第八章 高效液相色谱法

8— 4


各类高效液相色谱法及其固定相、流动相
按固定相的聚集状态： LSC、 LLC
按分离原理： 吸附色谱法、分配色谱法 离子交换色谱法、空间排阻色谱法 其他色谱类型：亲和色谱法、手性色谱法 胶束色谱法、电色谱法


常见色谱类型： 一、化学键合相色谱 二、液固吸附色谱法 三、液液分配色谱法
一、液固吸附色谱法（LSC）
1）储液瓶 惰性材料制成，坚固，易清洗，有足够的容积，滤棒/膜过滤器， 可滤去颗粒状物质 2）脱气装置： 氦气脱气，超声脱气， 真空脱气，在线脱气（膜过滤器）。 3）高压输液泵 • 主要部件之一，压力：150~350MPa • 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相(<10um)，液体的流动相高 速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特 点之一。 • 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调，耐腐蚀等特点
n理 (

) 2 5.54(
neff
' ' t t ( ) 2 16( R ) 2 5.54( R ) 2 W W1 2
tR '
H eff L / neff
neff/n理 = (tR’/tR)2 = {tR’/[tM(1+k)]}2 = [k/(1+k)]2
neff k 2 n理 ( ) 1 k
经典LC 用途 柱内径 固定相粒径 柱效 流动相的输送 分离混合物 1~15 cm 不均匀，>100μm 低（H↑，n↓） 1~6 mm 球形，均匀，<10μm 高（H↓，n↑） HPLC 分离、分析混合物
常压（重力或毛细作用） 高压（高压泵）分Leabharlann 周期能否在线检测长
否
短
能
二、HPLC与GC的异同
相同点：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象、流动相以及操作条件
dp 2 C Dm
Dm
T

dp C H ，n 柱效
Dm H ，n 柱效
T Dm C ，但易产生气泡 T Dm ， ，柱阻
3、HPLC降低板高、提高柱效的方法 1）采用小粒度、颗粒均匀的球形固定相，首选化学 键合相； 2）用低黏度的溶剂作流动相； 3）流动相采用低流速（1mL/min）； 4）适当提高柱温，25—30º C。
2）涡流扩散项（多径扩散项）：A
产生原因：载气携样品进柱，遇到来自固定相颗粒的阻力 → 路径不同→涡流扩散
涡流扩散系数 A 2 dp
— 填充不规则因子
dp — 填充颗粒直径
讨论：
，dp A H n 柱效
，dp A H ，n 柱效
3）荧光检测器（FD）：只能分析自身或是衍生化后能够产生荧光的物 质，灵敏度高（专属） 原理：利用某组分在溶液中受光激发后，能发射荧光的性质来进行检测。 优点：灵敏度高；选择性好 缺点：只适合具有荧光性的物质
4、检测器：将流出色谱柱的洗脱液中组分的量或浓度定量 转化为电信号
4）示差折光检测器（RID）：利用折光率的差别，灵敏度低，温度要 求严格（通用） 原理：利用纯流动相和含有待测组分流动相之间折射率的差别进行检测 的。 优点：灵敏度适宜；通用型检测器 缺点：对温度变化敏感；不能用于梯度洗脱法中 5）电化学检测器（ECD） 6）化学发光检测器 7）MS、FTIR、NMR等
4）梯度洗脱装置
洗脱方式——等度和梯度两种
洗脱装置——低压梯度和高压梯度装置 低压梯度 高压梯度
高压泵 混合阀 高压泵 混合阀 高压泵
梯度洗脱剂
一台高压泵，常压下通过比例调节阀，将各种不同极性的溶剂按一 定的比例混合后，再被抽入高压泵中增压送入色谱柱
利用两台高压输液泵，程序控制每台泵的输出流量，在泵后的高压 状态下混合，混合后进入色谱柱
三、化学键合相色谱法（BPC）
1、化学键合相 2、反相键合相色谱 3、正相键合相色谱 4、离子对色谱和离子抑制色谱
1、化学键合相：目前应用最广、性能最佳的固定相； 利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面 A、硅氧碳键型： ≡Si—O—C B、硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广 C、硅碳键型： ≡Si—C D、硅氮键型： ≡Si—N
保护柱、色谱柱、恒温装置、连接阀 常用：直径4~6mm，柱长10~30cm 柱效评价：色谱系统适应性试验： R ， n ， T （拖尾因子） 柱再生：维护、保养、柱子的冲洗 发展趋势：减小填料粒度和柱径以提高柱效
4、检测器：将流出色谱柱的洗脱液中组分的量或浓度定量转 化为电信号
各种检测器： 1）紫外检测器（UVD）：适于具有紫外吸收的物质（常用、专属） 原理：基于待测组分对特定波长的紫外光有选择性的吸收，被测物浓度与 吸光度的关系服从比尔定律。 优点：灵敏度高、噪声低、线性范围宽、对温度及流动相流速变化不敏感 缺点：不适用于无紫外吸收的物质；流动相的截止波长应小于检测波长 常用仪器：可变波长型检测器（VWD）、二极管阵列检测器（PDAD） 2）蒸发光散射检测器（ELSD）：适用于挥发性低于流动相的组分，特 别适用于无紫外吸收的样品。（通用）
影响因素： dp：降低dp，采用小粒度固定相，常用3-5m。 ：降低，球形、粒度均匀的固定相。 使用小而均匀的填充颗粒能改善柱效
3）传质阻抗项
C Cm Csm Cs Cm Csm
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相传质阻抗
HPLC：H A Cm u Csm u
第八章 高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
8—1 8—2 8—3 8—4 8—5 8—6 8—7 概述 HPLC色谱仪 HPLC基本理论 各类HPLC及其固定相、流动相 HPLC分析条件的选择 定性与定量分析 液相色谱—质谱联用技术
8— 1
GC
分析对象
HPLC
热稳定性好、沸点较低、分 能溶于流动相的样品，不受样品挥发性和 子质量小的样品，占有机物 热稳定性的限制，占有机物的80% 的20% （1）气体（H2、He、N2）； （ 2 ）组分与流动相无亲合作 用力，只与固定相作用，通 过改变固定相提高分离选择 性； （ 3 ）流动相种类少，可选择 范围小 加温操作 柱温 H=A+B/u+Cu（填充） H= B/u+Cu（空心毛细管） （1）液体； （ 2 ）流动相与组分间有亲合作用力，可 选用不同性质的溶剂作为流动相，提高分 离效率； （3）流动相种类多，选择范围广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重 要作用 室温；高压 流动相 H=A+Cu=A+Cmu+Csmu
不敏感 不敏感 不敏感 敏感
0.1-10ng
不敏感 不敏感
8—3 HPLC基本理论
热力学理论：塔板理论——平衡理论
动力学理论：速率理论——Van deemter方程 一、塔板理论
二、速率理论
一、塔板理论
n理 L H理
tR
或 H 理 L / n理
tR 2 t ) 16( R ) 2 W1 2 W
二、速率理论
B 2 Dm
Dm
T

