorized Thermal Cycler
This instrument, Serial No___________, is an Authorized Thermal Cycler. Its purchase price includes the up-front fee component of a license under United States Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,965,188, owned by Roche Molecular Systems, Inc., and under corresponding claims in patents outside the United States, owned by F. HoffmannLa Roche Ltd, covering the Polymerase Chain Reaction ("PCR") process to practice the PCR process for internal research and development using this instrument. The running royalty component of that license may be purchased from Applied Biosystems or obtained by purchasing Authorized Reagents. This instrument is also an Authorized Thermal Cycler for use with applications licenses available from Applied Biosystems. Its use with Authorized Reagents also provides a limited PCR license in accordance with the label rights accompanying such reagents. Purchase of this product does not itself convey to the purchaser a complete license or right to perform the PCR process. Further information on purchasing licenses to practice the PCR process may be obtained by contacting the Director of Licensing at Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404.
淋巴细胞亚群绝对计数操作流程
淋巴细胞亚群绝对计数操作流程英文回答：Lymphocyte Subset Absolute Count Protocol.Principle:Lymphocyte subset absolute count is a quantitative analysis of lymphocyte subpopulations, such as CD3+, CD4+, CD8+, and CD19+ cells, in a blood sample. This procedure is used to assess the immune system's composition and function, particularly in conditions involving immune dysregulationor infection.Materials:Blood sample.Flow cytometry analyzer.Fluorochrome-conjugated antibodies specific for lymphocyte subpopulations.Lysis buffer.Wash buffer.Absolute counting beads.Procedure:1. Sample Preparation:Collect a blood sample into a tube containing an anticoagulant.Centrifuge the blood sample at 300 x g for 10 minutes.Remove the plasma and wash the cells with PBS.Lyse the red blood cells with lysis buffer.Centrifuge the cells and resuspend them in wash buffer.2. Antibody Staining:Aliquot the cells into tubes.Add fluorochrome-conjugated antibodies specificfor each lymphocyte subpopulation.Incubate the cells at room temperature in the dark for 15-30 minutes.3. Washing:Wash the cells twice with wash buffer.Centrifuge the cells and resuspend them in wash buffer.4. Absolute Count:Add absolute counting beads to the cell suspension.Acquire a flow cytometry data file.Gate on the lymphocyte population using forwardand side scatter.Use the absolute counting beads to calculate the absolute count of each lymphocyte subpopulation.Calculation:The absolute count of each lymphocyte subpopulation is calculated using the following formula:Absolute Count = (Event Count / Number of Beads) x (Bead Concentration)。
7500Fast_操作流程
7500Fast Real Time PCR简易操作流程（供参考）
1.打开电脑，等待WinXP桌面完全显示后打开7500Fast主机电源。
2.等待7500Fast主机“Power”指示灯稳定后，打开SDS软件。
3.创建绝对定量反应板文件：
a.选择Create New Document；
b.从Assay下拉列表中选择Absolute Quantification，然后单击
Next；
c.选择（或创建）所需探针加入到反应板文件中，然后单击Next；
d.为每个反应孔指定探针和任务，为标准品赋值，然后单击Finish；
4.选择Setup选项卡，选中样品对应的反应孔，在Well Inspector窗口
中输入样品名，并检查探针和任务设置；
5.选择Instrument选项卡，设定PCR条件、反应体系；
6.选择File 〉Save as，保存反应板文件为***.sds；
7.放入样品板（管），单击Start开始反应程序（八连管、单管请使用
光学平盖），等待软件倒计时开始后再离开。
8.程序运行结束后，选择Results选项卡〉Amplification plot选项卡，
选择Auto Ct分析方法，点击Analysis 〉Analyze进行分析，选择Report选项卡查看结果。
9.选择File 〉Export，导出所需结果。
10.关机顺序：关闭SDS软件，关7500Fast主机，关电脑。
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绝对定量实验简易操作流程
1.双击桌面图标，或从Start > All Programs > Applied Biosystems > StepOne
Software> StepOne Software V2.2开启软件。
进入主界面后选择Advanced Setup 。
2.进入Setup下的Experiment Properties界面：
2.1输入实验名称（Experiment Name）
2.2选择仪器型号
2.3
2.3在实验类型中，选择Quantitation-Standard Curve
2.4选择试剂种类
2.5选择运行模式
3.进入Setup下的Plate Setup界面，设置基因（Target）及样本（Sample）：
3.1在左边界面中设置基因及样本。
利用 按钮添加新
的基因，并在Target Name中编辑基因名称，Reporter和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。
对于Quencher的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的非荧光淬灭基团（如BHQ），请选择None。
也可以利用其他按钮保存（Save Target）或删除（Delete Target）已添加的基因。
利用 按钮添加样本，在Sample name中编辑样本名称。
3.2在右边 界面中进行样品板的排布。
利用鼠标单选或拖曳以选择
反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在Task选项中指定该反应孔的类型（S 代表标准曲线数据点，U代表未知样本，N代表阴性对照）。
3.3设置标准曲线：利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔（一般情况下，每个梯度设置三
个副孔），而后勾选左侧的基因，在Task选项中选择S，然后在Quantity中输入拷
贝数。
按照相同的操作，完成标准曲线其他数据点的设置。
（建议设置5个梯度）
4. 在Setup 下的Run Method 界面中，设定反应条件。
5. 如果想使用StepOnePlus 仪器上的VeriFlex TM
Block 温度梯度功能，需要先在
界面下，勾选Enable VeriFlex TM Block 选项。
此时Block 即被
分成六个区块。
（此功能仅限StepOnePlus 机型)
然后在Run Method界面中，点击想要调整的温度步骤，
在弹出的界面中，选择并设定每个区块的温度。
两相邻区块的温度差异不能超过5度，即第一与第六区块最多可差异25度。
6.点击，将文件存储成Experiment Document Single files (*.eds) 格式，然
后在Run界面中按下 按钮，反应即开始进行。
7.实验结束后，点击界面右上角的Analyze按钮，软件将会显示实验结果：
7.1在扩增图中（见上图），可通过更改Plot Settings来改变扩增图的显示方式。
如果
想查看阈值线或基线，请将Threshold及Baseline打勾。
7.2查看标准曲线时，可通过更改Plot Settings来改变标准曲线的显示方式。
Eff%代表扩
增效率。
R2值代表标准曲线的数据点与回归曲线的接近程度，建议在0.99以上。
7.3对于SYBR Green法实验，可以在Melt Curve界面中查看熔解曲线。
7.4检查QC Summary结果，可以快速查看实验中是否有反应孔存在异常情况。
黄色三
角中的数字1代表有一种异常情况，2代表有两种异常情况，以此类推。
详细信息及解决方案可以在Flag Details中看到。
8.分析之后的结果，可以利用菜单中的File>Export功能，导出Excel格式的结果。
若想存
储图片，可直接在图片上单击鼠标右键，选择Save as，存成JPEG格式的图片。