干细胞冻存液-天津灏洋
干细胞冻存液及干细胞冻存和复苏方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910598997.8(22)申请日 2019.07.04(71)申请人 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司地址 710024 陕西省西安市灞桥区西安现代纺织产业园区标准厂房小区B1栋4楼402室(72)发明人 程蕊苹 (51)Int.Cl.A01N 1/02(2006.01)C12N 5/0775(2010.01)(54)发明名称干细胞冻存液及干细胞冻存和复苏方法(57)摘要本发明提供了一种可用于临床的干细胞冻存液及干细胞冻存和复苏方法，通过本发明的技术方案，可以为临床提供质量稳定，标准明确的干细胞冻存液。
权利要求书1页 说明书4页 附图8页CN 112167241 A 2021.01.05C N 112167241A1.干细胞冻存液，其特征在于，包含以下组分:人血白蛋白注射液、低分子肝素钙、复方氨基酸注射液、复方电解质注射液、右旋糖苷-葡萄糖注射液和抗氧化剂。
2.根据权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，所述人血白蛋白注射液的体积份数为10-30。
3.根据权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，所述复方氨基酸注射液的体积份数为10-30。
4.根据权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，所述复方电解质注射液的体积份数为20-50。
5.根据权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，所述右旋糖苷-葡萄糖注射液的体积份数为20-50。
6.根据权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，所述低分子肝素钙的浓度为2000-10000IU/ml，所述低分子肝素钙的体积份数为2-5。
7.根据权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，所述干细胞冻存液含包括抗氧化剂，所述抗氧化剂的体积份数为1-5。
8.根据权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，所述抗氧化剂为维生素C注射液。
9.根据权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，所述干细胞冻存液还包括DMSO，所述DMSO的体积份数为2-10。
灏洋生物全血单个核细胞分离液说明书
www .tbdscience .com天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 本品只能用于科学研究，不能用于临床检测 天津灏洋华科生物科技有限公司 本品于GMP 标准下生产天津市灏洋生物制品科技有限责任公司◆TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD - 1 -天津滨海高新区华苑产业区（环外）海泰华科一路15号3幢5层技术服务T el: 158****1119 158****1119139****1119◆ QQ:2768676807 ◆E-mail:*********************灏洋生物 TBD sciences 人全血单个核细胞分离液说明书【包装规格】200ml/瓶【实验前准备】1. 适用仪器最大离心力可达1200g 的水平转子离心机2. 抗凝剂的选择在动物实验采血时，很多实验者选择医用真空采血管获得抗凝血，医用采血管中的抗凝 剂只考虑血浆质量，但不利于高纯度细胞分离实验。
为此，天津灏洋特别开发出专利抗凝剂及抗凝管专用于细胞分离，改变使用普通采血管 获得抗凝血分离效果不佳，提取率及纯度低下的不良结果。
3. PBMC 高效离心管（详见PBMC 高效离心管使用说明）【检验方法】全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。
首先根据样本量大小，分以下几种情况：一、 使用15ml 离心管时：情况A ：血液样本量小于3ml 时，实验方法如下：1. 取一支15ml 离心管，加入3ml 分离液。
