TGFβ1诱导肺泡上皮细胞间质转化
TGF-β 信号通路详解
TGF-β信号通路概述转化生长因子β信号通路是通过转化生长因子所介导的一系列信号传递的过程。
TGF-β信号通路在细胞和组织的生长、发育、分化中起关键作用，对细胞的增殖、细胞间质产生、分化、调亡，胚胎发育，器官的形成，免疫功能，炎性反应，创伤修复等有重要的调节作用。
1. TGF-β信号通路的过程：首先，TGF-βRⅡ需要自身磷酸化其氨基酸残基中Ser213、Ser409才能被激活，其后与TGF-βRⅡ相互作用并激活TGF-βRⅡ[1]。
在与TGF-β反应之后，TGF-βRⅡ也能发生酪氨酸残基的磷酸化[2]，在不存在Ⅱ型受体的情况下，Ⅱ型受体无法独立与TGF-β结合。
被TGF-β活化的Ⅱ型受体磷酸化Ⅱ型受体的GS功能区（一个高度保守的甘氨酸及丝氨酸残基结构域），该区域在TGF-βRⅡ激酶活化中起着重要作用。
活化的Ⅱ型受体可以磷酸化其下游信号分子-受体活化的Smad2和Smad3。
Smad2和Smad3被SARA(smad-anchor for receptor activation)募集到Ⅱ型受体上。
被磷酸化的Smad2和Smad3接着与Smad4形成三聚体复合物，这一复合物可进入细胞核，在DNA结合辅助因子的帮助下与DNA上被称为Smad结合元件(Smad-binding element)的区域结合后诱导转录，从而调节细胞的增殖、分化、移行、凋亡。
完成转录之后，Smad复合物能够解离，磷酸化的R-Smads被细胞核内的磷酸酶(例如PPM1A /PP2C)脱去磷酸基，使这些R-Smads分子重新回到细胞质中，形成一个“Smad循环”[3]2.TGF-β1/Smads信号通路的影响因子：在生物体中，TGF-β信号通路受多种因素控制，如微环境条件[4] [5]、激素[6]、细胞因子和生长因子[7]、microRNAs(MiRNAs) [8]、长的非编码RNA[9]、磷酸化和去磷酸化激酶[3]，泛素连接酶和去泛素酶[10]以及其他因子。
tgfβ1诱导细胞纤维化原理
tgfβ1诱导细胞纤维化原理TGFβ1是一种可溶性的胞外基质蛋白质，它是一种调节细胞增殖、分化和存活的重要因子。
在一系列疾病的发生和发展过程中，TGFβ1因其促进细胞增殖、纤维素合成、氨基酸蛋白酶抑制和细胞外基质（ECM）的重构而扮演着重要的角色，其中包括肝纤维化、肾小球肾炎、心血管疾病和结缔组织疾病等。
TGFβ1通过与其上游的细胞膜受体结合，激活其下游信号转导途径，进而调节基因表达及细胞功能。
信号途径通过TGFβ受体I和受体II的配对作用及某些三磷酸腺苷（ATP）结合酶的介导而被激活。
TGFβ特异性结合到受体II，然后激活受体I，从而促进Smad蛋白激酶的磷酸化，并激活其他的信号通路，如蛋白激酶A、钙离子通路、线粒体和核因子κB（NF-κB）等途径。
这些途径介导了TGFβ1对细胞的增殖、转化、迁移、凋亡、细胞外基质合成和纤维化等过程的调节。
在纤维化过程中，TGFβ1诱导了细胞外基质的合成和分泌。
这些细胞外基质主要是胶原和非胶原物质，其中包括纤维连接蛋白、透明质酸、弹性蛋白、大分子基质蛋白和糖蛋白等。
TGFβ1通过诱导基因转录和促进蛋白质合成来刺激细胞外基质合成。
TGFβ1还能够抑制氨基酸蛋白酶的表达和活性，从而导致基质蛋白的蓄积和沉积。
TGFβ1还能影响细胞黏附-去黏附分子，从而影响细胞-ECM相互作用的稳定性和机械特性。
在TGFβ1诱导的纤维化过程中，细胞的表型也发生了变化。
普遍认为，这些变化包括增殖、转化、巨噬细胞-纤维细胞转化以及细胞形态的改变。
增殖和转化既可以由不同细胞系的增殖，也可以由巨噬细胞-纤维母细胞的转化来引起，这些细胞具有合成和分泌胶原、纤维素和弹性蛋白的能力。
负责信号转导的Smad蛋白，特别是Smad2/3蛋白，也参与了TGFβ诱导的细胞纤维化过程。
TGFβ1是一个在细胞增殖、分化和存活中起重要作用的因子。
在纤维化过程中，TGFβ1通过诱导基因转录、P53信号熵途径的激活以及转换生长因子β1调节亚基家族中Smad蛋白的激活等途径，调控了细胞外基质合成和细胞表型，促进纤维素、胶原和弹性蛋白等物质的沉积和积累，从而引起组织或器官的纤维化。
转化生长因子-β1(TGF-β1)与肺纤维化研究的进展
转化生长因子-β1(TGF-β1)与肺纤维化研究的进展陈刚;余民浙【摘要】转化生长因子-β1（Transformating Growth Factorbetal，TGF-β1）是一种多功能的细胞因子，是由2条分子量为11Kd有112个氨基酸构成的单链通过二硫键结合而成的分子量为25Kd的多肽。
它在细胞的生长、分化、免疫调节、调节细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）合成及损伤后的修复方面发挥着重要的作用。
在哺乳动物中。
TGF—β家族有3个亚型TGF—β1、TGF-β2、TGF—β3，它们通过与相应的受体结合而发挥生物作用。
活化的TGF—β过度表达对肺、【期刊名称】《中国疗养医学》【年(卷),期】2007(016)001【总页数】3页(P3-5)【关键词】转化生长因子-β1;TGF-β2;肺纤维化;细胞因子;免疫调节;细胞外基质;哺乳动物【作者】陈刚;余民浙【作者单位】066104,国家煤矿安全监察局尘肺病康复中心;066000,秦皇岛市海港医院【正文语种】中文【中图分类】R5转化生长因子－β1（Transformating Growth Factor beta1,TGF-β1）是一种多功能的细胞因子，是由 2条分子量为 11Kd有 112个氨基酸构成的单链通过二硫键结合而成的分子量为 25Kd的多肽。
它在细胞的生长、分化、免疫调节、调节细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）合成及损伤后的修复方面发挥着重要的作用[1，2]。
在哺乳动物中，TGF-β 家族有3个亚型TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，它们通过与相应的受体结合而发挥生物作用。
活化的 TGF-β 过度表达对肺、肝、肾等组织病理改变的影响非常显著，特别是致纤维化方面。
在体内试验中，TGF-β1对纤维化的作用明确、TGF-β2作用不明确、TGF-β3无作用；然而体外试验发现 TGF-β 的 3个亚型都有促进纤维化的作用。
TGF-β1与肺纤维化关系研究进展
TGF-β1与肺纤维化关系研究进展肺纤维化是尘肺等多种肺部疾病的转归，而尘肺是一类弥漫性间质性肺纤维化为主的全身性疾病，严重威胁着粉尘接触工人的健康，多年来，肺纤维化形成机制的研究一直受到医学科研人员的广泛关注。
