生物芯片检测技术

激光共聚焦扫描仪光路图
绿光 激光器 红光 激光器 窄 带 滤 光 片 接 收 物 镜
光路 选择器
针 孔
二向色镜
PMT
激发物镜 生物芯片 扫描运动平台
激光共聚焦扫描仪硬件电路原理图
DSP（TMS320LF2407）最小系统
USB 通信 模块
运动 控制 模块
信号 采集、处理 及PMT控制
CPLD
信号处理及PMT控制单元
工作电极 材料：金，铂金，碳，ITO 形貌：圆盘，薄膜，丝 参比电极 饱和甘汞 银/氯化银 辅助电极 铂金片
芯片设计
玻璃衬底 ITO薄膜
金属 绝缘层
芯片加工
第一类芯片加工
第二类芯片加工
ITO光刻后芯片全貌
做好钝化层的芯片全貌 （导线和焊盘为ITO）
玻璃基 片上
ITO
光刻胶 Au/Ti
聚酰亚胺
做好钝化层的芯片局部 （导线和焊盘为ITO）
做好钝化层的芯片局部 （导线和焊盘为Au/Ti）
芯片化学放大电化学性能测试
① ②
Ep＝1.265V ip＝49.11 nA
1.12uA
③
1mM Ru(bpy)3在PBS缓冲液中的循环伏安 曲线
同一电极在不同电解质溶液中的循环伏安曲线 ①草酸钠溶液; ②含1mM Ru(bpy)3的PBS缓冲液; ③含1mM Ru(bpy)3的草酸钠溶液
电化学检测的原理
电极上电子能量 --- 外加电压决 定 分子中电子能量 --- 分子结构决 定
化学放大电化学检测原理
特点: 标记物分子多次参加电极反应，信号成倍放大；输入输出均 为电信号
电极
标记物（氧化态） 标记物 (还原态）
溶液相
放大物 (还原态） 放大物 (氧化态）
e
电信号产生：标记物（还原态）--- 标记物（氧化态）+ e 标记物再生：标记物（氧化态）+ 放大物（还愿态） --- 标记物（还原态）+ 放大物氧化产物 背景电流： 放大物（还原态）--- 氧化产物
生物芯片的电化学、光电化学检 测技术
一、电 化 学 检 测 系 统
电位型 电导型 电流型
问题：灵敏度（信噪比）不够高 原因：电极－溶液界面电容充放 电导致背景电流过大
R
-e +e
o
S
N
化学放大电 光电化学检测 化学检测Scribner公司的 MMA多通道分析仪
Xanthon公司的药物筛选系统 Motorola公司的eSensor芯片
化学放大电化学检测系统
电 极 电化学标记物
要求标记分子电极反应快、 要求电极反应速度快、生物 电位范围宽、易于制成薄层 兼容性好、易衍生化、稳定 生物检测模式 和图形化、材料便宜易得到， 性高，选择三联吡啶合钌 选择ITO导电玻璃。 （简记为 Ru）。 Ru-antibody
Antigen
化学放大物
液相芯片技术平 台应用面非常广泛: 因为乳胶微球上即可 以包被蛋白又可以加 上核酸，所以液相芯 片可以用来诊断蛋白 变化（免疫反应或酶 反应）也可以诊断核 酸变化（DNA或 mRNA）。