2. 用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上，400-650g ，离心20-30min （注：根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。
3. 离心后，此时离心管中由上至下分为四层。
第一层为血浆层。
第二层为环状乳白色单个核细胞层。
第三层为透明分离液层。
第四层为红细胞层。
L02细胞培养及转染
L02细胞培养--复苏/传代/转染/计数/冻存主要试剂：1.培养基：RPMI1640（gibico）2.胎牛血清（天津灏洋）3.质粒小抽试剂盒（美国Omega生物技术公司）4.Lip2000（invirtrogen）5.0.25% 胰酶EDTA溶液：0.25 g 胰蛋白酶0.02 g EDTA-Na2溶解于100 mL冰冷PBS中，0.22 m滤器过滤，-20℃分装保存。
6.细胞冻存液：10% DMSO加全血清。
7.青链霉素混合液（100×）（天津灏洋）8.10×PBS80gNaCL，2gKCL，2.4gKH2PO4，14.4gNa2PO4·H2O溶解于800ml双蒸水中定容至1L。
【复苏：】细胞复苏的原则：快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
（一）实验前准备：1、将水浴锅预热至37℃2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
3.、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等4、将RPMI1640培养液、胎牛血清、从4℃冰箱拿出5、配制适量含10％的胎牛血清及青莲霉素混合液（1×）的完全培养液放入4℃冰箱内备用。
（二）细胞复苏：1.取液氮中冻存细胞，于37°C水浴锅中不断的摇动，使管中的液体在1min 内迅速融化，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，拿入超净台内，将冻存管内细胞吹打混匀后吸入10ml离心管内，缓慢加入5-8 ml含胎牛血清和青链霉素的完全培养液。
2.离心机内配平离心，1000 r/min 离心5min，吸弃上清液，将剩余细胞吹打混匀制成悬液转移入培养瓶内，加入完全培养液6ml，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内孵育。
【消化及传代】1.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
企业信用报告_天津市灏洋生物制品科技有限责任公司
目录一、企业背景 (5)1.1 工商信息 (5)1.2 分支机构 (5)1.3 变更记录 (5)1.4 主要人员 (10)1.5 联系方式 (10)二、股东信息 (10)三、对外投资信息 (11)四、企业年报 (11)五、重点关注 (13)5.1 被执行人 (13)5.2 失信信息 (14)5.3 裁判文书 (14)5.4 法院公告 (14)5.5 行政处罚 (14)5.6 严重违法 (14)5.7 股权出质 (14)5.8 动产抵押 (15)5.9 开庭公告 (15)5.11 股权冻结 (15)5.12 清算信息 (15)5.13 公示催告 (15)六、知识产权 (16)6.1 商标信息 (16)6.2 专利信息 (16)6.3 软件著作权 (18)6.4 作品著作权 (18)6.5 网站备案 (18)七、企业发展 (18)7.1 融资信息 (18)7.2 核心成员 (19)7.3 竞品信息 (19)7.4 企业品牌项目 (19)八、经营状况 (19)8.1 招投标 (19)8.2 税务评级 (20)8.3 资质证书 (20)8.4 抽查检查 (20)8.5 进出口信用 (20)8.6 行政许可 (21)一、企业背景1.1 工商信息企业名称：天津市灏洋生物制品科技有限责任公司工商注册号：120104*********统一信用代码：911201047384851715法定代表人：高旭组织机构代码：73848517-1企业类型：有限责任公司所属行业：科技推广和应用服务业经营状态：开业注册资本：472.0945万(元)注册时间：2002-06-24注册地址：天津市南开区科研东路15号512（科技园）营业期限：2002-06-24 至无固定期限经营范围：生物技术及产品的开发、咨询、服务、转让；生物制品、生化制品（药品、危险品除外）制造、加工；五金、交电、实验室材料、仪器仪表、办公用品、医疗器械、化妆品批发兼零售；从事国家法律法规允许的进出口业务；医疗器械生产。
