pcr实验原理及注意事项

PCR疑难解答

当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：

将PCR反应的试管与反应板紧贴。

当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在的PCR管中不能均匀传热。

不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。

对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。

没有扩增产物：

在提供MgCl2缓冲液中，以L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。

泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR 反应中可能缺少游离的Mg2+。

检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。

检查模板和引物的用量。

增加循环次数和/或模板DNA的用量。

泳道中出现模糊条带：

减少循环次数或模板DNA的用量。

提高退火温度，但不要超过68℃。

重新设计引物或设计更长的引物。

其他值得注意的条件：

建议使用薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。

最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。

大多数反应中，（~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。

建议使用L MgCl2∶350mmol/L dNTP或L MgCl2∶500mmol/L dNTP组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。

基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。

要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。

降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

变性：第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。

延伸：68--72℃下进行延伸操作。

循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。

长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。

测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。

在无菌的或离心管中按下列操作程序加样：

反应物加样顺序体积(μl) 终浓度

去离子水 1

10×Buffer B 2 5 1×

10×PCR Buffer成分：

Tris-HCl 100 mM

KCl500 mM

MgCl15 mM

4×dNTP混合物 3 5 各200μmol/L

MgCl2 4 3 L

有义引物5 μmol/L

反义引物6 μmol/L

模板7 2 μg

TaqDNA聚合酶 8 1unit

2. 用微量可调加样器和一次性Tip向每一管中加50μl矿物油。每加一管换一次Tip。

3. 振荡每只管，然后短暂离心。

4. 将管放到预热的热循环中，按下列程序开始循环：

预变性 94℃ 4分钟 1次

变性 94℃ 1分钟

退火 37-65℃ 1分钟

延伸 72℃ 1分钟

循环30次

终延伸 72℃ 7分钟 1次

保存 4℃

讨论

1.假阴性，不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有Taq酶抑制剂，②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。③模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

2.假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。