蛋白质的相互作用研究方法

GFP could be used to report when a protein was being made in a cell.
GFP could potentially be a very useful reporter molecule.
William Ward (right) met Douglas Prasher on a jellyfish-hunting expedition in the 1980s
什么是FRET? 当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的 吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时， 能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到 长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧 光共振能量转移(FRET),实际相当于将短波长荧 光基团释放的荧光屏蔽。
3. 绿色荧光蛋白 60年代，Shimomura等首先从水母 （Aequoria Victoria ）中分离出一种水母发光 蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后 可产生蓝色荧光。然而水母中提取的颗粒都呈 绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发 光蛋白即绿色荧光蛋白 GFP, 后经研究表明， 在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合 后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光 的激发下，产生绿色荧光 。
Douglas Prasher was the first person to realize the potential of GFP as a tracer molecule.
容易检测 分子量小 不需要其它底物
Douglas Prasher 1992 克隆了GFP基 因
Chalfie 将GFP基因转入大肠杆菌中。
2. 应用 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告 基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有 二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含Transcription-activating domain的载体。另 外还需要特殊的酵母菌株如GAL4缺陷型。 1互作用是进行 药物设计的基础。基于结构的药物设计在 药物的研发中已取得较大的成功，近年来 通过化合物数据库与蛋白质结构的分子对 接进行虚拟筛选大幅度地提高了先导化合 物发现的成功率。
写出两种检测蛋白质之间的是否有相互 作用的方法？请写出主要操作步骤。
2.方法 1) 收获培养的细胞（1×107－1×108）冷PBS洗涤2次 2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min 3) 12000rpm 离心 30min 4）收集上清并加入适量抗体，4º C摇动1h～过夜 5）加入ProteinA/G-Sepharose(琼脂糖凝胶)悬液， 4º C摇动1h 6）细胞裂解液洗涤ProteinA/G-Sepharose混合液 7）离心弃上清 8）沉淀加2×蛋白Loading Buffer煮沸5－10min 9）离心，上清液跑SDS-PAGE 胶 10）考马氏亮兰染色、银染 Western Blot 质谱分析
人们在GFP基因的基础上已经制造出 蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，青色荧光 蛋白，又发现了红色荧光蛋白。 其中兰色荧光蛋白和绿色荧光蛋白 青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白之间可以发 生荧光共振能量转移
Look at physical interactions between proteins
四、Bimolecular Fluorescent Complementation
6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱 分析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot 来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白 注意：该实验设立GST对照，反应均在4º C进行
GST-Pulldown Assay
三、Fluorescence resonance energy transfer 1.荧光信号的产生 荧光基团在某波长的激发光刺激下，产 生一个更长波长的发射光。
Osamu Shimomura
Osamu Shimomura in the lab in the basement of his home. He is holding a sample of “real” GFP isolated from Aequorea victorea, not produced by bacteria. In order to do his research Shimomura estimates that he collected over a million Aequorea specimens。 （One Aequorea weigh about 50g）
3.注意事项 1）细胞裂解 采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存 在的蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子 变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂 解条件是不一样的，通过经验确定。 不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂 解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的 cocktailer。 2）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共 沉淀。 3) 对照实验的设计。
Sergey A. Lukyanov 在珊瑚中发现了类似GFP的蛋白。 他还发现了红色荧光蛋白。
Roger Tsien
对GFP的机理作
出了贡献。制造
了很多GFP突变
体。
2008年诺贝尔化学奖
GFP主要应用:
• 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过 程中或外界刺激因子的作用下的时空表达, 如某种转录因 子的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。 GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察 该分泌蛋白分泌到细胞外的过程
一、免疫共沉淀
1. 原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞 内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留 了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X 在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用 于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于 确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。
优点：生理条件下的结合 缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互 作用
根据这一特点，如果使可能存在相互作用的 两种蛋白X和Y分别以和BD/AD形成杂合蛋白的 形式的酵母中表达分布于细胞核中，X与Y之间的 相互作用就可以将BD和AD在空间结构上重新联 结为一个整体而与报告基因的上游激活序列 （upstream activation sequence）结合，进而 发挥激活转录的功能，使受调控的报告基因得到 表达。根据这一原理，双杂交系统通过简便的酵 母遗传分析对报告基因表型进行检测即可实现对 于蛋白质间相互作用的研究。
2 方法： 1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明 确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译 cDNA表达得到的未知蛋白）
2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4º 2h C
3）离心弃上清 4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，离心
5）取上清进行SDS-PAGE电泳，
两个或两个以上的蛋白质结合在一起 执行生物学功能时，发生相互作用。
使蛋白质到发挥作用的位点。 使蛋白质的构象发生改变，激活或抑制。
蛋白质－蛋白质相互作用和识 别在诸如生物催化、物质转运、信 号传导、免疫、细胞调控等多种生 命过程起着重要的作用。
第三节 蛋白质的相互作用的研究方法
免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP) GST pull-down assay 荧光共振能量转移Fluorescent Resonant Energy Transfer （FRET） 双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescent Complement）BIFC 酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid Systerm 其它方法
2）寻找一种蛋白可能的相互作用蛋白
3. 双杂交系统的缺陷
（1）它并非对所有蛋白质适用。
融合蛋白的相互作用激活报告基因转录是在细胞 核内发生的，而表达的融合蛋白在细胞内能否正确折 叠并运至核内是检测的前提条件。虽然目前已经在表 达质粒中插入了核定位序列，但仍不能排除不少必须 经过内质网等细胞器进行翻译后加工修饰的蛋白质尤 其是胞外蛋白不能进入核内，或因产生错误的构象而 影响筛查结果.
二、GST融合蛋白进行Pulldow实验
1 原理 细菌表达的谷胱甘肽s－转移酶（GST）融合蛋 白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白 作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根 据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力 来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体 前，或发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用 时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体 外的相互作用。 两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间 的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用
五、Yeast Two－Hybrid Systerm
1.原理 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真 核基因转录调控中建立。 典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、 等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNAbinding domain)和转录激活结构域(transcriptionactivating domain)。前者可识别DNA上的特异序 列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上 游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作 用，启动它所调节的基因的转录。
GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能 显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞 器的结构及病理过程。
膜蛋白的移动 （Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP ） • 蛋白之间的相互作用（FRET） • 报告分子 将GFP的基因连在特殊的启动子的后面，可以检 测基因表达的时间和部位。