多种细胞因子的作用在其发病中发挥了主要作用，TGF-β是目前研究较多的细胞因子之一。
本文对TGF-β1与肺纤维化关系的研究进展作一综述, 作为研究肺纤维化致病机制的参考。
标签：TGF-β1；尘肺；肺纤维化肺纤维化是一组气道受损、炎性因子大量分泌［1］，主要累及肺间质、肺泡的肺部疾病，可导致肺功能进行性下降，甚至呼吸衰竭，其发病机制主要由于肺部损伤修复过程中纤维原性和抗纤维原性两大类细胞因子作用失去平衡，发生肺功能受损的病变，实质上是机体对损伤的一种修复机制，细胞因子的异常表达可以作为判断粉尘作业人员接尘状况的指标，反映接尘个体肺部受损害程度的大小，预示着疾病发展的结局，在早期即可作为判断预防控制尘肺的预警信息。
关于肺纤维化发病机制的研究一直受到医学研究人员的广泛关注，目前已取得了较大进展，转化生长因子β在调控肺成纤维细胞增殖、分裂以及胶原蛋白合成与降解过程中发挥了重要作用，与肺纤维化的关系尤为重要，相关研究较多，也是国内外研究的热点。
本文就该方面研究做一综述。
1TGF-β1在肺纤维化过程中的作用TGF-β在1978年首次被鉴定出，之后发现与其功能类似的物质，统一命名为转化生长因子超家族，广泛分布于支气管上皮细胞、增生的肺泡上皮细胞（Ⅱ型）、巨噬细胞及间质细胞等，在肺纤维化过程中充当重要的刺激信号。
TGF-β是一类生物学活性十分广泛的细胞因子，可引起成纤维细胞活化，胶原合成、沉积并致纤维化。
对多数细胞的免疫调节、创伤修复、胚胎发生、细胞凋亡等方面都发挥着不同的功能。
已有較多研究表明［2］，生产性粉尘进入机体首先引起肺泡巨噬细胞损伤，发生炎症反应等波及肺泡正常结构，促进肺成纤维细胞增生、肺组织纤维化，即肺纤维化病变过程涉及多细胞、多因子参与反应并相互作用，这是肺纤维化发病的分子学基础之一，即尘肺发生发展的重要环节。
转化生长因子β诱导上皮细胞-间质细胞转分化与肺纤维化关系的研究现状与展望
㊃综述㊃D O I :10.3760/c m a .j.i s s n .1673-436X.2012.012.014基金项目:广西省自然科学基金科技厅项目(2011j jA 40001)作者单位:541001桂林医学院附属医院呼吸内科通信作者:王昌明,E m a i l :w c m@g l m c .e d u .c n转化生长因子β诱导上皮细胞-间质细胞转分化与肺纤维化关系的研究现状与展望陈娟 王昌明ʌ摘要ɔ 肺纤维化过程中,转化生长因子β(T G F -β)起着关键性的作用㊂T G F -β调节肺纤维化通过刺激㊁活化成纤维细胞高表达胶原m R N A 从而促进细胞外基质成分的合成,同时增强胶原分子转录后稳定性㊂最新研究表明,T G F -β诱导的上皮细胞-间质细胞转分化(E M T )可能是肺纤维化的关键机制㊂本文就T G F -β诱导E M T 与肺纤维化关系的研究现状与展望作一综述㊂ʌ关键词ɔ 肺纤维化;转化生长因子β;上皮细胞-间质细胞转分化;S m a dS t u d y a n d p r o s p e c t s o f t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r -βi n d u c e d e p i t h e l i a l -m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n o n p u l m o n a r y f i b r o s i s C H E NJ u a n ,WA N GC h a n g -m i n g .D e p a r t m e n t o f R e s p i r a t o r y M e d i c i n e ,A f f i l i a t e dH o s pi t a l o f G u i l i n M e d i c a lC o l l e ge ,G u i l i n 541001,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :WA N GC h a n g -m i n g ,E m a i l :w c m @g l m c .e d u .c n ʌA b s t r a c t ɔ T r a n s f o r m i n g g r o w t hf a c t o r β(T GF -β)pl a y sa n e s s e n t i a lr o l ei nt h e p r o c e s so f p u l m o n a r y f i b r o s i s .T G F -βr e g u l a t e s p u l m o n a r y f i b r o s i s b y s t i m u l a t i n g a n d a c t i v a t i n g t h e h i g h e x p r e s s i o n o f c o l l a g e n m R N A o ff i b r o b l a s t s ,t o p r o m o t et h es y n t h e s i so fe x t r ac e l l u l a r m a t r i xa n di m pr o v et h e s t a b i l i t y o ft h ec o l l a g e n m o l e c u l ea f t e rt r a n s c r i p t i o n .T h el a t e s tr e s e a r c hs u g g e s t st h a tT G F -βi n d u c e d e p i t h e l i a l -m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n (E M T )m a y b e t h ek e y m e c h a n i s m s o f p u l m o n a r y f i b r o s i s .T h i s a r t i c l e r e v i e w st h e p r e s e n tc o n d i t i o n a n d p r o s p e c t s o ft h e a s s o c i a t i o n b e t w e e n T G F -βi n d u c e d E M T a n d p u l m o n a r y f i b r o s i s .