4、选择性剪切
mRNA剪切机制简介mRNA专题
mRNA剪切机制简介mRNA专题细胞核内前体mRNA的剪接的执行者是剪接小体，它能够在成熟mRNA出核和翻译之前识别剪接信号，移除不编码内含子，并将能够编码蛋白的外显子拼接在一起。
细胞核内前体mRNA的剪接需要经历2次转酯化反应化步骤去掉内含子才能将相邻的外显子拼接成成熟的mRNA。
在前体mRNA上有三个反应区域分别在5'剪接位点(5'SS)，3'剪接位点(3'SS)以及分枝位点（图1）。
除了这三个反应区域外，在多细胞生物体的内含子上还拥有保守性的多聚嘧啶束，它位于3'剪接位点以及分枝位点之间。
图1选择性剪接发生过程示意图选择性剪接由内含子5'剪接位G和U2个核苷酸点以及3'剪接位点A和G 2个核苷酸介导。
分支点A核苷酸非常保守的，一般位于3'剪接位点上游20-50个核苷酸。
剪接反应的过程发生2次转酶化反应，这个过程中需要5个snRNPs复合物(Ul，U2,U4,U5,andU6)。
这些复合物能够聚集在前体mRNA上形成大分子的聚合物。
剪接小体，核内最大的RNP复合物，能够识别这些反应位点并催化前体mRNA发生剪接。
剪接小体中主要的模块是snRNPs复合物。
剪接小体一般包含5种snRNPs：U1、U2、U4，U5和U6 snRNP。
每一个snRNP包含了单个snRNA和至少7种蛋白亚基。
这些snRNP和另外的非snRNP相关蛋白（例如SF1、U2AF和Prp19复合物）一步步有序的聚集在前体mRNA上依次形成前剪接小体E，A，B以及C复合物（图1）。
在这有序的过程中，这些snRNP以及非snRNP相关蛋白和反应位点之间发生复杂的结合与去结合过程，这些复杂的过程为核小体提供了多次检查的机会以保证它们结合的准确性从而提高位点选择的精确性。
在核小体组装之前，U1 snRNP占据5'剪接位点，而SF1结合在分枝位点，这2个过程是ATP依赖的并最终形成前剪接小体E复合物（图1）。
蛋白质剪切 研究方法
蛋白质剪切研究方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蛋白质是生物体内的重要组成部分，扮演着多种功能的角色，如结构支持、传递信号、调节代谢等。
蛋白质的功能在很大程度上取决于其结构和构象，而蛋白质的结构则通过转录和翻译来确定。
蛋白质的功能并不仅仅受到其原始基因序列的控制，还受到许多其他因素的影响，其中包括蛋白质的剪切。
蛋白质剪切是一种常见的后转录修饰过程，它能够调节蛋白质的功能、稳定性和局部化。
在蛋白质剪切过程中，蛋白质的氨基酸序列会发生变化，从而影响其结构和功能。
蛋白质的剪切可以通过多种不同的方式实现，其中包括选择性外切、选择性保留、选择性插入和选择性编辑等。
研究蛋白质剪切对于理解蛋白质功能的调控、疾病发生的机制以及药物开发具有重要意义。
在过去的几十年里，科学家们已经开发出了许多不同的研究方法来探究蛋白质剪切的机制和影响。
以下将介绍一些常见的蛋白质剪切研究方法：1. 蛋白质序列分析：通过对蛋白质序列的比对和分析，可以揭示蛋白质剪切位点的位置、特征和潜在功能。
这种方法主要通过生物信息学工具来实现，如NCBI的BLAST和EMBOSS软件等。
2. 基因敲除和转基因动物模型：利用基因编辑技术，可以构建特定基因的敲除或过表达动物模型，从而研究该基因对蛋白质剪切的调控作用。
通过这种方法，科学家们可以深入了解蛋白质剪切对动物生理和疾病的影响。
3. 蛋白质结构解析：通过X射线晶体衍射、核磁共振、电子显微镜等技术，可以确定蛋白质的高分辨结构和构象，从而揭示蛋白质剪切对蛋白质结构和功能的影响。
这种方法对于研究蛋白质剪切的机制和作用方式非常重要。
4. 质谱分析：质谱分析是一种常用的蛋白质分析技术，可以用来鉴定和定量蛋白质的剪切变体。
通过基于质谱的蛋白质组学方法，可以揭示蛋白质剪切在细胞和组织水平上的变化，为进一步研究蛋白质剪切提供重要数据支持。