天津细胞冻存液配制步骤
天津细胞冻存液配制步骤细胞冻存液是一种常用的实验室试剂，用于将细胞保存在低温条件下以便长期保存或运输。
天津细胞冻存液是一种常用的细胞冻存液品牌，本文将介绍天津细胞冻存液的配制步骤。
1. 准备所需材料配制天津细胞冻存液所需的材料包括：细胞培养基、细胞冻存液、无菌离心管、离心机、无菌移液器、培养皿、细胞培养工具等。
2. 准备细胞悬液将需要保存的细胞培养物从培养皿中取出，用细胞培养基洗涤细胞，并用离心机将细胞沉淀下来。
然后，将上清液倒掉，用细胞培养基重新悬浮细胞。
3. 加入细胞冻存液将细胞悬液转移到一个无菌离心管中，然后逐滴加入适量的天津细胞冻存液。
添加的细胞冻存液量应根据细胞数量和细胞冻存液的浓度来确定。
一般来说，每个细胞冻存液品牌都会提供相应的浓度和添加比例建议。
4. 混匀将细胞悬液和细胞冻存液充分混匀，可以轻轻摇晃离心管或使用无菌移液器将液体上下翻转几次。
确保细胞和细胞冻存液均匀混合，以便细胞在冷冻过程中能够均匀受冷。
5. 分装将混匀后的细胞悬液分装到无菌离心管中，每个离心管中的细胞数量要适量，不宜过多或过少。
同时，要确保离心管密封良好，以防止冻存液的挥发或细胞被污染。
6. 冷冻将装有细胞悬液的离心管放入冷冻器中，经过一段时间的冷却，逐渐降低温度。
一般来说，细胞冻存液的冷冻温度为-80摄氏度。
在冷冻过程中，要避免温度的突变和震动，以免对细胞产生不良影响。
7. 长期保存经过冷冻后，将细胞冻存液的离心管转移到液氮罐中进行长期保存。
液氮温度极低，可以有效防止细胞冻存液的降解和细胞的死亡。
在液氮罐中保存的细胞冻存液可以长期保存数年，并且在需要时可以随时取出使用。
细胞冻存液的配制是细胞实验中非常重要的一步，它能够帮助科研人员保存细胞、传代细胞以及进行进一步的实验。
天津细胞冻存液作为一种常用的冻存试剂，在配制过程中需要严格按照标准操作，以确保细胞的质量和保存效果。
希望本文对您有所帮助。
造血干细胞冻存液配制步骤
造血干细胞冻存液配制步骤
造血干细胞冻存液的配制步骤如下：
1. 准备培养基：将造血干细胞需要的培养基缓冲液加热至37°C，放入培养箱中等待使用。
2. 准备冻存液：将10% DMSO 冻存液和20% FBS 冻存液等比例混合。
3. 分装细胞：将准备好的造血干细胞均匀分装到不带菌的离心管中。
4. 加入冻存液：将相应的冻存液缓慢加入分装好的细胞悬液中，轻轻摇晃管子使细胞与冻存液混合均匀。
5. 冷却：将混合好的细胞悬液放入 -80°C 的冰箱中快速冷却。
6. 转移样品：待细胞悬液完全冻结后，用液氮桶将离心管转移至液氮罐中进行长期保存。
干细胞移植中的容器及贮存液的选择与使用技巧
干细胞移植中的容器及贮存液的选择与使用技巧干细胞移植是一种重要的治疗方法，它具有广泛的应用前景，可以用于治疗许多疾病。
在进行干细胞移植过程中，容器和贮存液的选择以及使用技巧对于干细胞的保存和存活至关重要。
首先，容器的选择是非常关键的。
在干细胞移植过程中，一般使用的容器有冻存管、冻存袋和液氮罐等。
对于干细胞的保存，冻存管是最常见的选择。
因为它易于使用、易于贮存和维护，并且可以单独存储每个样本。
冻存袋则适用于需要较大数量的干细胞样本，其优点是可以进行大规模存储。
在选择容器时，需要考虑到容器的材质和密封性，以确保干细胞的质量和存活率。
其次，贮存液的选择也至关重要。
贮存液是用于保存干细胞的液体介质，以保持细胞的活力和功能。
常用的贮存液有明胶贮存液、冷冻保存液和低温保存液等。
明胶贮存液是一种生物基质，可提供细胞生长所需的营养物质和支持，有助于维持干细胞的生存状态。
冷冻保存液则常用于液氮冷冻保存，能够有效地保护干细胞免受低温和冷冻造成的损伤。
而低温保存液则通常用于冷藏保存，适用于短时间的干细胞储存。
在选择贮存液时，需要综合考虑干细胞的特性和贮存条件，以确保细胞的质量和功能的保存。
此外，干细胞移植过程中的使用技巧也需要注意。
首先，必须保证操作的无菌性。
在进行移植前，必须对容器和贮存液进行无菌处理，以防止细菌和其他微生物的污染。
其次，需要控制移植物的传递速度。
