农杆菌感受态制备与转化
农杆菌感受态细胞的制备及转化
农杆菌感受态细胞的制备及转化、浸润烟草1）挑取农杆菌单菌落于3 ml Sm（1000倍稀释）抗性的LB液体培养基中，28o C振荡培养过夜；2）取过夜培养菌液500μl加入到50ml的Sm抗性的LB液体培养基中，28o C振荡培养至OD600为0.5；3）5000rpm离心5min，倒掉培养液；4）加入10ml 0.15M NaCl悬浮农杆菌细胞，5000rpm 5min；5）倒掉上清，加入1ml 预冷的20mM CaCl2悬浮细胞，冰浴24h内使用，或者分装成每管200μl，液氮中速冻，保存于-70 o C备用。
取200μl感受态细胞，加入1ug质粒DNA，液氮中速冻1min，37o C水浴5min，加入1ml LB，28o C慢速振荡培养4－6h后，涂布于含有相应抗生素的固体培养基平板上，28o C 培养约48h。
挑取平板上长出的单菌落，接种于LB液体培养基（含有50μg/ml Kan和100μg/ml sm）中，28℃振荡培养过夜，碱裂解法小量提取质粒DNA，进行PCR及酶切鉴定。
用于浸润的菌液制备MMA buffer：10mmol/L MgCl2(95.21)，10mmol/L MES(195.23)，100μmol/L 乙酰丁香酮(196.20)（Acetosyringone）(MgCl2 :2g MES :2g 乙酰丁香酮:50ul)1）取单菌落接种于3ml LB（含有50μg/ml Kan和100μg/ml SM）培养基中28℃振荡培养过夜；2）取1ml活化后的菌液接入50ml LB（含有50μg/ml Kan和100μg/ml SM）中，28℃振荡培养至合适浓度OD600约0.8-1.0；3）4℃，4000rpm离心15min，沉淀用MMA buffer重悬，菌液终浓度为OD600约1.0-2.0；4）室温静置2hr以上，用1ml注射器对合适苗龄的本生烟进行浸润。
农杆菌感受态制备转化
农杆菌感受态制备转化
农杆菌感受态制备
1、划平板，单克隆培养
2、放单克隆于5mllb培养基中，挥至饱和状态（1-2day）
3、50m离心管中4500rpm，15min
4、50ml菌体用1ml氯化钙（预冷）悬浮，冰上操作
5、每100ul分装于冷冻管中，
液氮速冻后，-70℃保存
农杆菌转变
1．50ul感受态+5ul质粒，放入液氮速冻2min2．37℃热激5min
3.提1mllb，28℃培育3-4h
3.8000rpm/min去上清，200ullb悬浮，涂板吹干农杆菌抗性：利福平+庆大霉素+载
体抗性。
（gv3101）庆大霉素40mg/ml（0.4g/10ml）；利福平50mg/mldmso溶解
200mllb+200ul母液
农杆菌转回植物
1.植物去顶三天后转化，转前一天交足水
2.摇菌od600=1.2~1.6（先大挥后，挑200ul小挥200ml）
3.室温5000rpm，15min，弃上清，悬浮于等体积渗透培养基中（200ml/转化）每
1000ml渗透培养基：1/2ms2.42g；蔗糖50g；mes0.5g；用1mkoh调ph到5.8/5.7，定容
到1000ml，加10ul1mg/ml6-ba，加200ulsilwetl-7，混匀，将菌液悬浮，od=0.8左右。
不得低于0.7.
