从发酵液中提取青霉素第一组
青霉素的提取与纯化[发明专利]
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[19]中华人民共和国专利局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1110686A[43]公开日1995年10月25日[21]申请号94116070.X [22]申请日94.9.22[71]申请人天津大学地址300072天津市南开区卫津路92号[72]发明人李十中 [74]专利代理机构天津大学专利代理事务所代理人曲远方 张强[51]Int.CI 6C07D 499/18权利要求书 1 页 说明书 3 页[54]发明名称青霉素的提取与纯化[57]摘要本发明属于有机化合物的分离。
在青霉素发酵液的溶剂萃取工艺中不引入任何表面活性剂，采用切割分子量20000及以下的超滤膜对该发酵液或其过滤后的滤液进行超滤处理，纯化滤液，透过液的青霉素萃取过程可在生产中使用任意萃取设备一次完成青毒素的提纯和浓缩过程，萃取液用无盐水洗涤，进一步纯化萃取液。
94116070.X权 利 要 求 书第1/1页 1、一种有机化合物的分离工艺，本发明的特征在于使用切割分子量(MWCO)20000及以下的超滤膜对青霉素发酵液预处理过滤后的滤液，或直接对发酵液进行超级过滤，纯化滤液，透过液的青霉素萃取过程可在生产中使用的任意萃取设备中一次完成青霉素的提纯和浓缩过程，萃取液用无盐水洗涤，进一步纯化萃取液。
2、根据权利要求1所述的有机化合物分离工艺，其特征在于超级过滤是在5～30℃，0.1～0.5MPa的条件下进行的。
94116070.X说 明 书第1/3页青霉素的提取与纯化本发明属于有机化合物的分离。
青霉素的提纯在已有技术中有报导，从发酵液中提取青霉素，有活性碳吸附法、沉淀法、离子交换法、溶媒萃取法等方法。
目前普遍采用溶媒萃取法，是将有机溶媒与青霉素发酵液预处理过滤的滤液混合，通过调节PH值使青霉素由水相转入溶媒，达到提纯和浓缩的目的。
该方法有以下几种：将青霉素由滤液通过Podbielniak萃取机一步萃取到溶媒中的一步萃取法（prensive Biotchnology.ed.M.Mooy oung.vol.3.P28-29 Pergamon press New York，1985）;将青霉素由滤液提入溶媒，转入缓冲液，再由缓冲液提入溶媒相的三步提取法（俞文和等，《抗生素工艺学》，辽宁科学技术出版社，P227（1988年）;将青霉素提入溶媒后直接进行共沸结晶的一次萃取共沸结晶法（俞文和等，《抗生素工艺学》，辽宁科学技术出版社，P196-197（1988年））;对青霉素发酵液直接使用倾析器进行萃取的直接萃取法（俞文和等，《抗生素工艺学》，辽宁科学技术出版社，P227（1988年））。
青霉素的提取工艺
化学式
青霉素 化学本质：盐酸巳氨西林。其化学名 为1-乙氧甲酰乙氧6-〔D(-)-2-氨基-2-乙 酰氨基〕青霉烷酸盐酸盐。 分子式：C16H18N3O4S· HCl 分子量：384.5 青霉素它丌能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所 产生的酶，易被其破坏，且其抗菌谱较窄， 主要对革兰氏阳性菌有效。青霉素G有钾盐、 钠盐之分，钾盐丌仅丌能直接静注，静脉滴 注时，也要仔细计算钾离子量，以免注入人 体形成高血钾而抑制心脏功能，造成死亡。
[10] Ren Z Q, Zhang W D, Li H S, et al. Mass transfer characteristics of citric acid extraction by hollow fiber renewal liquid membrane[J].Chem Eng J, 2009, 146: 220-226
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参考文献：
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中空纤维更新液膜提取工艺流程图：
采用中空纤维更新 液膜实现了从发酵滤 液中同步分离和富集 青霉素的新型提取工 艺 以碳酸钾溶液作为 接收相，DOA（二辛 胺）+异辛醇+煤油作 为有机相，在常温条 件下提取模拟发酵滤 液中的青霉素
如图所示，采用中空纤维更新液膜技术 提取青霉素G，由于中空纤维更新液膜的传 质强化作用，可在实验进行到90min时实现 液膜过程的逆浓度梯度传递，传质速率较快， 实验结果所用时间较长是为了避免壳程非理 想流动等情况的影响，所用膜器的尺寸较小， 填装因子较低，传质面积较小，仅为 5.48˟ ² ，若采用长1m，内径0.1m的商 10̄ m² 用中空纤维膜器，传质面积可高达60m² ，则 可极大地提高处理速率。
