限制性内切酶酶切反应的标准操作规程
实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析
实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析实验目的：通过限制性内切酶酶切分析，了解DNA的结构和特性，掌握限制性内切酶的使用方法，以及掌握DNAGel电泳技术。
实验原理：限制性内切酶是一类可切割DNA分子的酶，可特异性地识别DNA的特定核苷酸序列并切割它们。
限制性内切酶可以将DNA切割成特定大小的DNA片段，这些片段可以进一步用于基因克隆、DNA指纹分析、DNA测序、DNA杂交等。
将DNA和内切酶一起反应一段时间后，可以通过电泳将酶切后的DNA片段按大小分离，从而得出不同DNA序列的长度和特征，达到对DNA结构特点进行研究的目的。
实验步骤：1. 从实验室提供的细菌菌株中提取DNA样品。
2. 将DNA样品用水稀释到适当浓度。
3. 按照所选内切酶的说明书，将相应量的酶加入DNA样品中。
混匀并放在37℃的水浴中进行反应1-2小时。
4. 制备1%的琼脂糖凝胶。
5. 将酶切后的DNA和DNA加载缓冲液混合后，放入琼脂糖凝胶槽中。
6. 进行DNAGel电泳，根据DNA片段的大小，将DNA分离开。
7. 取出凝胶进行染色，直接观察或用紫外线透射方式扫描成像。
实验注意事项：1. 在实验室中需要严格遵守生物安全措施，避免污染。
2. 在进行内切酶酶切反应时，需要严格按照酶的使用方法进行操作，以保证反应质量和结果准确。
3. 在制备DNA样品时需要避免DNA的降解或氧化。
4. 在进行DNAGel电泳时需小心操作，以避免凝胶破损或电流过强，影响实验结果。
实验结果分析：通过限制性内切酶酶切分析后，可以得到DNA片段的长度和特征，从中了解到DNA的特性和结构。
实验结果需要根据实验方法、酶的选择等进行分析和总结，以便进一步推进科研工作。
酶切操作技巧
酶切操作技巧实验材料实验耗材：枪头（10μl、200μl）、EP管(200μl)试剂：限制性内切酶及buffer、ddH2O准备工作：冰，37˚C水浴、质粒或PCR产物实验操作步骤：酶切反应体系成分体积（µL）质粒或PCR产物<1µgBuffer2限制性内切酶1 1限制性内切酶2 1ddH2O Up to 2037˚C水浴2h。
注意事项：1. 尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的buffer，以及各酶在公用buffer里的效率。
2. 双酶切时间及其体系：一般酶切2个小时，酶切效率低的可适当延长时间，酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul 体系中酶解1ug DNA。
3. 两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。
4. 双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表，如果有一种buffer 能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和；任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul。
如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同则必须分别做酶切。
第1种酶切后要考虑用酚抽、电泳后胶回收或加热等方法使酶失活后再进行下一次酶切反应。
厂家目录一般都会有相应的附录以供查阅各种酶的反应温度。
有的酶可以用加热使之失活，如CIAP；有的则不行。
5. 酶量的问题：不同公司的酶活力单位不同，按说明书的酶切体系添加酶量，按反应条件进行酶切反应。
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验原理及步骤、注意事项
实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。
许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。
例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。
5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。
限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。
根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。
根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。
小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。
在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。
在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。
二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。
2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。
DNA限制性内切酶酶切反应
一、核酸限制性内切酶
• II型酶就是通常基因工程中使用的DNA限制性内 切酶。II型酶限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶 组成。II型限制酶需要Mg2+作为催化反应辅助因 子，能识别双链DNA的特定序列，一般为4-6个碱 基的反转重复序列。II型限制酶一般在识别序列内 进行切割，产生特异的DNA片断。