ʌK e y w o r d s ɔ P u l m o n a r y f i b r o s i s ;T r a n s f o r m i n gg r o w t h f a c t o r -β;E p i t h e l i a l -m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n ;S m a d肺纤维化是一组多种病因引起的以气道受损㊁炎症因子大量分泌㊁间充质细胞增生和细胞外基质(e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ,E C M )异常沉积为特点的渐进性疾病㊂肺泡上皮细胞紧密附着于相邻细胞或基底部,保护肺免于损伤和感染[1]㊂在致病因素的长期作用下,肺泡上皮细胞的完整性和特征被打乱并重排,引起形态学或生理学上的改变,部分上皮细胞表型发生改变,发生上皮细胞-间质细胞转分化(e p i t h e l i a l -m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n ,E MT )[2]㊂E MT 过程有多条信号通路参与,各条信号通路之间通过配体相互交联,使E MT 过程在一定程度上维持稳态㊂本文就各条通路的可能机制及他们之间的相互关联作一综述㊂1 转化生长因子β(T G F -β)/S m a d 通路与肺纤维化T G F -β是一种多效性的细胞因子,是目前肺纤维化的研究热点和重要的药物作用靶点㊂T G F -β可由淋巴细胞㊁单核细胞㊁上皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生,通过自分泌和旁分泌的方式调节细胞的增殖㊁分化㊁迁移㊁黏附,调节E C M 的代谢,参与肺胚胎发育㊁组织损伤和修复㊂最新研究表明,T G F -β诱导E MT 在肺纤维化中起关键性的作用㊂K o l o s o v a 等[3]用T G F -β1处理肺上皮细胞系(H A E )96h 后观察细胞的形态和功能的改变,发现上皮细胞-细胞间接触减少,上皮细胞延长,上皮细胞标记物E -钙黏蛋白下调,间质细胞标志物α-肌动蛋白(α-S MA )㊁纤连蛋白㊁胶原Ⅰ上调㊂D o e r n e r 等[4]发现T G F -β1诱导E MT 伴随着形态学上的改变,细胞变成了纺锤体样,胞浆内α-S MA 增多㊂同样的情况在很多研究中被证实㊂T G F -β已被证实是关键的致纤维化细胞因子,S m a d 是T G F -β的直接底物㊂Sm a d 蛋白分为3型:㊃929㊃国际呼吸杂志2012年6月第32卷第12期 I n t JR e s pi r ,J u n e 2012,V o l .32,N o .12①受体调节型,主要包括S m a d1㊁S m a d2㊁S m a d3㊁S m a d5㊁S m a d8;②共同中介型,主要包括S m a d4;③受体抑制型,主要包括S m a d6㊁S m a d7㊂S m a d蛋白将T G F-β的信号由细胞浆传到细胞核,与其他转录因子一起共同调节相应的靶基因转录[5]㊂T G F-β家族有2种类型的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体,分别为Ⅰ型受体和Ⅱ型受体,T G F-β诱导其Ⅱ型受体活化并与配体结合后磷酸化T G F-βⅠ型受体,T G F-βⅠ型受体和S m a d2或S m a d3蛋白结合并使这两个蛋白C端的S S X S(S丝氨酸)结构域上的丝氨酸磷酸化,从而使其激活,磷酸化S m a d2或S m a d3蛋白与S m a d4蛋白形成复合物后转移到细胞核进行靶基因调控㊂S m a d7能够与T G F-βⅠ类受体牢固结合,阻止S m a d2和S m a d3发生磷酸化,从而终止T G F-β的信号转导[6]㊂S m a d7还能与T G F-β受体复合物结合,在相关配体和酶的协同作用下诱导其降解㊂徐国萍等[7]在体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞中加入T G F-β后,于不同时间段收取细胞进行研究,结果认为T G F-β1能在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变,其机制与S m a d信号转导途径相关㊂李玉花等[8]用大黄素处理博莱霉素导致的肺纤维化大鼠,大黄素中㊁低剂量组大鼠T G F-β1㊁S m a d3表达减弱,S m a d7表达明显增强,表明大黄素的中㊁低剂量组能够减轻大鼠肺纤维化程度,其作用机制与调控T G F-β1的S m a d3/7信号转导蛋白表达有关㊂S m a d是E M T的重要作用因子,但是,S m a d2㊁3敲除小鼠仍然表达E MT,这一点在前列腺上皮细胞及一些癌上皮细胞得到了验证,说明有非S m a d通路存在[6]㊂K o l o s o v a等[3]也表明,T G F-β同样可以诱导非S m a d通路而调节E MT㊂2非T G F-β/S m a d通路与肺纤维化2.1 T G F-β-MA P K通路在非T G F-β/S m a d通路中,T G F-β-MA P K通路被认为是最重要的一条㊂MA P K信号转导通路是一条广泛存在于各种细胞内的信号转导途径,由一组丝/苏氨酸蛋白激酶组成,以MA P K K K-MA P K K-MA P K级联反应的方式相继磷酸化激活,将细胞外信号转导至细胞内以及细胞核中,调控细胞周期和基因表达㊂目前已知, MA P K由4个主要成员构成,即细胞外信号调节激酶(E R K1/E R K2)㊁应激活化蛋白激酶(S A O K/ J N K)㊁p38MA P K和E R K5,其中p38MA P K与肺纤维化过程密切相关㊂李飞凤等[9]用S i O2刺激H B E细胞后,E-钙黏蛋白表达水平下降,而α-S MA 和V-波形蛋白表达水平增加,部分细胞形态上呈梭形改变,呈现明显的间质细胞特性,证实E MT的发生㊂用p38MA P K特异抑制剂S B203580干预H B E 细胞后,皆不同程度减弱V-波形蛋白和α-S MA表达并增加E-钙黏蛋白表达,且呈现浓度依赖性,表明p38MA P K信号通路参与S i O2介导的H B E细胞E MT㊂MA P K参与E MT的过程可能有以下几条机制:①T G F-β诱导活化T G F-β受体复合物,级联活化p38MA P K㊂T G