第二篇示例：蛋白质剪切是一种重要的细胞调控机制，通过该机制可以产生不同功能的蛋白质，从而影响细胞的生理活动。
中科院攻读硕士学位研究生入学试题《生物化学及分子生物学》
中科院20XX年攻读硕士学位研究生入学试题《生物化学及分子生物学》生物类考研专业课资料一、判断题 20题，20题，每题1.5分，共30分.1、鞘磷脂的代谢过程主要与细胞质膜的流动有关与细胞生物活性分子的生成调节无关。
2、蛋白质的修饰与其运输和定位有关，而与其降解代谢无关。
3、蛋白质的豆蔻酰化是蛋白质脂肪酸化的一种形式。
4、可逆性膜锚定与蛋白激酶参与的信号转到有关，而与G蛋白（如Ras）参与的信号转导无关。
5、蛋白质溶液出现沉淀与蛋白质变性存在必然的关系。
6、Km值是酶的特性常数之一，与酶的浓度、pH、离子强度等条件或因素无关。
7、一个酶的非竞争性抑制剂不可能与底物结合在同一部位。
8、蛋白质泛素化（ubiquitination）过程需要三种蛋白质（酶）的参与，其中之一是泛素--蛋白连接酶。
9、往线粒体悬液中加入NADH可以还原线粒体的辅酶Q。
10、膜上有些七次跨膜受体在与配基结合时会形成二体。
11、低浓度不含钾离子的等渗缓冲液中悬浮着内含0.154M氯化钾的脂质体，此时往悬浮液中加入缬氨霉素，悬浮液的pH会下降。
12、内质网系膜结合的钙ATP酶在催化ATP水解时促进Ca2+/2H+交换。
13、辅酶I（NAD+ ）、辅酶II（NADP+）、辅酶A（CoA）、黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）中都含有腺嘌呤（AMP）残基。
14、端粒酶（telomerase）是一种RNA蛋白质复合物，其作用机制是以RNA为模板，由蛋白质催化逆转录; 所以广义上说，端粒酶是种逆转录酶。
15、Tm是DNA的一个重要特性，其定义为：使DNA双螺旋90％解开时所需的温度。
16、与DNA双螺旋相反方向缠绕而形成的超螺旋叫做“负超螺旋”。
17、细菌中的插入序列（IS）具有转座能力，能随机插入到任一DNA序列中，在靶点两侧形成一段短的正向重复序列。
18、细菌代谢酶的诱导和合成途径中酶的阻遏，调节蛋白都对操纵子起负调控作用。
选择性剪接中的剪接模式(科学书苑)
选择性剪接中的剪接模式有几种不同的剪接模式（见图1-1）[1，6]。
最常见的模式是在成熟的mRNA中跳过外显子，使其包括或者剔除盒式外显子（也称为跳过的外显子）。
跳过外显子的一个著名的例子是果蝇性别致死的基因（SXL），这是一个由性别决定的转变。
跳过SXL基因的第3外显子，可以保持雌性的分化。
SXL的第3外显子包含一个早提前的终止密码子，这个外显子的存在合成出截短的、也有可能是非功能的蛋白质[7，8]。
另一个剪接模式是外显子互斥，这使得两个相邻外显子中，仅有一个出现在最终产物中。
人类成纤维细胞生长因子受体二号（FGFR-2）基因含有外显子IIIB和IIIC，这两者是互斥的。
从外显子IIIB得到的的基因产物，具有比纤维细胞生长因子低得多的聚合吸引力[9]。
不仅可以作用于整个外显子，不同的剪接方式也可以只剪接外显子的某一部分。
5'或3'选择性剪接位点的选择，通过加上、或者不加上与外显子侧面相连的支链而生成，从而造成多样性。
果蝇无子（FRU）和双性别（DSX）基因包含了雌性特有的选择性剪接位点，前者在5‘端，而后者在3'端。
由于选择性剪接位点的不同，造成支链的细小差异[10，11]。
选择性剪接可发生在转录体的任意一端。
选择性终止外显子不仅改变最后一个外显子的包含性，而且还影响聚腺苷酸化位点的选择。
在许多情况下，它可以在最后的外显子中生成提前的终止密码子，并且生成功能性截短的多肽或者产生无意义介导衰变（NMD，即，由于终止密码子位于最后外显子与外显子的结点上游超过50-55碱基对处，从而造成的mRNA的降解）[2，12，13]。
钙调节激素（降钙素）基因包括6个外显子。
成熟的的降钙素转录体包括前四个外显子，并使用位于第4外显子上的多聚腺苷酸化位点，从而生成甲状腺C细胞中超过98%的基因产物。