液相芯片技术平台具有高效性：因为上百种颜 色的乳胶微球可以方在同一个反应体系内，所 以一小份标本（血，或其它体液，组织）可以 被用来同时检测上百个生理或病理指标。液相 芯片技术平台具有高敏感性：每个乳胶微球上 都可以满满地（以共价键牢固结合的方式）包 被上抗原、抗体、或核酸。因为探针密度高， 产生的信号强，加上使用荧光检测，所以敏感 性大大高于任何现有分析、诊断方法，也高于 其它芯片法。
光源：2路He激光，红光632.8nm，功率10mw 2路Nd:YAG激光，绿光532nm，功率10mw 多种染料：Cy3，Alexa 532，Cy5，BODIPY 探测灵敏度：10荧光分子/微米2 探测范围：直径几十微米－几毫米
CCD检测系统构架
系统组成包括：扫描仪硬件设备、扫描仪控制处理单元、 图像采集卡、通用PC机和软件系统
样品制备 芯片设计 芯片制备 杂交反应 信号检测 数据提取与分析 生物信息学分析
荧光标记检测 表面等离子体共振 化学发光检测 电化学检测 磷屏成像系统
生物芯片的检测方法
两大类型：物理检测方法、化学检测方法 1. 荧光扫描显微检测方法 2.激光共焦扫描检测方法 3.CCD(Charge Coupled Device)成像扫描 检测方法 4.化学发光检测方法 5.电化学发光检测方法 6.表面等离子体共振吸收检测方法 8.磁光检测方法 9.纳米技术
LuxScanTM 10K PMT 80 Power 80
ScanArray Express PMT 80 Power 80
分辨率测试
LuxScan 10K 50um分辨率
LuxScan 10K 20um分辨率
LuxScan 10K 10um分辨率
LuxScan 10K 5um分辨率
CCD成像激光扫描检测系统
液态芯片技术（xMAP 技术）
Flexible Multi-Analyte Profiling 多组分分析
液相芯片技术
液相芯片技术是二十一世纪初诞生 的后基因组时代产品的杰出代表，液相 芯片技术平台是既能保证信息质量，又 能提供相对高通量的新一代分子诊断技 术平台， 这个技术平台整合了生物检测， 乳胶微球荧光编码，微液体传送系统， 激光实时记录，先进电脑软件和数据处 理模式等多种先进技术。
光电化学电极的制备
磁控溅射TiO2
改变工艺条件和退火 处理可以有效改善电 极的光电响应
空白TiO2电极
Ru染料吸附的TiO2电极
光电化学电极的制备
磁控溅射TiO2
空白TiO2电极 IgG-Ru吸附的 TiO2电极
Avidin-Ru吸附的 TiO2电极
空白TiO2电极
Sol-gel法制备纳米晶膜
CCD 快门 滤光片
分光镜
目镜
耦合透镜
光纤 准直透镜
双激Βιβλιοθήκη Baidu诱导荧光检测系统
XY双向运动平台
CCD 快门 滤光片
激光共焦扫描
信号放大 光电倍增管 针孔滤波器 激光器635nm 荧光会聚透镜 滤波片 A/D采样
分光镜
目镜
耦合透镜
光纤 准直透镜
耦合透镜 分光镜2 衰减器 光纤 准直透镜 快门 滤光片 物镜 D/A转换 CPU 10M网线
特点: 1)以CCD相机作为信号接收器而不是光电倍增管， 因而无需扫描传动平台; 2)由于不是逐点激发探测，激发光照射整个芯片区 域; 3)由CCD相机直接获得整个DNA芯片的杂交谱型.
CCD成像面扫描检测仪
原理：CCD面扫描方式
CCD
会聚镜 滤光片 准直镜 衰减器 聚焦镜 芯片 载物台 滤光片
CCD成像扫描检测系统
要求背景电流低，水溶性 好，在水中稳定，排除安 全，选择草酸钠（10mM, pH 5.5)。
Biotin-antibody 检测分析仪器
包括信号发生器、数据采集 ITO电极 系统、恒电位电路等单元。 CHI 630A 单通道台式分析 仪---便携式多通道分析仪
Avidin
系 统 设 计
常用电极

液相芯片技术平台是既能保证信息质量， 又能提供相对高通量的新一代分子诊断 技术平台, 这个技术平台整合了生物检测， 乳胶微球荧光编码，微液体传送系统， 激光实时记录，先进电脑软件和数据处 理模式等多种先进技术。
液相芯片技术的特点
1、多功能性。xMAP 技术不仅能够检测核酸（DNA和 RNA），还能够检测蛋白（抗体和抗原，受体和配 体）。多任务性的能力使xMAP 技术特别适合在各种水 平做鉴别诊断。 2、高敏感性。每一个微球体偶联了成千上万的探针，因 而它能捕获更多的扩增的病原靶产物。它最少能够检 测到0.2μL的PCR产物，而采用常规的典型胶分析的方 法需要超过10μl的PCR产物。所以xMAP方法的检测灵 敏度可以比凝胶电泳法高50倍。 3、特异性。两束激光分别分析杂交信号（敏感性）和乳 胶微球上荧光颜色（特异性），而且激光只分析微球 一定半径内的信息，所以检测特异性强，背景低。
PMT 滤波 信号 放大
D/A 转换
DSP
A/D 转换
运动控制系统
步进电机 驱动器 步进电机 驱动器 交流侍服 驱动器 步进电机 驱动器 解 码 位置 计数 调焦电机 控制 X 轴电机 控制 Y 轴电机 控制 二向色镜 电机控制 使 能 急 停 异 常 控 制
DSP
激光共聚焦扫描仪
信噪比/线性度测试
XY双向运动平台
CCD成像激光扫描
XY双向运动平台
CCD成像激光扫描检测
双激光诱导荧光检测系统工作原理 配有四台激光器用来诱导相应的波段的染料激发荧 光。系统采用纤维光路，样片放在显微镜物镜的物面上 ，激发DNA样品产生荧光，经过滤波后汇聚到CCD的光敏 探测平面（显微镜物镜的像面上），然后被放大输入计 算机，实现样品的荧光探测。
生物芯片检测技术
检测目的
采用荧光、生物素或其它方法标记固定在生物芯片基 片上的生物分子（如DNA、RNA、蛋白分子、抗原、抗体等 ）目标，并通过构建一些特殊的检测装置将标记信号转化 成可供分析处理的图象数据，以便获得及分析在生物芯片 上的生物分子的生物物理化学等各种信息，诊断生物分子 的真实状态。 将不可见的生物分子微弱变化通过生物、化学、光学 、电子等多学科交叉技术的综合处理，转换成可见的数字 图象信号，实现信号的放大、增强和可视化，以便进行研 究、疾病诊断分析或其它应用。
4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
弱信号 线性度
自制扫描仪
Scanner array
Scanner array 自制扫描仪
LuxScan vs ScanArray