F-βⅠ型受体具有丝/苏氨酸和酪氨酸激酶活性,活化E R K-MA P K,T G F-βⅡ型受体磷酸化E R K-MA P K的丝/苏氨酸基团而活化E R K-MA P K,活化的p38MA P K诱导转录因子A T F-2和E L K-1调节相关基因转录,调控E MT蛋白表达[6]㊂②T G F-βⅠ型受体通过聚泛素化活化T N F受体结合蛋白6和T G F-β联合激酶1 (T A K1),同时S m a d7起衔接蛋白的作用,衔接T G F-βⅠ型受体与T A K1㊁p38MA P K㊁J N K并活化这些因子,这些因子进而可能通过活化活化蛋白1复合物,调节转录因子c-J u n和c-F o s[6],进而调节E MT过程㊂E MT是肺纤维化的关键过程㊂但是最近一些学者提出间质细胞向上皮细胞转分化(M E T)的概念,认为有些因子可以逆转E MT㊂在肾纤维化中,已经证实骨形成蛋白7可以诱导成人肾成纤维细胞M E T,促进受损肾脏的再生[10]㊂R a m o s等[11]研究表明成纤维细胞生长因子-1(FG F-1)加肝素可以抑制肿瘤生长因子-1诱导的E MT,表现为纺锤体样的间质细胞转变成圆形的㊁鹅卵石样的上皮细胞㊂伴随着这种细胞表型改变,在F G F刺激后维持上皮细胞紧密连接状态的E-钙黏蛋白有效地恢复表达,而间质细胞标志物α-S MA㊁V-波形蛋白明显下调㊂这种作用在人和大鼠的肺上皮细胞都得到了验证㊂F G F-1逆转T G F-β诱导的E MT可能通过P I3K/ A k t㊁M E K1/2-E R K㊁p38MA P K通路,在体外实验中验证得到,F G F-1调节E R K/MA P K通路,上调S m a d7,对S m a d2去磷酸化而逆转E MT成为最相关的可能机制[12]㊂2.2 R h o/R O C K信号通路 R h o家族蛋白是R a s 超家族中最早被克隆出来的蛋白,它们是一组相对分子质量约为20000~25000的三磷酸鸟苷(g u a n o s i n et r i p h o s p h a t e,G T P)结合蛋白,具有G T P酶活性,习惯被称为R h oG T P酶㊂R h o是诱导应力纤维形成㊁调控细胞骨架蛋白㊁细胞黏附及能动性的主要分子㊂R O C K属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员,是R h o目前研究最为清楚的下游靶效应分子[13]㊂R h o受多种细胞因子的调控,鸟苷酸㊃039㊃国际呼吸杂志2012年6月第32卷第12期I n t JR e s p i r,J u n e2012,V o l.32,N o.12交换蛋白或鸟苷酸交换因子(G E F)为R h o激活剂, G T P酶激活蛋白和G D P解离抑制因子(G D I)为R h o灭活剂㊂R h o与G D I结合成复合物(R h o㊃G D I),当细胞受到细胞外信号刺激时,G E F催化R h o的G D P转化成G T P而活化,活化的R h o从复合物中解离出来,转位到细胞膜,将信号传递给R O C K,使其丝氨酸/苏氨酸磷酸化激活,活化的R O C K诱导其底物肌球蛋白磷酸酶磷酸化而使之失活㊂失活的肌球蛋白磷酸酶解除对M L C脱磷酸化作用,使胞浆中M L C磷酸化水平上调㊂M L C磷酸化水平在平滑肌细胞中决定细胞的收缩功能,在非平滑肌细胞中则控制肌动蛋白微丝骨架的聚合动力学㊂众所周知,细胞的移动㊁趋化㊁黏附和收缩都是通过微丝骨架的聚合和延伸来实现的㊂R h o/ R O C K信号转导通路就是通过这样一个复杂的磷酸化/脱磷酸化级联反应来调节微丝骨架的聚合,控制细胞的多种生物学行为[14]㊂R h o通过细胞骨架蛋白的直接作用参与E MT㊂研究表明,R h o/ R O C K信号通路在T G F-β诱导的肾小管上皮细胞㊁肝星状细胞㊁肺间质成纤维细胞㊁角膜成纤维细胞等的转分化过程中发挥了重要作用,R h o/R O C K信号通路抑制剂能够抑制E MT的发生[15]㊂研究[16]证实,R h o/R O C K通路参与了T G F-β介导的上皮细胞E MT,R O C K特异性抑制剂Y-27632能够通过抑制T G F-β诱导的α-S MA㊁Ⅰ型胶原蛋白和V-波形蛋白的表达的上调,从而抑制E MT,而对E-钙黏蛋白的表达下调没有抑制作用㊂2.3核转录因子κB(N F-κB) N F-κB是调控炎症和免疫反应的主要核转录因子之一㊂在胞浆中N F-κB因与抑制蛋白(I K B s)结合而表现为无活性的形式㊂当机体受到外界刺激后,I K B s在蛋白磷酸化酶的作用下被磷酸化,磷酸化的I K B s在蛋白激酶的作用下被降解,并从N F-κB二聚体上解离, N F-κB即被激活,暴露出p50,转位到细胞核内与相应的靶基因κB序列相结合,诱导和增强E MT相关蛋白的核定位信号基因的表达[17]㊂H u b e r等[18]研究证实,在R a s转染的上皮细胞中抑制N F-κB信号可以阻止E MT的发生,而激活此通路可以在缺乏T G F-β的情况下促使细胞向间叶细胞形态的转化㊂此外,在间叶细胞中抑制N F-κB的活性可以导致E MT过程的逆转,也提示N F-κB对诱导和维持E MT是必需的㊂2.4肿瘤坏死因子α(T N F-α)研究证实,E MT 在胚胎发育㊁肿瘤侵入和组织纤维化的细胞转分化中扮演着非常重要的角色,很多的生长因子和细胞因子能够协同T G F-β调节E MT,T N F-α已经证实可以显著增强T G F-β促进E MT的作用[19]㊂在A549人腺癌上皮细胞系的研究中发现,T N F-α能促进T G F-β诱导的E MT,细胞表现为间质细胞表型㊁间质细胞标记物α-S MA㊁Ⅰ型胶原上调,上皮细胞标记物E-钙黏蛋白下调,细胞侵袭力和基质金属蛋白酶分泌增加㊂其可能机制为增强S m a d㊁MA P K㊁N F-κB信号通路对E MT的影响[19]㊂2.5整合素整合素大多为亲异性细胞黏附分子,其作用依赖于C a2+,整合素有α㊁β两个受体,接受细胞外信号传导进入细胞内,影响细胞迁移㊁增殖㊁分化㊁重塑,参与E C M调节[20]㊂M a r g a d a n t等[21]研究证实,整合素能通过S m a d和非S m a d信号通路影响T G F-β的活化,在纤维化和系统性硬化中,整合素协同T G F-β诱导成纤维细胞分化成有收缩能力的肌纤维细胞,肌纤维细胞可通过表达胶原纤维㊁表达整合素α1β1和α2β1调节胶原重塑和收缩㊁表达α-v结合素活化T G F-β潜分化三条途径调节E MT㊂M u等[6]也认为结合素促进T G F-β活化通过非S