在向患者输注干细胞移植物时，应控制输注速度，避免过快或过慢导致不良反应或细胞损伤。
此外，还需要注意干细胞的预热处理。
在从冻存状态解冻干细胞进行移植前，需要进行适当的预热，以避免温度突变对细胞的损伤。
总的来说，干细胞移植中的容器选择与贮存液的选择和使用技巧是影响移植效果的关键因素。
正确选择容器和贮存液，并且掌握相关的使用技巧，可以确保干细胞的保存和存活，提高治疗的效果。
但是需要注意的是，干细胞移植是一项专业的医疗技术，应在医生的指导下进行，并且需要综合考虑患者的具体情况和医疗需求。
天津细胞冻存液配制步骤
天津细胞冻存液配制步骤
1、准备冻存培养液：根据具体细胞类型，细胞容量等，选用冻存培养液配方，具体搭配有：MEM盐水+10%DMSO+10%FBS；RPMI-1640盐水
+10%DMSO+10%FBS；DMEM盐水+10%DMSO+10%FBS；TY常温琼脂糖盐水
+10%DMSO+10%FBS...等；
2、清洗并消毒培养皿：用70%擦酒精擦拭再烘烤，即可杀菌消毒；
3、细胞分离：用体外消解培养基，调整细胞浓度，将细胞移植到消毒的培养皿中，试管中的细胞为准备冻存的细胞；
4、悬液法冻存：将细胞悬液在冻存培养液中，最好每管只装1-
5*106个细胞，以便冻存后更好的恢复；
5、冻存预冷：将准备好的细胞悬液放入空气冰箱的4℃环境中预冷2小时；
6、冻存过程：将预冷好的细胞悬液从冰箱取出，放入-150℃的专用冻存箱内，以每小时-1℃/次的速度进行冻存；
7、冻存保存：最终将细胞悬液放入-180~-196℃的低温条件下进行长期保存；
8、细胞融解：在37℃常温下，将冻存的细胞融解，同时加入10%FBS 琼脂糖，使细胞恢复原有的生长状态；
9、细胞活性检测：将恢复后的细胞分装到培养皿中，进行培养，观测细胞的增殖状态，最后通过实验结果检测细胞的活性。
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2. 细菌内毒素
细菌内毒素对细胞有毒害作用，高 水平内毒素含量会导致细胞死亡。本分 离液系列产品经多次活性炭处理，使其 内毒素含量降低为小于0.5EU/ml至小 于0.06EU/ml，远远优于国内外各品牌 同类产品。各批次产品使用中华鲎试剂 （TAL）根据2010年《中国药典》中凝 胶法检测细菌内毒素中所述方法进行监 控以保证质量，使其广泛用于临床诊断 及免疫治疗。
用于人单核细胞分离 生产流程符合现行 GMP标准 高澄清度、低热原、无 细胞毒性 所分离细胞纯度好、活 性高、复性强
相关试剂：全血及组织匀浆稀释液、细胞无血清培养液、 细胞洗涤液及细胞冻存液等。
无血清细胞扩增系统
编号 名称 TBD2012HSCM 人造血干细胞扩增系统 TBD2012MSCM 人间充质干细胞扩增系统 TBD2012HDCM 人DC树突状细胞扩增系统 TBD2012ESCM 人胚胎干细胞扩增系统 规格 100ml/Kit 100ml/Kit 100ml/Kit 100ml/Kit
性 生产用水为符合2010版《中国药 典》相关规定的注射用水 生产环境控制及生产条件严格服 从国家GMP标准及流程
质量控制
严格控制产品无菌、低内毒素水平， 整个生产流程完全按照GMP标准操作 ，保证产品各项高性能指标。 生产完成后灯检监测以保证产品溶液 的澄明度、可见异物及不溶性微粒等 性能指标符合国家标准。 40nm过滤去除病毒。
相关产品：各种细胞生长因子、细胞洗涤液、干细胞 冻存液、细胞培养耗材等。
人间充质干细胞扩增系统
货号：TBD2012MSCM 规格：100ml/Kit
内含人间充质干细胞培养液一瓶及添 加剂一支 用于人间充质干细胞培养 无动物源性血清及蛋白 高安全性、无细胞毒性、低热原（内 毒素<0.5EU/ml）、无菌、无支原 体、无病毒 培养基在现行的GMP标准下生产 所培养的细胞保持未分化状态，具有 卓越的细胞潜能
相关产品：各种细胞生长因子、细胞洗涤液、干细胞 冻存液、细胞培养耗材等。
人DC树突状细胞扩增系统
货号：TBD2012HDCM 规格：100ml/Kit
内含人DC树突状细胞培养液一瓶及 添加剂一支 用于人DC细胞培养 无动物源性血清及蛋白 高安全性、无细胞毒性、低热原（内 毒素<0.5EU/ml）、无菌、无支原体 、无病毒 培养基在现行的GMP标准下生产 所培养的细胞具有高效的增殖能力
认证
本产品于2011年注 册并获得由国家食 品药品监督管理局 颁发的《医疗器械 注册证》。
产品优势
1.