青霉素的提取
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3、萃取设备 （5）混合槽或静态混合器
国内大多数厂家是用混合槽或静态混合器进行混合萃取,再用碟片 式离心机进行分离。这种装置结构复杂,拆洗困难,特别是由于离心 分离过程中蛋白质和固体杂质的沉积,需要天天进行拆洗,十分不便。
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青霉素的提取与工艺
4 青霉素提取工艺条件
（1） 温度、酸度对青霉素稳定性的影响
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2、新提取方法的研究 （2） 反胶团萃取
反胶团是近年来新的生物活性物质分离、提纯方法 一方面,由于 pH对萃取率影响不大,可以在较高的pH条件下操作,另一方面,可以 利用离子强度的变化将杂蛋白去除。反胶团萃取已经在某些生物 产品的提纯上得到应用,但是要用于青霉素这样的大处理量、低附 加值的产品生产,还很困难
膜 分 离 器 具 21
膜分离原理
青霉素的提取与工艺 3、萃取设备
（1）波式离心萃取器 （2）倾析机 （3）环隙式离心萃取器 （4）排渣式离心分离机 （5）混合槽或静态混合器
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3、萃取设备 （1）波式离心萃取器
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3、萃取设备 （2）倾析机
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3、萃取设备 （3）环隙式离心萃取器
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不同 pH时石油亚砜-煤油体系的萃砜
亚 砜 萃 取 相 关 酶 反 应
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反萃取过程中的乳化问题
溶剂萃取法从发酵液中萃取青霉素已有五十余年的历史。但其 萃取工艺基本没有改变: 所用的萃取剂主要是乙酸丁( 戊) 脂, 甲基异丁酮等。萃取操作条件为: p H 1.8一2. 2, 有机相与水 相体积比O⁄A꞊ 2/ 1, 反萃PH .6 7 一.7 2 , 相比O⁄A꞊ 2/ 1。 在其萃取过程中有以下两个特点: ①青霉素易被破坏,在pH 4 一8 范围内相对较稳定, 在PH 4< 或p H >8 皆易分解。在 PH 2.0,10 摄氏度下, 青霉素的半衰期为1.3小时, 萃取要在 很短时间内完成。② 由于发酵液中含有大量蛋白质、有机色 素及其他生物副产品, 所以萃取过程中乳化严重。而且采用离 心办法也很难将乳化消除, 需要使用破乳剂。
青霉素提取工艺
青霉素的提取工艺青霉素(Ｂenzylpenｉcillin / Penｉciｌliｎ）又被称为青霉素G、peｉｌliｎG、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。
青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。
青霉素类抗生素是β－内酰胺类中一大类抗生素的总称。
(图1.青霉素分子式）化学特性青霉素又称盐酸巴氨西林。
其化学名为1-乙氧甲酰乙氧6-〔D（-)－２－氨基-2-乙酰氨基〕青霉烷酸盐酸盐。
是一种有机酸,性质稳定,难溶于水。
可与金属离子或有机碱结合成盐，临床常用的有钠盐、钾盐。
青霉素盐如青霉素钾或钠盐为白色结晶性粉末,无臭或微有特异性臭,有引湿性。
干燥品性质稳定,可在室温保存数年而不失效，且耐热。
遇酸、碱、重金属离子及氧化剂等即迅速失效。
极易溶于水,微溶于乙醇,不溶于脂肪油或液状石蜡。
其水溶液极不稳定,在室温中效价很快降低1０%，水溶液ｐH为5．5～７.5。
青霉素价格较为便宜，因而也证明了生产并提取青霉素是有着较为成熟的工业方法的。
(图2青霉素的售价）青霉素的提纯青霉素提纯工艺流程简图:（图３)因为青霉素水溶液不稳定,故发酵液预处理、提取和精制过程要条件温和、快速,防止降解。
在提炼过程中要遵循下面三个原则：错误!时间短错误!温度低错误!pＨ适中１.预处理发酵结束后,目标产物存在于发酵液中,浓度较低，只有10－３０kg/m３，并且含有大量杂质，如高价无机离子(Ca,Mg,Ｆe离子）,菌丝,未用完的培养基，易污染杂菌,产生菌的代谢产物,蛋白质等。