柱温T 低，流动相 大 B相忽略
HPLC：H A C u
1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）
u 1mL / min 时，H u u H ，n 柱效 ，但t R
兼顾柱效和分析时间，选择u 1ml / min
3、流动相： 基本要求： 1）与色谱柱不发生不可逆的化学变化； 2）溶解被分离的样品； 3）与所用检测器匹配 基本原则： 极性大的试样用极性较强的流动相； 极性小的试样用低级性的流动相 要精细的调节流动相的极性，可用混合溶剂法； 如果样品中组分的极性相差太大，可用梯度洗脱。
4、影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑ 溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓， tR↓ 注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间 5、出柱顺序：弱极性组分先出柱，强极性组分后出柱 6、硅胶含水量较小，吸附色谱，硅胶极性较大 硅胶吸水量↑，LSC→LLC 硅胶含水量>17%，分配色谱，硅胶失活→载体，吸附 的水→固定液
二、液液分配色谱法（LLC） 固定相与流动相均为液体
1）作为固定相的液相与流动相不互溶； 2）固定液对被分离组分是很好的溶剂。
1、分离机制：利用组分在两相间有不同的分配系数——分配定律 2、固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 3、分类 1）正相色谱：固定液极性 > 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 2）反相色谱：固定液极性 < 流动相极性（RLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离弱极性、中等极性组分
ODS：十八烷基键合相，十八烷基氯硅烷与硅胶表面的硅醇基反应键合而成
1）分离机制： 双重分离机制：分配 + 吸附（以LLC为基础） （键合基团的覆盖率决定分离机理） 高覆盖率：分配为主； 低覆盖率：吸附为主；
2）特点： A、不易流失 B、热稳定性好 C、化学性能好 D、载样量大 E、适于梯度洗脱
2、反相键合相色谱 1）分离机制：疏溶剂理论 2）固定相：极性小的烷基键合相 C2、C8柱，C18柱（ODS柱：HPLC约80%）C30柱、苯基柱 键合相的键合基团的碳链长度增长后极性减小 3）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 > 固定相极性 底剂（水）+ 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇、乙腈、THF等 4）流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑ 5）出柱顺序： 极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱 6）适用：非极性~中等极性组分