切割下来，装入1.5ml微量离心管中。 ⑦ 置-20℃保存。
• 本周实验报告： 1. 实验原理 2. 实验步骤 3. 实验结果 4. 实验结果分析 • 下周请预习：离心吸附柱法从琼脂糖凝胶
中回收DNA
0.5μl
④ Xho I (10Units/μl)
0.5μl
2. 混匀试剂。将离心管置37℃水浴，反应1小 时。
三、实验步骤
3. 琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段
① 制备1%琼脂糖凝胶。 ② 在每个酶切反应管中加入1/10体积10X上样缓
冲液，混匀。 ③ 将样品平均加入2个加样孔内，每个孔加样
27.5μl。 ④ 135V衡压电泳30-40分钟。 ⑤ 在紫外灯下观察酶切条带。 ⑥ 将酶切完全的质粒大片断、PCR产物从凝胶中
二、限制性内切酶酶切反应
2. 酶切温度及时间：根据产品说明确定最佳反应 温度。反应时间不宜太长，以免内切酶产生星 活性。
– 星活性（Star Activity）：是指限制性内切酶在某 些反应条件产生的识别并切割非特异序列位点的现 象。其结果是酶切条带增多。
– 星活性除了与酶本身的性质有关外，与酶过量、甘 油浓度过高，pH值不合适、离子浓度过低、酶切 时间过长等有关。酶切时间比增加酶量更易产生星 活性。
DNA限制性内切酶酶切分析
DNA限制性内切酶酶切分析一、原理限制性内切酶和基因载体是DNA重组技术中的两个极其重要的方面。
限制性内切酶是首先在大肠杆菌中发现的能够分解外来DNA的核酸酶。
与核酸外切酶相比，该酶可从DNA双链内部特异的核苷酸序列处将DNA双链切断，产生带有粘性或平头末端的DNA片段。
把要克隆的外来DNA和载体DNA用同一种限制性内切酶切割，即可产生带有相同粘性末端的DNA片段。
如果同时用两种不同的酶切割，则可产生带不同粘性末端的片段，通过电泳分离出所需要的目的基因片段。
把目的基因与切开的载体DN A混合，再经过DNA连接酶处理，转化和筛选即可得到希望的重组子。
进行DNA酶切时，根据具体情况可用单酶切或双酶切。
特定的酶有其配套的缓冲液。
进行双酶切时，应选用两种酶都适合的缓冲液；如果两种酶要求的温度不同时，先在较低温度下酶切，然后在较高的温度下酶切。
二、目的了解限制性内切酶的特性和DNA分子的结构，掌握DNA限制性内切酶酶切的图谱的分析方法。
三、材料、试剂与器具1、DNA样品。
2、限制性内切酶。
3、10×限制性内切酶反应缓冲液。
4、无菌双蒸水。
5、0.5M EDTA (pH 8.0)溶液。
6、10×TBE buffer。
7、琼脂糖。
8、溴化乙锭溶液。
9、上样缓冲液（40%蔗糖，0.25%溴酚兰）。
10、微量离心管、微量加样器、水浴锅、台式高速离心机、电泳仪、水平电泳槽。
11、10mg/ml Rnase。
四、操作步骤1、将在－20℃保存的DNA样品和10×限制性内切酶反应缓冲液取出，放在冰浴上融化待用。
2、取一干净无菌的微量离心管,按顺序加入以下组分：DNA样品 0.1-2mg10×内切酶反应缓冲液 1ml内切酶1 1ml内切酶2 1ml加无菌水至 10ml3、离心1秒钟，使管壁上的溶液集中到管底。
用手指轻弹管底部位使之混合，再离心一次，使管壁上的溶液集中到一起。
4、在37℃温育60－120分钟。
实验三 限制性内切酶酶切反应
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 16º C
GA A T T C CTTAA G A GATCT TCTAGA
重组体
三、实验操作流程
37℃
四、操作过程
酶切体系建立
ddH2O DNA 10×buffer 内切酶 总体积 10ul 7ul 2ul 1ul 20ul
酶切 （37℃）
电泳检测
ddH2O DNA 10×bufferM HindⅢ 总体积
10ul 7ul 2ul 1ul 20ul
ddH2O DNA 10×bufferH EcoRⅠ 总体积
10ul 7ul 2ul 1ul 20ul
实验结果与分析
载体与目的DNA片段的双酶切及连接
Xba1切割位点
GAATTC CTTAAG
BamH1切割位点
AGATCT TCTAGA
GA A T T C CTTAA G A GATCT TCTAGA
Xba1+BamH1双酶切
AATTC G A TCTAG
Xba1+BamH1
AATTC G GATCT A
双酶切
实验三 限制性内切酶酶切反应
一、实验目的
了解常用限制性内切酶的特性； 掌握酶的使用方法。
Hale Waihona Puke 二、实验原理
限制性内切酶与连接酶的配合使用为重组 DNA技术奠定了酶学基础。 限制性内切酶是基因工程中用于体外剪切 基因片段的重要工具酶，这类酶的特点是具有 能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的 能力，并能在这个特异性核苷酸序列内，切割 能产生平端或粘性末端，切口处有固定的序列， 所以可方便的连接到载体的特定的位点处并可 以方便地切下，进行DNA片段的改造工作。
实验六-酶切
三、酶切效率影响因素
DNA纯度 缓冲液 温度条件 限制性内切酶本身 大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响
四、使用限制酶注意事项
当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进 一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸 管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各 自的最适盐浓度。
3．DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力； ②存在第二种限制性内切酶污染；③样品DNA中含有其它 DNA。
2000bp
1000bp 750bp
不完全酶切
2000bp
1000bp 750bp 500bp
完全酶切
Marker-PUM