因此必须对其进行的预处理，其目的在于浓缩目的产物，去除大部分杂质，利于后续的分离纯化过程，是进行分离纯化的第一个工序。
2.过滤发酵液在萃取之前需预处理，可在发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白(比如明矾）,或者调解发酵液ｐＨ至蛋白质的等电点以沉淀蛋白,然后经真空转鼓过滤(以负压作过滤推动力)或板框过滤(浮液用泵送入滤机的每个密闭的滤室，在工作压力的作用下,滤液透过滤膜或其它滤材，经出液口排出,滤渣则留在框内形成滤饼，从而达到固液分离目的）,除掉菌丝体及部分蛋白。
一种从发酵滤液中提取青霉素的工艺[发明专利]
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[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1263097A[43]公开日2000年8月16日[21]申请号00100114.0[21]申请号00100114.0[22]申请日2000.01.11[71]申请人亓平言地址100084北京市清华大学东7－1－301[72]发明人苗勇 亓平言 [51]Int.CI 7C07D 499/18权利要求书 1 页 说明书 3 页[54]发明名称一种从发酵滤液中提取青霉素的工艺[57]摘要本发明涉及一种从发酵滤液中提取青霉素的工艺,该工艺为以青霉素发酵滤液为原料,用硫酸溶液调pH值,加入醋酸丁酯或醇类溶剂进行萃取,然后将萃取有机相进行洗涤,洗涤后的有机相与碱水用离心机进行三级反萃取,反萃液经丁醇共沸结晶、干燥后即为本发明的产品。
本发明改进了传统的工艺和设备,使之简化操作,提高收率,改善劳动环境。
00100114.0权 利 要 求 书第1/1页 1、一种从发酵滤液中提取青霉素的工艺，包括下列各步骤：(1)以青霉素发酵滤液为原料，用硫酸溶液调pH，加入醋酸丁酯或醇类混合溶剂进行萃取，滤液与溶剂相之比为2～5∶1，平衡pH值为2～3，操作温度为15℃～25℃；(2)将上述第一步的萃取有机相在室温下用离心机进行一级或二级洗涤，有机相与水之比为5～12∶1； 其特征在于，还包括：(3)将上述洗涤后的有机相与碱水在室温下用离心机进行三级连续逆流反萃取，平衡pH值为6.6～7.2，有机相与碱水之比为5～30∶1；(4)将上述反萃取液经丁醇共沸结晶、干燥，即为本发明的青霉素盐产品。
2、如权利要求1所述的工艺，其特征在于，其中所述的醇类混合溶剂为异辛醇，仲辛醇、正辛醇中的一种或两种以上与其他溶剂的混合溶剂。
3、如权利要求1所述的工艺，其特征在于，其中所述的碱水是碳酸钾、碳酸氢钾或碳酸钠、碳酸氢钠中的任何一种溶液。
4、如权利要求1所述的工艺，其特征在于，其中所述的离心机可以是环隙式离心萃取器、蝶片式离心机以及其他各类离心萃取器。
青霉素的发酵生产过程
7.1.1 菌种
目前国内青霉素生产菌按其在深层培养中 菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种，根据丝状 菌产生孢子的颜色又分为黄孢子丝状菌和绿孢子 丝状菌，常用菌种为绿孢子丝状菌，如产黄青霉 素。
7.1.3青霉菌的生长过程
分生孢子发芽期
菌丝繁殖期 脂肪粒形成期 菌丝生长期
脂肪粒减少，小空孢
大空孢 自溶 青霉素分泌期
菌丝自溶期
(1)菌体生长阶段：
发酵培养基接种后生产菌在合适的环境中经过短时间的 适应，即开始发育、生长和繁殖，直至达到菌体的临界浓度。
(2)青霉素合成阶段：
这个阶段主要合成青霉素，青霉素的生产速率达到最大， 并一直维持到青霉素合成能力衰退。在这个阶段，菌体重量 有所增加，但产生菌的呼吸强度一般无显著变化。
7.1.2 培养基
碳源：青霉菌能利用多种碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖等。 目前采用淀粉水解糖，糖化液进行流加。 氮源：可采用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸皮粉 等有机氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等无机氮源。 前体：为生物合成含有苄基基团的青霉素G，需要在发酵 中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它们对青霉菌有一定毒 性，故一次加入量不能大于0.1%，并采用多次加入方式。 无机盐：包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。铁离子对青霉 菌有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含量在30ug/mL以下。