m a d信号通路是肯定的㊂2.6过氧化物酶体增生物激活受体(P P A R) P P A R是近年来发现的一种G蛋白耦联受体,研究表明P P A R作用于A549细胞或原代肺泡上皮细胞,同样发生E MT现象㊂B u c k l e y等[22]研究证实,血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂和P P A R-γ能促进Ⅰ型胶原的合成,抑制E MT㊂T a n等[23]研究证实, P P A R-γ能显著减少T G F-β诱导的Ⅰ型胶原㊁结缔组织生长因子和钙黏蛋白,对E-钙黏蛋白的下调作用也很明显㊂但P P A R通过哪些具体分子机制调节E MT还有待进一步研究㊂2.7W n t/W i n g l e s s信号通路W n t/W i n g l e s s信号通路与许多种生长因子包括T G F-β共同作用参与E MT这个过程㊂抑制G S K-3(W n t的重要组成部分)的反应,可以下调E-钙黏蛋白,下调离体培养的上皮细胞E MT,表明W n t信号通路对特发性肺纤维化的调节是正性的[24]㊂3小结肺纤维化是一个不可逆的渐进性疾病,并且是很多基础疾病的终末表现,目前缺乏有效的治疗手段和治疗药物㊂T G F-β诱导的细胞转分化(E MT)在肺纤维化的形成过程中扮演非常重要的角色, E MT的分子机制及逆转E MT的分子机制目前尚不是很明确,对上述机制进行更详细的研究可为临床上寻找新的药物作用靶点提供依据㊂㊃139㊃国际呼吸杂志2012年6月第32卷第12期I n t JR e s p i r,J u n e2012,V o l.32,N o.12参考文献[1]S e l m a n M,P a r d o A.R o l eo fe p i t h e l i a lc e l l si ni d i o p a t h i cp u l m o n a r y f i b r o s i s:f r o m i n n o c e n tt a r g e t st os e r i a lk i l l e r s.P r o cA m T h o r a cS o c,2006,3:364-372.[2] L e e J M,D e d h a r S,K a l l u r i R,e t a l.T h e e p i t h e l i a l-m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n:n e w i n s i g h t s i n s i g n a l i n g,d e v e l o p m e n t,a n dd i s e a s e.JC e l l B i o l,2006,172:973-981.[3] K o l o s o v a I,N e t h e r y D,K e r nJ A.R o l eo fS m a d2/3a n d p38MA P k i n a s e i n T G F-β1-i n d u c e d e p i t h e l i a l-m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o no f p u l m o n a r y e p i t h e l i a l c e l l s.JC e l lP h y s i o l,2011, 226:1248-1254.[4] D o e r n e r AM,Z u r a w B L.T G F-b e t a1i n d u c e d e p i t h e l i a lt om e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n(E M T)i nh u m a n b r o n c h i a l e p i t h e l i a lc e l l s i s e n h a n c ed b y I L-1be t a b u t n o t a b r o g a t e d b yc o r t i c o s t e r o id s.Re s p i rR e s,2009,10:100.[5] H e l d i nC H,M o u s t a k a sA.R o l e o f S m a d s i nT G F-βs i g n a l i n g.C e l lT i s s u eR e s,2012,347:21-36.[6] M u Y,G u d e y S K,L a n d s t röm M.N o n-S m a d s i g n a l i n gp a t h w a y s.C e l lT i s s u eR e s,2012,347:11-20.[7]徐国萍,徐璟达,李海霞,等.T G F-β1诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变.复旦学报(医学版),2007,34:223-227.[8]李玉花,许先荣,潘庆,等.大黄素对肺纤维化大鼠T G F-β1及s m a d3/7信号通路的影响.中华中医药学刊,2010,28:346-347.[9]李飞凤,周建华,胡永斌,等.p38MA P K信号通路调控二氧化硅诱导的人支气管上皮细胞上皮-间质转型.工业卫生与职业病,2011,37:69-73.[10] Z e i s b e r g M,S h a hA A,K a l l u r i R.B o n em o r p h o g e n i c p r o t e i n-7i n d u c e sm e s e n c h y m a l t oe p i t h e l i a l t r a n s i t i o n i na d u l t r e n a lf i b r o b l a s t sa n df a c i l i t a t e sr eg e n e r a t i o n o fi n j u r e d k i d n e y.JB i o lC h e 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[17]S o nG,I i m u r oY,S e k i E,e t a l.S e l e c t i v e i n a c t i v a t i o no fN F-k a p p a B i n t h e l i v e r u s i n g N F-k a p p a Bd e c o y s u p p r e s s e sC C l4-i n d u c e d l i v e r i n j u r y a n df i b r o s i s.A m JP h y s i o lG a s t r o i n t e s tL i v e rP h y s i o l,2007,293:G631-G639.