液相芯片的核心技术是把微小的乳胶微球分别 染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针 在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而 液相芯片则是用颜色来编码）。应用时，把针 对不同检测物的乳胶微球混合后再加入微量待 检测或分析标本，在悬液中与微粒进行特异性 地结合。结合的结果可以在瞬间经激光判定后 由电脑以数据信息的形式记录下来。因为分子 杂交是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，所 以又有“液相芯片”之称。
生物芯片信号检测技术
光学信号
荧光检测
化学发光检测 表面等离子体共振检测 纳米检测 磁光检测
电信号检测优势
仪器结构简单、成本低 容易微型化，便于携带 响应快速、灵敏 功耗低、便于现场使用 芯片与仪器连接方便
电学信号
电化学检测
光电化学检测
质量信号
石英晶体微天平检测
电化学和光电化学检测技术 激光共聚焦、CCD扫描技术 液态芯片检测技术
PMT激光共聚焦扫描仪

主要优点
1）可以在荧光标记分子与DNA芯片杂交的同时进行 杂交信号的探测 ，无需清洗掉未杂交分子，从 而简化了操作步骤，大大提供了工作效率。 2）根据共聚焦原理，PMT只能接收通过探测针孔的 光，而来自生物芯片其他部位的杂散光因在探测 针孔处不能成像而被滤除，结果可得到一个高分 辨力和高对比度的图像。
标记物
氙灯专用 要求激发态寿命长、激发态 稳压电源 能级与半导体能带匹配，易 衍生化，稳定性高，分子不 太大。选择Ru(bpy)3 的衍 垂直出射 生物。 单色仪
电 极
光 源
要求背景电流低、水溶性好、 波长为470nm的单色光源。 CHI800 在水中稳定、排除安全，能 （内设电解池） 电化学工作站 光电流检测仪 快速还原标记物氧化态。选 择草酸钠 CHI 800单通道电化学 （10 mM,pH 5.5）。 工作站
600 500 400 300 200 100 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29
背景 噪声
60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29
全程 线性度
商品化ITO玻璃（溅镀） 扫描电镜照片
ITO纳米晶膜
生物芯片的激光共聚焦扫描技术
激光共聚焦扫描仪的主要优点
PMT(PhotoMultiplier Tube)器件的分辨率比 CCD器件要高；并且，根据共聚焦原理， PMT只能接收通过探测针孔的光，而来自 生物芯片其他部位的杂散光因在探测针 孔处不能成像而被滤除，结果得到的是 一个高分辨力和高对比度的图像。
电屏蔽 暗箱
光电化学电极的制备
磁控溅射SnO2
①
②
光电化学检测SnO2电极上的Biotin-avidin反应
①空白SnO2电极和②直接吸附Ru染料的SnO2电极 光电化学i-t曲线 BSA
光电化学电极的制备
磁控溅射TiO2
染料三有最大光 电响应，但其值 却比SnO2电极对 应值小得多
五种标记物在溅镀二氧化钛电极上的光电化学i-t曲线
草酸钠对Ru的电化学反应有比较明显的放大作用
光电化学检测原理
特点: 输入光，输出电;信号放大。优势: 灵敏度高；成本低于光检测
光电化学检测系统结构
电 极
宽禁带半导体、与标记物能 灯箱、镜筒及 级匹配、表面积大、易于制 机械调节部分 成薄层和图形化、还原剂电 流低。选择SnO2，TiO2。
500W氙灯及 光学透镜组部分