补氮：硫酸铵、氨、尿素，使发酵液氨氮量控制在 0.01%~0.05%。前体：发酵液中残存乙酰胺浓度为 0.05%~0.08%。 （3）pH控制。6.6~6.4。 （4）温度。前期25℃ ~26℃ ，后期23℃ 。以减少后期发酵液 中青霉素的降解破坏。 （5）溶解氧。不低于饱和溶解氧的30%。
生物分离提取技术项目三：从发酵液中提取青霉素任务1制定提取工艺教案教学设
抗假单胞菌青霉素:如羧苄西林、哌拉西林、替卡西林等。
美西林及其酯匹西林:如美西林及其酯匹美西林等，其特点为较耐酶，对某些阴性杆菌(如大肠、克雷伯氏和沙门氏菌)有效，但对绿脓杆菌效差。
甲氧西林类:如坦莫西林等
四、学生制定流程图
五、归纳总结
教师引导学生总结主要知识点。
课程《生物分离提取技术》2022/2023 学年第1学期 教师课程组
授课日期
班 级
项目三：从发酵液中提取青霉素
任务1：制定提取工艺
任务2：发酵液的预处理
任务3：青霉素的提取及固液分离
任务4：青霉素的脱色
任务5：青霉素的结晶
任务6：青霉素的抽滤、洗涤和干燥
课 题：从发酵液中提取青霉素--制定提取工艺
教学目标：
六、布置作业
1.了解青霉素的分类。
2. 青霉素的提取工艺流程图。
分类
青霉素用于临床是40年代初，人们对青霉素进行大量研究后又发现一些青霉素，当人们又对青霉素进行化学改造，得到了一些有效的半合成青霉素，70年代又从微生物代谢物中发现了一些母核与青霉素相似也含有β-内酰胺环，而不具有四氢噻唑环结构的青霉素类，可分为三代:第一代青霉素指天然青霉素，如青霉素G(苄青霉素);第二代青霉素是指以青霉素母核-6-氨基青霉烷酸(6-APA)，改变侧链而得到半合成青霉素，如甲氧苯青霉素、羧苄青霉素、氨苄青霉素;第三代青霉素是母核结构带有与青霉素相同的β-内酰胺环，但不具有四氢噻唑环，如硫霉素、奴卡霉素。
知识目标：
1.了解青霉素的分类及分子结构。
2.掌握青霉素的理化性质。
能力目标：
1.能够参考资料在教师引导下制定出青霉素提取工艺流程，并学习绘制青霉素的工艺流程图。素质目标：
青霉素几种分离纯化方法比较
生物工程下游技术期末作业青霉素的分离提纯方法的发展与比较摘要：本文主要介绍了青霉素的分离提纯方法的发展以及比较，包括传统的方法，如吸附法，沉淀法，溶剂萃取法等，也包括现代发展的高新技术，如反胶团萃取法，乳状液膜法，中空纤维更新液膜法以及其它的高效提取方法。
Abstract：This paper describes the development of penicillin G and the comparison of methods of separation and purification , including traditional methods, such as adsorption, precipitation, solvent extraction, but also includes modern high-tech development, such as reverse micelles extraction, emulsion liquid membrane hollow fiber renewal liquid membrane extraction and other efficient methods.正文：1、青霉素简介1、1基本性质：青霉素（Benzylpenicillin / Penicillin）又被称为青霉素G、peillin G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。
青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。
青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。
分子式为：1、2发展历程：早在唐朝时，长安城的裁缝会把长有绿毛的糨糊涂在被剪刀划破的手指上来帮助伤口愈合，就是因为绿毛产生的物质（青霉素素菌）有杀菌的作用，也就是人们最早使用青霉素。
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项目三：制定方案
青霉素提纯工艺流程简图
预处理
发酵液中的杂质如高价无机离子Ca,Mg,Fe 离子）和蛋白质在离子交换过程中对提炼 影响甚大，丌利于树脂对抗生素的吸附。 对高价离子的去除，采用草酸或磷酸；对 于蛋白质，可利用其在等电点时凝聚的特 点将其去除。 目的：在于浓缩目的产物，去除大部分杂 质，改变发酵液的流变学特征，利于后续 的分离纯化过程。