同时，在大脑和周围神经系统中，通过将前三个、第五和第六个外显子编码成降钙素相关肽的前体，并利用下游的腺苷酸化位点（CGRP），从而产生差异[14，15]。
某大学生物工程学院《普通生物化学》考试试卷(638)
某大学生物工程学院《普通生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（140分，每题5分）1. 生长激素是由垂体前叶分泌的含糖基的单链蛋白质。
（）答案：错误解析：生长激素不含糖。
2. T4 DNA连接酶不仅能连接双链中的单链缺口，还能进行DNA双链的平接。
（）答案：正确解析：大肠杆菌DNA连接酶要求断开的两条链由互补链将他们聚在一起形成双螺旋结构，它不能将两条游离的DNA分子连接起来。
T4 DNA连接酶不仅能连接双链中的单链缺口，还能进行DNA双链的平接。
3. 酶在细胞内的半寿期主要取决于它的降解速率而不是合成速率。
（）答案：正确解析：4. 同型半胱氨酸是组成蛋白质的氨基酸。
（）答案：错误解析：5. 糖原磷酸化酶可直接被蛋白激酶A磷酸化。
（）答案：错误解析：蛋白激酶A需要经由磷酸化酶b激酶的中介才能将低活性的糖原磷酸化酶b磷酸化成高活性的磷酸化酶a。
6. 在真核细胞内，饱和脂肪酸在O2的参与下和专一的去饱和酶系统催化下进一步生成各种长链脂肪酸。
（）答案：错误解析：7. 正常情况下，一种酶制剂的得率越高，比活力越低。
（）答案：错误解析：得率与酶活性回收率有关，而比活力和酶的纯度有关，两者不一定成正比。
8. 很多转氨酶以α酮戊二酸为氨基供体，而对氨基供体并无严格专一性。
（）[南开大学2016研]答案：正确解析：9. 转录因子都具有负责与DNA结合的结构模体。
（）答案：错误解析：某些转录因子本身并不具有专门结合DNA的结构模体，但它们可以通过与其他转录因子的相互作用与DNA结合。
10. IMP是嘌呤核苷酸从头合成途径中的中间产物。
（）答案：正确解析：次黄苷酸的生物合成是由核糖5磷酸经一系列的酶促反应后生成肌苷酸（IMP）的过程，IMP是反应的中间产物。
RNA转录后的剪切与加工
目录
• rna转录后的剪切 • rna加工 • rna剪切与加工的相互关系 • rna剪切与加工的异常表达与疾病
01
rna转录后的剪切
剪切的定义与重要性
剪切的定义
RNA转录后，通过特定的核酸酶将 RNA分子从转录起始位点至终止位点 之间的序列进行切割的过程。
剪切的重要性
剪切的过程
在剪切过程中，核酸酶首先识别RNA分子中的特定位点，然后进行切割，产生两 个新的RNA分子片段。这些片段可能进一步被加工或降解。
剪切的调控机制
剪切的调控机制包括多种因素，如基因的启动子、增强子、沉默子和miRNA等。这些因素可以影响 RNA聚合酶的活性，从而影响转录的起始和终止，进一步影响剪切过程。
高效、更灵敏的技术用于研究这些过程。
04
rna剪切与加工的异常表 达与疾病
剪切与加工异常的表达模式
异常剪切
在某些情况下，RNA剪切过程可能发生异常，导致产生异常的RNA剪切产物。这些异常的剪切产物可能导致基因 表达的异常，进一步影响细胞功能。
异常加工
RNA加工过程中，如甲基化、磷酸化等修饰过程发生异常，也可能导致RNA的功能异常。这些异常的RNA可能 无法正确地指导蛋白质的合成，或者可能产生有毒性的RNA。
剪切与加工异常与疾病的关系
遗传性疾病
一些遗传性疾病的发生与RNA剪切与加工的异常有关。例 如，一些遗传性神经性疾病可能与特定基因的异常剪切有 关。
癌症
癌症的发生也常常伴随着RNA剪切与加工的异常。一些癌 症可能由于特定基因的异常剪切或加工而导致其表达水平 的上调或下调。
感染性疾病
某些感染性疾病也可能影响RNA的剪切与加工。例如，某 些病毒可能通过干扰宿主细胞的RNA剪切与加工过程来影 响基因表达，从而促进病毒的复制。
Alternative splicin1--2 选择性剪切