4.将菌液放入大平皿中，植株煮沸20s砌上白盆，过夜后掀开正常培育。
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤一、目的及要求了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
二、实验原理在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。
感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。
农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。
将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。
制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。
三、实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株试剂：YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌；链霉素（Sm）储液：125mg/ml0.15 N NaCl，高压灭菌。
20mM CaCl2，高压灭菌。
四、实验步骤1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜；2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5；3. 5000rpm, 离心5min；4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min；5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。
农杆菌感受态制备和转化：电转法和热击法
农杆菌感受态制备和转化：电转法和热击法电转法1）挑取新鲜单菌落接种到10mL YEP培养基（含50ug/ mL利福平）的试管里，28℃、200r/min培养过夜。
2）稀释2 mL培养过夜的农杆菌到含200 mL YEP培养基的500 mL三角瓶里，28℃、200r/min培养至OD600达0.5。
4℃、5000 r/min离心5分钟收集细胞。
3）用适量体积的 10%的甘油（用去离子水配置）重悬洗涤沉淀2次，洗涤时一定要轻柔地把细胞悬均匀，每次4℃、5000 r/min离心5分钟收集细胞，小心将上清倒掉。
4）将细胞重悬于1 mL 10%的甘油里，细胞可以立即使用，也可分装成每管40μL（质粒连接产物体积不能超过感受态细胞体积的1/10，否则容易爆杯），经液氮速冻后，-70℃冰箱保存备用。
5）取一管感受态细胞放在冰上融化，加入100ng DNA样品混匀，将样品放入冰上的电击杯中，按照电击仪厂商说明进行电击转化，之后涂布在含有相应抗生素的YEB平板上培养（质粒抗性+农杆菌菌株抗性）。
热击法1）挑单菌落于2 mL YEP培养基（含Rif 50mg/ mL）中28℃过夜活化；2）取2 mL过夜菌液接种于200 mL YEP培养基中28℃振荡培养生长至OD600约等于0.5左右；3）冰上放置30 min左右，5000 rpm离心5 min；4）在60 mL冰水浴预冷的无菌0.1M CaCl2溶液中中悬浮细胞；5） 5000 rpm离心5 min，悬浮细胞加入20 mL冰水浴预冷的含15%甘油的0.1M CaCl2，轻敲管壁使菌体悬浮均匀，每管200 µL 进行分装，液氮速冻后保存于-80℃待用；6）取200 µL感受态细胞，加入0.5 µg质粒DNA，液氮中速冻5 min，37℃水浴热击5min，之后迅速置于冰水浴中冷却2 min，然后加入1 mLYEB 空白培养基，28℃低速振荡培养4 hr；7） 6000 rpm离心2 min，弃部分上清，留约200 µL溶液，重悬细胞，涂布于含有相应抗生素的YEB 平板上，28℃倒置培养约36 hr。
农杆菌感受态制备转化
农杆菌感受态制备
1、划平板，单克隆培养
2、挑单克隆于5ML LB培养基中，摇到饱和（1-2day）
3、50m离心管中4500rpm，15min
4、50ml菌体用1ml氯化钙（预冷）悬浮，冰上操作
5、每100ul分装于冷冻管中，液氮速冻后，-70℃保存
农杆菌转化
1．50ul感受态+5ul质粒，放入液氮速冻2min
2．37℃热激5min
3. 加1mlLB，28℃培养3-4h
3. 8000rpm/min去上清，200ulLB悬浮，涂板吹干
农杆菌抗性：利福平+庆大霉素+载体抗性。
（GV3101）
庆大霉素40mg/ml （0.4g/10ml）；利福平50mg/ml DMSO溶解
200ml LB + 200ul母液
农杆菌转植物
1.植物去顶三天后转化，转前一天交足水
2.摇菌OD600=1.2~1.6 （先小摇后，取200ul大摇200ml）
3.室温5000rpm，15min，弃上清，悬浮于等体积渗透培养基中（200ml/转化）
每1000ml渗透培养基：1/2 MS 2.42g；蔗糖50g；MES 0.5g；用1M KOH调PH到5.8/5.7，定容到1000ml，加10ul 1mg/ml6-BA，加200ul silwet l-7，混匀，将菌液悬浮，OD=0.8左右。
不得低于0.7.
4.将菌液倒入大平皿中，植株浸泡20s盖上白盆，过夜后揭开正常培养。
质粒转化农杆菌感受态制备
质粒转化农杆菌感受态制备感受态制备1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif或Str；EHA105：Rif或 Str；GV3103：庆大霉素。
如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。
使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌：1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）。
农杆菌感受态制备转化
农杆菌感受态制备转化
农杆菌感受态制备
1.平板，单克隆培养
2、挑单克隆于5mllb培养基中，摇到饱和（1-2day）
3、50m离心管中4500rpm，
15min
4.用1ml氯化钙（预冷）悬浮50ml细菌，并在冰上操作。
5.每100微升分装在冷冻
管中。
用液氮快速冷冻后，将其储存在-70℃下
农杆菌转化
1.50ul活性质粒+5ul质粒，置液氮中速冻2min，
2.37℃热休克5min
3.加1mllb，28℃培养3-4h
3.8000rpm/min去除上清液，用200ullb悬浮，吹干涂布板。
农杆菌耐药性：利福平+庆大霉素+携带者耐药性。
（gv3101）庆大霉素40mg/ml（0.4g/10ml）；利福平50mg/ml
二甲基亚砜溶解200mllb+200ul母液
农杆菌转植物
1.打顶后三天进行改造，前一天送足够的水
2.摇菌od600=1.2~1.6（先小摇后，取200ul大摇200ml）
3.室温5000rpm，15min，丢弃上清液并将其悬浮在等体积渗透介质中（200ml/转化）：1/2ms2/1000ml渗透介质42g；蔗糖50g；梅斯0。
5g；用1mkoh调节pH至5.8/5.7，定容至1000ml，加入10ul 1mg/ml 6-BA和200ul SIL wetl-7，充分混合，以OD=0.8左右悬
浮细菌溶液。
不少于0.7
4.将菌液倒入大平皿中，植株浸泡20s盖上白盆，过夜后揭开正常培养。
实验三农杆菌感受态细胞制备及转化
农杆菌感受态
感受态细胞（competent cell)是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态.