共沸蒸馏结晶： 萃取液，再用0.5 M NaOH萃取， pH6.4-4.8下得到钠盐水浓缩液。加2.5倍 体积丁醇，16－26℃，0.67-1.3KPa下蒸 馏。水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结 晶析出。结晶经过洗涤、干燥后，得到青 霉素产品。
洗涤干燥得到晶体
反萃取
为了避免pH波动，采用硫酸盐、碳酸盐缓冲液 进行反萃。发酵液不溶剂比例为3－4。几次萃取 后，浓缩10倍，浓度几乎达到结晶要求。萃取总 收率在85％左右。所得滤液多采用二次萃取，用 10%硫酸调pH2.0~3.0，加入醋酸丁酯，用量为 滤液体积的三分之一，反萃取时常用碳酸氢钠溶 液调pH7.0~8.0。在一次丁酯萃取时，由于滤液 含有大量蛋白，通常加入破乳剂防止乳化。第一 次萃取，存在蛋白质，加0.05-0.1%乳化剂 PPB。 萃取条件：为减少青霉素降解，整个萃取过程应 在低温下进行（10 ℃以下）。萃取罐冷冻盐水冷 却。
脱色 萃取液中添加活性炭，除去色素、热 源，过滤，除去活性炭。
5.结晶
萃取液一般通过结晶提纯。青霉素钾盐在醋 酸丁酯中溶解度很小，在二次丁酯萃取液中加入 醋酸钾-乙醇溶液，青霉素钾盐就结晶析出。然后 采用重结晶方法，进一步提高纯度，将钾盐溶于 KOH溶液，调pH至中性，加无水丁醇，在真空条 件下，共沸蒸馏结晶得纯品。 直接结晶：在2次 乙酸丁酯萃取液中加醋酸钠－乙醇溶液反应，得 到结晶钠盐。加醋酸钾－乙醇溶液，得到青霉素 钾盐。
情景三
从发酵液中提取青霉素
项目一：前期准青霉素G、 peillin G、 盘尼西林、配尼西林、青霉素 钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。 青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培 养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏 细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀 菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗 人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是β内酰胺类中一大类抗生素的总称。
理化性质
青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生 素的总称，由于β-内酰胺类作用于细菌的细胞壁， 而人类只有细胞膜无细胞壁，故对人类的毒性较 小，除能引起严重的过敏反应外，在一般用量下， 其毒性丌甚明显，但它丌能耐受耐药菌株（如耐 药金葡）所产生的酶，易被其破坏，且其抗菌谱 较窄，主要对革兰氏阳性菌有效。
过滤
真空转鼓过滤或板框过滤，除掉菌丝 体及部分蛋白。青霉素易降解，发酵液及 滤液应冷至10 ℃以下，过滤收率一般90% 左右。
萃取
青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉 素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易 溶于水。利用这一性质，在酸性条件下青 霉素转入有机溶媒中，调节pH，再转入中 性水相，反复几次萃取，即可提纯浓缩。 选择对青霉素分配系数高的有机溶剂。工 业上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取2－3次。 从发酵液萃取到乙酸丁酯时，pH选择1.82.0，从乙酸丁酯反萃到水相时，pH选择 6.8-7.4。发酵滤液不乙酸丁酯的体积比为 1.5-2.1，即一次浓缩倍数为1.5-2.1。
结构式
球棍式
青霉素药理作用：干扰细菌细胞壁的 合 成。青霉素的结构不细胞壁的成分粘肽 结构中的D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可不后 者竞争转肽酶，阻碍粘肽的形成，造成细 胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏 障，对细菌起到血症、肺炎、脑膜炎、扁桃 体炎、中耳炎、猩红热、丹毒、产褥热，破伤风、 气性坏疽、炭疽、白喉、流行性脑脊髓膜炎、李 斯特菌病、鼠咬热、梅毒、淋病、雅司、回归热、 钩端螺旋体病、奋森咽峡炎、放线菌病等。在风 湿性心脏病或先天性心脏病病人进行口腔手术或 牙科操作，胃肠道和生殖泌尿道手术或某些操作 时，青霉素也可用于心内膜炎的预防。