[18] H u b e r MA,A z o i t e i N,B a u m a n n B,e ta l.N F-k a p p a Bi se s s e n t i a lf o r e p i t h e l i a l-m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n a n dm e t a s t a s i si nam o d e l o fb r e a s t c a n c e r p r o g r e s s i o n.JC l i nI n v e s t,2004,114:569-581.[19] B o r t h w i c kL A,G a r d n e rA,D eS o y z aA,e t a l.T r a n s f o r m i n gG r o w t h F a c t o r-β1(T G F-β1)D r i v e n E p i t h e l i a l t oM e s e n c h y m a lT r a n s i t i o n(E M T)i sA c c e n t u a t e db y T u m o u rN e c r o s i sF a c t o rα(T N Fα)v i aC r o s s t a l kB e t w e e n t h eS MA Da n dN F-κBP a t h w a y s.C a n c e rM i c r o e n v i r o n,2012,5:45-57.[20] L e g a t e K R,W i c k s t röm S A,Fäs s l e r R.G e n e t i c a n d c e l lb i o l o g ic a l a n a l y s i s o f i n t e g r i n o u t s id e-i n s i g n a l i n g.Ge n e sD e v,2009,23:397-418.[21] M a r g a d a n tC,S o n n e n b e r g A.I n t e g r i n-T G F-b e t ac r o s s t a l k i nf i b r o s i s,c a n c e r a n dw o u n dh e a l i n g.E M B O R e p,2010,11:97-105.[22] B u c k l e y S T,M e d i n a C,E h r h a r d t C.D i f f e r e n t i a ls u s c e p t i b i l i t y t o e p i t h e l i a l-m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n(E M T)o fa l v e o l a r,b r o nc h i a l a nd i n te s t i n a l e p i t h e l i a l c e l l s i nv i t r oa n dt h ee f f e c to fa n g i o t e n s i nⅡr e c e p t o r i n h i b i t i o n.C e l lT i s s u eR e s,2010,342:39-51.[23] T a n X,D a g h e r H,H u t t o n C A,e ta l.E f f e c t s o f P P A Rg a mm a l i g a n d s o n T G F-b e t a1-i n d u c e d e p i t h e l i a l-m e s e n c h y m a lt r a n s i t i o ni n a l v e o l a r e p i t h e l i a lc e l l s.R e s p i rR e s,2010,11:21.[24] P o n g r a c z J E,S t o c k l e y R A.W n t s i g n a l l i n g i n l u n gd e v e l o p m e n t a n dd i s e a s e s.R e s p i rR e s,2006,7:15.(收稿日期:2011-12-04)㊃239㊃国际呼吸杂志2012年6月第32卷第12期I n t JR e s p i r,J u n e2012,V o l.32,N o.12。
TGF-β1对AGS细胞上皮-间充质转化及体外侵袭的影响
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杨 帆 姜 蕊 韩俊 庆 王 胜昔 宋 伟
（ 山东 大 学 附 属省 立 医 院肿 瘤 研 究 治疗 中心 ，济 南 ，２ ５ ０ ０ ２ １ ） （ 摘要） 目的 观 察 转 化 生 长 因 子一 １ ３ １（ Ｔ Ｇ Ｆ 一 １ ３ １ ） 对 人 胃癌 细 胞 株 ＡＧ Ｓ发 生上 皮一 间充质转化 （ ｅ ｐ ｉ ｔ ｈ ｅ ｌ ｉ ａ ｌ — ｍｅ ｓ ｅ ｎ ｅ ｈ ｙ —
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TGF-β_1诱导肺泡上皮细胞间质转化
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解整合素-金属蛋白酶17在肺泡上皮细胞间质转化中的作用研究
解整合素-金属蛋白酶17在肺泡上皮细胞间质转化中的作用研究周玲玲;刘敬禹【摘要】目的探讨解整合素-金属蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase-17,ADAM 17）过表达和抑制在转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta 1,TGF-β1）介导的A549细胞上皮向间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）过程中的作用,以进一步揭示肺纤维化的机制。