Alternative splicing 选择性剪接Alternative splicing produces two protein isoforms.选择性剪接产生两种蛋白亚型。
Alternative splicing is a regulated process during gene expression that results in a single gene coding for multiple proteins. In this process, particular exons of a gene may be included within, or excluded from, the final, processed messenger RNA produced from that gene.[1]Consequently the proteins translated from alternatively spliced mRNAs will contain differences in their amino acid sequence and, often, in their biological functions (see Figure). Notably, alternative splicing allows the human genome to direct the synthesis of many more proteins than would be expected from its 20,000 protein-coding genes. Alternative splicing is sometimes termed differential splicing, but it does not increase gene expression.选择性剪接是基因表达，其导致单基因编码多种蛋白质中一个调节的过程。
分子生物学第4章重点及试题
一、名词解释：转录:是指以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚和酶催化下，以4中NTP（ATP、CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA的过程。
转录单位 (transcription unit):从启动子到终止子的序列 (转录起始点)。
模板链（template strand）:又称反义链, 指与转录物互补的DNA链（极性方向3’→5’）。
编码链:又称有义链, 指不作模板的DNA单链（极性方向5’→3’）。
hnRNA：核内不均一RNA，是存在于真核细胞核中的不稳定，大小不均一的一组高分子RNA的总称。
转录的极性：转录的效率与转录单位的位置有关。
转录起始：RNA聚合酶与DNA转录启动子结合形成有功能的转录起始复合物的过程。
启动子（Promoters）：指DNA分子上被RNA聚合酶、转录调节因子等识别并结合形成转录起始复合物的区域。
核心启动子：RNA聚合酶能够直接识别并结合的启动子。
RNA聚合酶：是催化以DNA为模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶。
C端结构域(CTD)：RNApolⅡ的大亚基中有 C 末端结构域。
CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复Tyr－Ser p－Pro－Thr p－Ser p－Pro－Ser p C端重复七肽。
沉默子（silencer）：沉默子能够同反式因子结合从而阻断增强子及反式激活因子作用并最终抑制该基因的转录活性的真核基因中的一种特殊的序列。
增强子(enhancer)：是一类正调控元件，能够从转录起始位点的上游或下游数千个碱基处来激活转录。
绝缘子（insulater）：阻断增强子或沉默子的DNA序列。