澄明度、可见异物及不溶性微粒 国家及行业标准中规定产品每 50ml溶液中含10μm以上的不溶性微 粒应在20粒以下，含25μm以上的不 溶性微粒应在5粒以下。本分离液系列 溶液澄清度高，溶液中可见异物及不 溶性微粒每50ml溶液中10μm以上的 不溶性微粒为5粒以下，完全满足甚至 优于国家、行业标准及其他品牌同类 产品。
医用级人单个核细胞分离液
货号：LDS107505 规格：200ml
用于人单个核细胞分离 生产流程符合现行 GMP标准 高澄清度、低热原、无 细胞毒性 所分离细胞纯度好、活 性高、复性强
相关试剂：全血及组织匀浆稀释液、细胞无血清培养液、 细胞洗涤液及细胞冻存液等。
医用级人中性粒细胞分离液试剂盒
2012天津灏洋生物医用级产 品宣传册
医用级人外周血淋巴细胞分离液
货号：LTS107705 规格：200ml
天津灏洋生物生 产的人外周血淋巴 细胞分离液注册并 获得由国家食品药 品监督管理局颁发 的《医疗器械产品 注册证》，广泛用 于临床诊断及免疫 治疗 。
生产工艺
产品原料及包装品均具有可追溯
相关产品：各种细胞生长因子、细胞洗涤液、干细胞 冻存液、细胞培养耗材等。
人胚胎干细胞扩增系统
货号：TBD2012HDCM 规格：100ml/Kit
内含人胚胎干细胞培养液一瓶及添加 剂一支 用于人胚胎干细胞培养 无动物源性血清及蛋白 高安全性、无细胞毒性、低热原（内 毒素<0.5EU/ml）、无菌、无支原体 、无病毒 培养基在现行的GMP标准下生产 所培养的细胞具有高效的增殖能力
医用级人间充质干细胞分离液
货号：LGS107305 规格：200ml
用于人间充质干细胞分离 生产流程符合现行GMP标 准 高澄清度、低热原、无细 胞毒性 所分离细胞纯度好、活性 高，复性强
相关试剂：脐带保存液、全血及组织匀浆稀释液、人间充 质干细胞扩增系统、细胞洗涤液、间充质干细胞 流式检测系列及干细胞冻存液等。
人造血干细胞扩增系统
货号：TBD2012HSCM 规格：100ml/Kit
内含人造血干细胞培养液一瓶及添加 剂一支 用于造血干和祖细胞培养 无动物源性血清及蛋白 高安全性、无细胞毒性、低热原（内 毒素<0.5EU/ml）、无菌、无支原 体、无病毒 培养基在现行的GMP标准下生产 所培养的细胞保持未分化状态，具有 卓越的细胞潜能
3. 包装
本分离液系列产品 使用PETG瓶无菌灌 装。PETG瓶透明度 高、耐化学药剂、 抗应力白化能力强 ，产品灌装后无内 溶物产生，符合国 际GMP产品标准并 保证本系列分离液 溶液的高澄清度。
其他临床用细胞分离液
医用级人造血干细胞分离液
医用级人间充质干细胞分离液 医用级人单个核细胞分离液 医用级人中性粒细胞分离液试剂盒 医用级人单核细胞分离液试剂盒
货号：LZS1113105 规格：4×50ml/Kit
用于人中性粒细胞分离 生产流程符合现行 GMP标准 高澄清度、低热原、无 细胞毒性 所分离细胞纯度好、活 性高、复性强
相关试剂：全血及组织匀浆稀释液、细胞无血清培养液、 细胞洗涤液及细胞冻存液等。 医用级人单核细胞分离液试剂盒
货号：TBD2011H05 规格：4×50ml/Kit
医用级人造血干细胞分离液
货号：LGS106805 规格：200ml
用于人造血干细胞分离 生产流程符合现行 GMP标准 高澄清度、低热原、无 细胞毒性 所分离细胞纯度好、活 性高、复性强
相关试剂：脐带保存液、干细胞重悬液、全血及组织匀浆 稀释液、人造血干细胞扩增系统、细胞洗涤液、 造血干细胞流式检测系列及干细胞冻存液等。