方法将A549细胞分为空白对照组、TGF-β1组、PMA （ADAM 17激活剂）组和TNF484（ADAM 17抑制剂）组。
各组细胞培养36 h 后,应用倒置相差显微镜观察各组细胞形态,Real-time PCR和Western blotting分别检测ADAM 17、上皮及间质细胞标记物在m RNA和蛋白水平上的表达情况。
结果镜下观察发现未诱导的A549细胞呈鹅卵石形态,排列比较紧密;经TGF-β1诱导后,细胞形态伸长,出现伪足,排列较松散,细胞与细胞之间的紧密连接消失。
Real-time PCR和Western blotting检测结果均显示ADAM 17在PMA组高表达,而在TNF484组低表达,差异有统计学意义;上皮细胞标记物E-cadherin在空白对照组和TNF484组高表达,间质细胞标记物Vimentin在TGF-β1组和PMA组高表达,差异同样有统计学意义。
结论 ADAM 17的过表达有助于TGF-β1介导的A549细胞EMT进程,提示ADAM 17可作为肺纤维化的标记物之一。
【期刊名称】《解放军医学院学报》【年(卷),期】2015(036)003【总页数】4页(P272-275)【关键词】上皮细胞间质转化;解整合素-金属蛋白酶17;肺纤维化【作者】周玲玲;刘敬禹【作者单位】辽宁医学院附属第三医院呼吸科,辽宁锦州121000【正文语种】中文【中图分类】R329.28特发性肺纤维化是最常见的肺间质疾病，也是肺间质纤维化的主要原因，多数肺间质疾病病因不明，其发病机制目前也未完全阐明。
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TGF-β1诱导肺泡上皮细胞间质转化作者：黄振杰,郑金旭,莫凯天,苏石芳作者单位：广西北海市人民医院呼吸科;江苏大学附属医院呼吸科;上海市第八人民医院消化科【摘要】目的：通过观察TGF- 1诱导下A549细胞出现的细胞形态学和E-cad表达的变化，探讨上皮细胞-间质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程在肺纤维化发病机制中的作用。
方法：体外培养A549细胞，以TGF- 1进行干预，收集不同时段的细胞，应用荧光实时定量PCR(RT-PCR)检测TGF- 1干预前后E-cad的mRNA表达变化;倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化;间接免疫荧光观察E-cad蛋白表达的变化。
结果：倒置相差显微镜观察到TGF- 1干预后A549细胞由鹅卵石状变为梭形，形态如同肌纤维母细胞。
间接免疫荧光显示A549细胞的E-cad表达(红色荧光染色)随时间延长逐渐减少。
RT-PCR显示E-cad的mRNA表达下调(P 0.05)。
结论：TGF- 1在体外诱导肺泡上皮细胞向间质细胞转化,肺泡上皮细胞间质转化是肺纤维化的重要发病机制之一。
【关键词】转化生长因子1,A549细胞,上皮细胞间质转化,肺纤维化Abstract：ObjectiveBy observing the cellular morphology changes and the expression of E-cad after A549 cells were treated with transforming growth factor 1(TGF- 1)，to investigate the role of epithelial-mesenchymal transition (EMT) in the pathogenesy of pulmonary fibrosis.MethodA549 cells cultured in vitro were treated by TGF- 1,then harvested at different time points to assay mRNA expression of E-cad by real-time PCR (RT-PCR) before and after A549 cells being treated by TGF- 1.Cellular morphology changes were observed by phase-contrast microscope.Protein expression of E-cad by indirect immunofluorescence.ResultsAfter being treated by TGF- 1，A549 cells were observed by inverted phase contrast microscope to turn from pebble shape to fusiform shape，a myofibroblast-like morphology.Indirect immunofluorescence showed protein expression of E-cad reduced as time went by(red stain).The mRNA expression of E-cad was down -regulated in RT-PCR(P 0.05).ConclusionTGF- 1 induced EMT of alveolar epithelial cells in vitro suggests that EMT of alveolar epithelial cells might be one of fundamental mechanisms of pulmonary fibrosis.Key Words:Transforming growth factor A549 cells;Epithelial- mesenchymal transition;Pulmonary fibrosis特发性肺纤维化(IPF) 是最常见的肺间质疾病,也是肺间质纤维化的主要原因。
多数肺间质疾病病因不明,其发病机制目前也未完全阐明。
传统观点认为各种损伤因素损伤肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞，炎症细胞浸润，细胞因子失衡，肺实质损伤后继发肺间质细胞增殖过度修复导致纤维化。