上游：转录起点上游的序列，是调控区，与转录的方向相反。
下游：转录起点下游的区域，是编码区，与转录的方向一致。
转录起点：＋1位点，RNA聚合酶的转录起始位点，起始NTP多为ATP或GTP。
转录泡：在转录时RNA聚合酶Ⅱ（RNAPⅡ）与DNA模板结合，会形成一个泡状结构，成为转录泡。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分子机制研究套路（四）
选择性剪切
课题：激酶A通过RNA结合蛋白B影响C的选择性剪切
1．概念介绍：
真核生物结构基因的DNA序列由编码序列和非编码序列两部分组成，编码序列是不连续的，被非编码序列分割开来，成为断裂基因(Split gene)。
在结构基因中，编码序列称为外显子(Exon)，是表达多肤链序列，非编码序列称为内含子(Intron)，是不表达多肤链序列，又称插入序列。
真核生物DNA转录为前mKNA(Pre-mRNA)后经过mRNA的剪切，切去内含子，将有编码意义的外显子连接起来，转变为成熟mRNA。
真核基因转录产生的mRNA前体，在细胞分化、发育阶段和生理状态下，可按不同的方式剪切产生出两种或者更多种mRNA，进而翻译出两种或多种蛋白质，此过程为选择性剪切或称可变剪切(Altemative Splicing)。
选择性剪接的形式多样,最常见的主要是以下几种：1)外显子跳过，从而导致外显子保留或者不保留在成熟的mRNA中；2)外显子具有多个5’或者3’剪接位点，以此可能产生多种选择性剪切异构体；3)单个或者多个选择性剪接外显子可以位于组成型外显子(constitutive exon)中,以便选择性外显子可以有选择的保留或者不保留于成熟的mRNA中；4)内含子不剪切，内含子可以选择性保留在成熟mRNA中以便被翻译出来。
mRNA这种选择性剪切是少量基因产生大量mRNA和蛋白质的重要机制，也使得机体仅少量基因就能对千变万化的复杂的生物性状进行调控成为可能。
mRNA这种选择性剪切对扩充生物细胞遗传信息和增强生物细胞功能有着重要作用，并且大量研究证实，选择性剪切对基因表达的调节作用，在干细胞分化过程以及肿瘤的发生、发展过程中均发挥重要作用。
2．示意图：
图1：选择性剪切示意图
Pre-mRNA Altemative Splicing mRNA isoforms
图2：选择性剪切四种模式
3．研究思路：
假设激酶A在很多肿瘤中高表达或异常激活，C具有2种剪切体C-1和C-2，且二者在肿瘤中发挥截然相反的作用，C-1促癌，C-2抑癌。
肿瘤中C-1高表达，C-2低表达。
3.1 激酶A参与调控C选择性剪切方式 (3)
3.2激酶A可调控下游RNA结合蛋白B (4)
3.2.1激酶A的活性与RNA结合蛋白B表达水平相关 (4)
3.2.2免疫共沉淀检测激酶A与RNA结合蛋白B是否结合 (4)
3.2.3KD-激酶A使RNA结合蛋白B表达下调 (4)
3.3RNA结合蛋白B参与C选择性剪切的实验研究 (4)
3.3.1 RNA结合蛋白B可与C结合 (4)
3.3.2 KD-激酶A对RNA结合蛋白B与C结合能力的影响 (4)
3.3.3RNA结合蛋白B对C选择性剪切的影响 (5)
3.1 激酶A参与调控C选择性剪切方式
为研究激酶A是否影响C的选择性剪切方式，我们引入了KD-激酶A(Kinase-Dead，激酶活性缺失)腺病毒载体系统，抑制野生型激酶A的活性。
KD-激酶A腺病毒具有以下几个特点：具有野生型激酶A的结构，却没有野生型激酶A的活性，因此可以竞争性抑制细胞中正常激酶A的功能。
该重组腺病毒中携带GFP(green fluorescent protein，绿色荧光蛋白)，可对病毒转染过程进行追踪，并对感染的效率进行观察。
通过RT-PCR的方式证实激酶A激酶活性在基因C选择性剪切中的作用。
运用设计在C基因两种剪切体C-1/C-2选择性剪切位点前后的引物，RT-PCR对cell-1细胞中C的不同剪切体进行检测.