重组DNA要导入宿主细胞，其生理状态很重要，需要将细胞进行特 殊处理，使细胞膜透性发生暂时性改变，成为容易接受外源DNA分 子的状态，即成为感受态细胞。
电击法， CaCl2法。 不同的转化方法需制备不同的感受态。 CaCl2法制备感受态：正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶
农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件 下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状 根。
根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植 物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆 菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的TDNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后 通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 特点：操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
• 4℃，5 000 rpm离心5 min, 弃上清，收集菌体 D E • 菌体重悬于4ml冰预冷的20 mM的CaCl2中，冰浴10-20 min
• 4℃，5 000 rpm离心5 min，弃上清 F
• 菌体重悬于1ml冰预冷的20 mM的CaCl2，分装100µl/管，24 h内使用或液氮速冻 G 后-70 °C保存
感受态细胞制备及转化中出现的问题
感受态长期保存要进行速冻，立即用-80 ℃冰箱或液氮速冻，而在使用 时，用37 ℃水浴或手掌体温进行速融，避免冰晶形成过程对细胞造成的 伤害，导致细胞破损不能存活。 感受态细胞不能反复冻融。 涂板后时间过长会有假阳性转化子的出现，抗生素在37℃过夜后失活， 抗生素作用是抑制未转化的感受态细胞生长，而不能将这些细胞杀死， 所以涂板后无单菌落出现，出现长满板的情况为抗生素失活。
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农杆菌感受态制备与转化
普通农杆菌感受态制备与转化：方案一
1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。
2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。
3. 5k rpm离心5分钟。
4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。
5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。
如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。
6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。
7. 液氮中冷冻1分钟。
8. 37℃水浴溶化细胞。
9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。
10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。
11. 涂板，28℃培养2-3天。
电转农杆菌感受态细胞制备与转化方案二
1．挑取单克隆接种于2mlYEP（含50mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜。
（如用5mlYEP，需培养36h）
2．将菌液按1:100转移至200mlYEP（含50mg/l链霉素）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD=0.3(约4~5h)。
3．转入50ml的无菌离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。
4．用20ml冰浴的HEPES(1mM，PH-7.0)重悬。
5．4℃，4000rpm离心10min，弃上清。
6．重复4、5步骤2~3次。
7．用2ml冰浴的10％甘油重悬。
8．每管100μl分装于1.5ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。
1mM HEPES的配制：称取0.119gHEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌后待用。
注：HEPES需现用现配。
电击法转化农杆菌感受态细胞
1．取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。
2．加2μl质粒DNA于100μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。
3．取出细胞与质粒的混合物转入电击杯中(电击杯-20℃预冷)，
在2500V高压下电击。
4．取出电击杯，加入500μl预冷的YEP培养液(不含抗生素)，轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h。
5．取30-40μl菌液涂在含相应抗生素的YEP平板上，28℃倒置培养1.5~2d。
注：
1．细胞与质粒的混合物应沿槽壁慢慢加入电击杯中，避免产生气泡。
2．电击前擦干电击杯外侧。
3．涂板菌液量可根据菌液浓度作调整。
农杆菌的感受态制备和转化方案三
曾做过1年的农杆菌，下面为我采用的农杆菌感受态制备和转化方法，供参考：
农杆菌感受态细胞的制备
(l)将农杆菌接种于5一10mlYEB液体培养基中(Str 100mg/L)，28℃震荡过夜。
(2)取lml活化的菌液接种于50ml含有抗生素的YEB培养基中，同样条件下培养至OD600值为0.4一0.5左右。
(3)将菌液冰浴30min后，装至50ml离心管中。
(4)4℃，5000g离心10min，收集菌体。
(5)弃上清，用lml 20mmol/L的冰预冷CaCl2重悬沉淀，并加入0.5ml，80%的甘油，混匀。
(6)按每管200ul分装，液氮速冻后于一70℃保存。
冻融法转化土壤农杆菌
(l)取1ug载体DNA加到200ul冰上溶化的感受态细胞中，轻混，冰浴30min。
(2)液氮中速冻5min，37℃水浴5min，再迅速冰浴2min。
(3)加入800ul YEB液体培养基，28℃轻摇4一6hr。
(4)取50一200ul菌液涂布于YEB选择平板上（含有相应的抗生素），28℃倒置培养2天。