第五章 蛋白质二

解： 由Ⅱ Ⅲ得： Asp-（…..)-Val 由Ⅰ Ⅳ得: Asp-( Glu, Ala, Tyr)- Lys-His-Glu-Val 由Ⅴ得: Asp- Ala-Tyr 所以,该A肽的顺序为:Asp-Ala-Tyr-Glu- Lys-HisGlu-Val

练习题2 有一小肽A，Ⅰ用酸水解后分析氨基酸组成为 Lys，His，Asp，2Glu，Ala，Val，Tyr, 2(NH3)；Ⅱ A肽与DNFB试剂反应后得到 DNP- Asp； Ⅲ 当用羧肽酶处理后得游离Val ； Ⅳ 将A肽用胰蛋白酶降解得2种肽，其一氨基 酸组成为（ Lys，Asp，Glu，Ala，Tyr）pH 为6.4时净电荷为零，另一种氨基酸组成为 （ His，Glu，Val）可给出 DNP- His , pH为 6.4时带正电荷；Ⅴ 糜蛋白酶降解得2种肽 （ Asp，Ala，Tyr ） pH为6.4时净电荷为零， （Lys，His，2Glu，Val ） pH为6.4时带正电2
O NH CH C R3
O NH CH C R4
O NH CH C
嗜 热 菌 蛋 白 酶
水解位点

肽链
(Thermolysin)：R2=Phe,Trp,Tyr;Leu， Ile,Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速 度较快。
O NH CH C
O NH CH C R2 R3
R O R n -1O Rn O H2N CH C N- 端 氨 基 酸
+
HN CH C HN CH C OH C -端 氨 基 酸 O Rn O
H H2N CH C NHNH2 +H2N CH C OH NH2NH2 C -端 氨 基 酸 氨基酸酰肼
R
氨肽酶法
末 端 基 氨 基 酸 测 定 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链 的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出 的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基 酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋 白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以 亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最快。

二硫键位置的确定
对角线电泳
练习题 有一小肽A，Ⅰ用酸水解后分析氨基酸组成为 Lys，His，Asp，2Glu，Ala，Val，Tyr；Ⅱ A肽与DNFB试剂反应后得到DNP- Asp； Ⅲ 当用羧肽酶处理后得游离Val ；Ⅳ 将A肽用胰 蛋白酶降解得2种肽，其一氨基酸组成为 （ Lys，Asp，Glu，Ala，Tyr），另一种氨 基酸组成为（ His，Glu，Val）可给出 DNPHis ；Ⅴ 糜蛋白酶降解得2种肽（ Asp，Ala， Tyr ）， （Lys，His，2Glu，Val ），问该A 肽的氨基酸顺序如何？
第五章 蛋白质
蛋白质存在于所有的 生物细胞中，是构成 生物体最基本的结构 物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的 物质基础，它参与了 几乎所有的生命活动 过程。
讲授提纲
蛋白质的结构(重点与难点） 蛋白质结构与功能的关系（重
点与难点）
第五节 蛋白质的结构
一、蛋白质的一级结构
（一）一级结构的含义
4、测定步骤
(1) 多肽链的拆分 蛋 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须 白 先进行拆分。 质

一 级 结 构 的 测 定
4、测定步骤
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
(1) 多肽链的拆分 几条多肽链借助非共价键连接在一起， 称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚 体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿 素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽 链(亚基);如果多肽链是通过二硫键共 价交联的,如胰岛素(两条多肽链),可通 过?
R O2N F NO2 DNFB H
+ + H2N
O O2N HN NO2 DNP 衍生物 O OH + 氨基酸
R
O
CH C
CH C
N- 端氨基酸 R HN NO2 DNP- 氨基酸
H2O
O2N
CH C
丹磺酰氯法

在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯） 可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺 末 酰-氨基酸。 端 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质， 基 检测灵敏度可以达到110-9mol。
蛋白质的一级结构包括 组成蛋白质的多肽链数 目； 多肽链的氨基酸顺序； 以及多肽链内或链间二 硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链 的氨基酸顺序，它是蛋 白质生物功能的基础。

牛胰岛素的一级结构
（二）蛋白质一级结构的测定
蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白
质化学研究的基础。自从1953年 Sanger测定了胰岛素的一级结构 以来，现在已经有上千种不同蛋 白质的一级结构被测定。
-
OOC CHCH2 S CH2 NH3
+
-SH
O ICH2CNH2
OOC CHCH2 SCH2CNH2 NH3+ O
应用烷基化试剂保护巯基

蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
(4)分析 每条多肽 链的氨基 酸组成
4、测定步骤

(5)分析多肽链的N-末端和C-末端。
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
1、蛋白质一级结构测定方法
直接进行氨基酸定序（桑格） V
F
由cDNA序列反推氨基酸序列。
V L H E S G A L Y L V C G T E K R P G T Y F F
N Q H L C
2、测定蛋白质一级结构的要求
样品必需纯（>97%以上）； 知道蛋白质的分子量；
知道蛋白质由几个亚基组成；
多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基 酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 末 端 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是 基 N-端氨基酸分析法。 氨 基 酸 测 定

二硝基氟苯（DNFB）法

末 端 基 氨 基 酸 测 定

Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽 链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物 （DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能 够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法 进行鉴定。
+
R
O + Br C
+
Br N
-
NH CH C
C
N R O CH2 CH2 O NH CH C O
+
CH2 CH2 O NH CH C H2O CH3 S C NH NH CH C
CH2 N CH2 O CH C R
R
+
O
NH CH C O
H3N
+
CH C
高丝氨酸内酯
4、测定步骤
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
O NH CH C R4
O NH CH C
羧 肽 酶 和 氨 肽 酶
R1
水解位点

肽链
分别从肽链羧基 端和氨基端水解

化学法：(Cyanogen bromide)
多 肽 链 的 选 择 性 降 解

溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸 的羧基所形成的肽键。
CH3 S： CH2 CH2 O NH CH C CH3 S
氨 基 酸 测 定
N(CH3)2 R + SO2Cl 丹磺酰氯 水解 O H2N CH C 多肽 N- 端 N(CH3)2
N(CH3)2
R 丹磺酰 N- 端氨基酸 + R O 氨基酸
O
SO2 HN CH C
SO2
HN CH C OH
丹磺酰氨基酸
肼解法

末 端 基 氨 基 酸 测 定
此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在 无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离 出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能 够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨 基酸分离。
测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子
量计算每种氨基酸的个数。 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。
3、蛋白质测序的策略
P168
（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目； （2）拆分蛋白质分子中的多肽链； （3）断裂链内二硫键； （4）分析多肽链的N末端和C末端； （5）测定多肽链的氨基酸组成； （6）多肽链部分裂解成肽段； （7）测定各个肽段的氨基酸顺序； （8）确定肽段在多肽链中的顺序； （9）确定多肽链中二硫键的位置。
H H N R1
O NH CH C
O CH C R2H
O NH CH C
N C S
O CH C R2
HN CH C R1
NH C O NH2 CH R1
蛋 白 (8)确定肽段在多肽链中的次序 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼 质 一 此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的 级 氨基酸顺序。 结 构 的 测 定

4、测定步骤
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
(2) 测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋 白质分子量之间的关系，即可确定多肽 链的数目。

4、测定步骤
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
(3) 二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可 在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下， 用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还 原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成 的巯基，以防止它重新被氧化。

4、测定步骤

蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
(6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两 种或多种不同的断裂方法将多肽样品断 裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其 分离开来。

酶解法:
多 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白 肽 链 酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和 的 选 氨肽酶。 择 性 降 解