国外有文献报道IPF是一种涉及异常创伤愈合的功能紊乱，进行性的上皮损伤和(或)激活可能处于纤维形成和间质细胞增殖的核心位置，这种作用是不依赖于炎症的[1-2]。
肺泡上皮细胞(AECs)不仅仅是作为发病的促动因素，它们本身就可以通过一个叫做上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的过程获得间质细胞表型而作为成纤维细胞和肌纤维母细胞的重要来源。
在这个新的模式中，肺泡上皮应该被看作纤维化的关键环节之一，它作为一个多能的干细胞具有相当的可塑性，能参与到交替的途径中：上皮再生修复正常的肺泡结构，凋亡，或者通过EMT形成纤维化。
本研究通过用TGF- 1诱导A549从肺泡上皮细胞向间质细胞转化，进一步探讨肺泡上皮细胞在肺纤维化发病中的作用,为阐明肺纤维化发病的分子生物学机制及寻求新的治疗方法提供依据。
1 材料与方法1.1 主要试剂及物品：A549细胞株(中国典型培养物保藏中心)，TGF- 1(PeproTech公司)，E-cad 鼠抗人一抗(Santa Cruz公司),兔抗鼠Fitc标志的IgG(Boster公司)，胎牛血清(Hyclone 公司)，低糖DMEM培养基(GIBCO公司)。
MMLV逆转录酶(美国Promega公司)，实时定量试剂盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invit rogen 公司)。
1.2 主要仪器：超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，二氧化碳培养箱(Forma)，倒置相差显微镜(OL YMPUS)，高速台式离心机(上海飞鸽牌)，Mx-3000P实时定量PCR仪(STRATAGENE公司)，凝胶成像与分析系统YNGENE (GENE)，电泳仪Jim-X(Bio-Rad)，荧光显微镜(Leica)，荧光倒置相差显微镜(Nikon)。
1.3 细胞培养：A549细胞用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，常规培养于5%的CO2,37℃人工培养箱中，细胞呈贴壁生长。
1.4 倒置相差显微镜观察细胞形态：当细胞生长融合至70%～80%，用无血清培养基饥饿24 h,换新鲜培养液,随机把细胞分组，于培养液中加入TGF- 1至终浓度5 ng/ml。
倒置相差显微镜观察A549细胞在TGF- 1刺激0、24、48 h的形态变化。
1.5 间接免疫荧光：以每孔1 104个细胞接种于24孔培养板中预置的载破片上，细胞贴壁爬片后，用无血清培养基饥饿24 h后，加入TGF- 1至终浓度5 ng/ml。
分别于0、24、48 h 后，取出载玻片，用4%多聚甲醛固定60 min。
5%的BSA封闭，37℃60 min。
加一抗E-Cadherin单克隆抗体(1∶50)，4℃过夜。
加相应二抗，缓冲甘油封片。
荧光显微镜下观察，并拍照。
1.6 总RNA抽提及逆转录反应：当细胞生长融合至70%～80%，用无血清培养基饥饿24 h,换新鲜培养液,在无血清培养基中加入TGF- 1至终浓度5 ng/ml。
分别于0 、1 、3 、6 、12和24 h从六孔板中离心收集细胞,加入1 ml TRIzol Reagent,按其说明书操作步骤提取总RNA,电泳证实,具有清晰18S和28S条带的RNA用于逆转录实验,取1 gRNA经MMLV逆转录酶逆转录成cDNA。
具体操作按试剂盒说明书进行。
cDNA产物于-20℃保存。
1.7 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应( Real-time PCR)检测上皮细胞标志物E-cad的mRNA表达：RT-PCR检测上皮细胞标志物E-cad，APDH作内参。
引物(Sequence 5 3 )：E-cad Sense-TTCTGGAAGGAA TGGAGGAGT C-ntisense- ACCTGGAA TTGGGCAAA TGTG-(147 bp);GAPDH Sense-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-Antisense-AGCCAATTCG TTGTCATAC-(115 bp)，引物由上海生工公司合成。
加样体系按试剂盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG说明书操作。
实时定量PCR 反应条件：95℃5 min 1个循环，95℃20 s,62℃30 s,72℃30 s，40个循环。
由随机附带软件计算出Ct值和拷贝数。
1.8 统计学处理：各实验均重复3次，计量资料以均数标准差(x s)表示，应用SPSS 16.0软件处理，多组均数间采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验,P 0.05被认为是差异有统计学意义。
2 结果2.1 细胞形态学观察：与不加TGF- 1 组相比，加入TGF- 1 后，A549细胞由鹅卵石状上皮形态变成梭形、纺锤形，而且其细胞间隙略变大,细胞和细胞之间的连接变得松散。
2.2 间接免疫荧光：荧光显微镜下观察，正常的A549 细胞为鹅卵石状，细胞表达E-Cad 蛋白，胞膜可见耀眼的红色荧光染色，在外源性TGF- 1 刺激下，随时间延长细胞外形逐渐伸长，并与周围细胞分离，E-Cad 蛋白表达明显减少。
2.3 荧光实时定量PCR检测TGF- 1对A549细胞E-cad的mRNA 表达的影响：与不加TGF- 1 组相比，A549 细胞在加入TGF- 1 后其上皮细胞标志物E-cad的mRNA 表达在24小时内总体呈现下调趋势，在第24 h时间点上最明显(P 0.01)，在第3 h时间点上出现一个短暂反弹(P 0.05)。
3 讨论EMT是一种完全分化的上皮细胞经历细胞表型改变转化成完全分化的间质细胞的过程，通常转化成成纤维细胞和肌纤维母细胞[3]。
EMT过程很久以来一直被认为在胚胎发育和恶性肿瘤的细胞转分化中起主导作用。
外胚层在早期形成原间质的发育中经历了EMT过程。
次级上皮通过间质细胞-上皮转化产生。
这些次级上皮然后分化形成完全成熟的上皮，或者经历第二轮EMT形成各种各样的间质细胞和结缔组织细胞，例如脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌细胞和成纤维细胞[4]。
近年来发现EMT可以发生于多种生理、病理过程，不仅在胚胎发育、肿瘤转移级联反应的早期阶段起重要作用，还促进伤口愈合和多种器官的纤维化。