2686bp 2050bp 1507bp 1119bp 878bp 500bp
二、限制性内切酶类型
第一类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附 近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的 核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
第二类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内 的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别 和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸 顺序的DNA片段。
酶切反应体系(50μl)
模板DNA：5μl 限制性内切酶10×Buffer：10μl (2×) 酶：各0.5 μl 去离子水：34 μl
双酶切
同步双酶切 分步酶切
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶 切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要 求，然后加入第二种酶完成双酶切反应
1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失 活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限 制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不 存在该酶的识别顺序。
DNA的限制性内切酶酶切
DNA的限制性内切酶酶切实验目的1.掌握DNA限制性内切酶酶切的原理与实验方法。
2.了解限制性内切酶的特点。
实验原理限制性内切酶是基因工程中剪切DNA分子常用的工具酶，它能识别双链DNA分子内部的特异序列并裂解磷酸二酯键。
根据限制性内切酶的组成、所需因子及裂解DNA的方式不同可分为三类，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。
重组DNA技术中所说的限制性内切酶通常指Ⅱ型酶。
绝大多数Ⅱ型酶识别长度为4～6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列5′-G↓AATTC-3′），有少数酶识别更长的序列或简并序列。
实验器材移液器、移液器吸头、1.5ml离心管、离心管架、水浴锅、离心机、制冰机、漂浮板等。
实验试剂（1）DNA样品：质粒pUC19和基因3055。
（2）限制性内切酶、BamH I和EcoR I。
（3）通用型DNA纯化回收试剂盒（试剂盒组成见本篇“实验四DNA片段的纯化与回收”）。
实验操作（1）取2支离心管，在冰上按以下顺序分别配制酶切反应体系（50μl）：质粒pUC19/基因3055 43μl限制性内切酶5μlBamH I 1μlEcoR I 1μl（2）加完反应体系后，用手指弹管壁混匀，短暂离心，使反应液甩入离心管底部。
（3）将离心管插入漂浮板上，放置于水浴锅中，37℃水浴15min，然后80℃加热20min终止反应。
（4）使用通用型DNA纯化回收试剂盒回收酶切产物。
注意事项（1）注意要在冰上操作。
（2）加入限制性内切酶时，移液器吸头应贴着离心管壁沿着液面加入。
实验意义限制性内切酶是重组DNA技术中常用的工具酶，在体外构建重组载体时，用于特异性切割载体及目的基因。
思考题如何根据载体和目的基因选取合适的限制性内切酶？。
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限制性内切酶酶切反应的标准操作规程（编号：007）
1、目的及适用范围
利用限制性内切酶在特异性的识别位点上或附近切割双链DNA分子，用于特定基因的克隆等分子生物学研究。
2、主要试剂及仪器
微量移液器、恒温水浴锅、限制性内切酶 EcoR I, BamH I 等、通用缓冲液10× Buffer
3、操作步骤
按顺序加入下列反应物，放入37℃水浴锅内反应2h。
反应物体积（μL）
灭菌水3
DNA40
10× Buffer K 5
EcoR I1
BamH I1
总体积50
4、问题向导
4.1 建立一个标准的酶切反应：目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。
通常，一个50μL的反应体系中，1μL的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1h即可降解1μg已纯化好的DNA。
如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16h）也可完全反应。
4.2 选择正确的酶：选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。
识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。
假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。
内切酶的产物可以是粘端的（3\'或5\'突出端），也可以是平端的片段。
粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。
4.3 内切酶：内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。
酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。
酶的用量视在底物上的切割频率而定。
例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。
21。