结果显示：抑制激酶A活性可诱导Cell-1细胞C基因选择性剪切方式改变。
在转染KD-激酶A以后，C两种剪切体中抑癌的C-2明显增加，而促癌的C-1明显降低，C-2/C-1比例明显升高，提示抑制激酶A活性可影响C选择性剪切方式，从而改变两种剪切体的比例，促进癌症的发生。
注释：如果有激酶A特异性的小分子抑制剂，可以引入该部分实验中。
对于暂无抑制剂的激酶活性研究，KD-激酶的引入是一个重要的手段。
3.2激酶A可调控下游RNA结合蛋白B
目前研究认为激酶A并不能直接参与RNA剪切的调控，根据对激酶A激酶结构的分析，我们推测某些下游的RNA结合蛋白可能与激酶A结合，受到激酶A的调控，在转录后水平发挥选择性剪切的作用。
3.2.1激酶A的活性与RNA结合蛋白B表达水平相关
为了明确激酶A与哪些RNA结合蛋白相互作用并参与C基因的选择性剪切，通过聚丙酰胺二维凝胶电泳这一蛋白质组学的检测方法，寻找与激酶A活性相关的下游靶蛋白。
经过质谱分析，与对照组相比，转染KD-激酶A以后Cell-1细胞中出现＿个差异点蛋白，其中RNA结合蛋白B的表达水平明显下调。
该结果提示：激酶A的活性与RNA结合蛋白B表达水平密切相关。
3.2.2免疫共沉淀检测激酶A与RNA结合蛋白B是否结合
免疫共沉淀结果表明，激酶A能够与RNA结合蛋白B结合，而阴性对照(IgG)则无法捕获相应的蛋白，说明激酶A可能通过结合其下游的RNA结合蛋白B对靶基因起调控作用。
3.2.3KD-激酶A使RNA结合蛋白B表达下调
通过Western Blot对转染KD-激酶A前后的Cell-1细胞中RNA结合蛋白B表达水平进行了检测，结果显示抑制激酶A活性以后，RNA结合蛋白B表达明显下降，该结果进一步证实激酶A与RNA结合蛋白B表达水平之间有密切联系，与2D-PAGE结论一致。
3.3RNA结合蛋白B参与C选择性剪切的实验研究
3.3.1 RNA结合蛋白B可与C结合
RNA-免疫共沉淀(RNA-IP)检测结果表明RNA结合蛋白B可以与C结合。
3.3.2 KD-激酶A对RNA结合蛋白B与C结合能力的影响
Cell-1细胞转染KD-激酶A以后，RNA结合蛋白B与C的结合水平降低，说明抑制激酶A
的活性，可能通过影响RNA结合蛋白B的结合水平从而参与C的选择性剪切。
3.3.3RNA结合蛋白B对C选择性剪切的影响
用Ad-RNA结合蛋白B和Ad-RNA结合蛋白B RNAi的重组腺病毒载体感染Cell-1细胞，24小时后荧光显微镜下观察，感染效率达到几乎100%，Western Blot证实转染有效。
与未转染和转染空载体组相比，转染KD-激酶A组和转染Ad-RNA结合蛋白B RNAi组的Cell-1细胞中C-2/C-1比例明显增加；转染Ad-RNA结合蛋白B组的Cell-1细胞中C-2/C-1比例明显下降。
而当KD-激酶A与RNA结合蛋白B过表达腺病毒共转染Cell-1细胞后，C-2/C-1比例仍高于正常对照组，但不及KD-激酶A组，该结果说明，受到激酶A活性调控而导致的RNA结合蛋白B表达水平改变可以影响C基因选择性剪切的方式，在Cell-1细胞中，RNA结合蛋白B的过表达在抑制C-2的同时，增加了C-1的表达，而且它的过表达可以拯救由转染KD-激酶A引起的C-2/C-1比例升高。
4．应用案例：
1.Chen ZY, Cai L, Zhu J, Chen M, Chen J, Li ZH, Liu XD, Wang SG, Bie P, Jiang P et al: Fyn requires
HnRNPA2B1 and Sam68 to synergistically regulate apoptosis in pancreatic cancer.
Carcinogenesis 2011, 32(10):1419-1426.。