布鲁氏菌病实验室诊断技术
布病的实验室诊断
19株标准菌株AMOS-PCR扩增结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp
200bp
1、22.DL2000 DNA Ladder 2-4.B. Melitensis 1-3 5-11.B. Abortus 1 -7 12.B. Abortus 9 13-17.B. Suis .1 -5 18. B. ovis 19. B. neotomae 20. B. canis 21.阴性对照
布鲁氏菌培养与鉴定
血平皿 布氏菌菌落
布氏琼脂布鲁氏菌菌落
研究方法
VITEK2 全自动微生物生化分析仪
布氏菌生化鉴定
全自动微生物生化鉴定结果
借助VITEK2COMPACT全自动微生物分析系统建立了 一套布鲁氏菌的生化鉴定参考标准分型方法。 完善布鲁氏菌生化鉴定数据库。 鉴定布鲁氏菌速度快，可靠性高，确定布鲁氏菌 属的鉴定指标为L-脯氨酸芳胺酶（ProA）、酪氨酸 芳胺酶（TyrA）、尿素酶（URE）、氨基乙酸芳胺 酶（GlyA）；区分羊种布氏菌的指标为ELLMAN （ELLM）；区分牛种布氏菌的指标为乳酸盐产碱 （1LATK）；区分猪种布氏菌指标为丙氨酸-苯丙氨 酸-脯氨酸芳胺酶（APPA）. 当鉴定为人苍白杆菌时，需与布鲁氏菌进行鉴别。
玻片凝集的评价
• 虎红平板凝集试验和全血玻片凝集试验为初筛、定性凝集试 验或半定性凝集试验，优点是较试管凝集试验操作更简便， 检测迅速，尤其是虎红平板凝集试验是在酸化抗原基础上制 备的带有色素的抗原制剂，经大量的研究资料证明，本法与 常规血清学试验有较高的符合率，是人畜布氏菌防治工作中， 广泛采用的一种筛选试验方法。 • 但此两种平板试验，尤其是全血玻片凝集试验，可能出现非 特异性凝集反应，在单以平板凝集反应诊断布氏菌病时，应 考虑到此点，以免误诊。对阳性和疑似标本必须进行SAT确证， 才能作为实验结果。
布鲁氏菌病的实验室诊断方法综述
用于测定感染动物的全乳样本 ， 但此时试 验的敏感性将会降低。
而在实际操作 中， 在测定可能来 自上百头乳牛的桶装乳样本前 ， 应先测定多个个体样本 以确定试验的敏感性 。对于桶装乳测 试 的低敏感性可通过提 高试验的重复率来进行弥补。ＯＥ规定 Ｉ
该 试 验用 于乳 牛及 小 型反 刍 动物 全乳 的测定 。 ２８ 皮 内测试 ．
补体结合试验 ｆＦ 用于检测 由抗布鲁 氏菌抗体激活的补 ｃＤ
体。 牛免疫球蛋白可激活 自身补体 ＩＧ和 ＩＭ。 ｇ ｇ 据资料显示该方 法的敏感性不高但特异性较高ｔ￣ ２ 。由于难以标准化 ， １ ２ 该试验逐渐
综上所述 ， 目前传统的检测方法 ， Ｓ Ｔ Ｒ Ｔ ＭＲ 、 Ｆ 如 Ａ 、 Ｂ 、 Ｔ Ｃ Ｔ等
进 的 实验 室诊 断技 术 。 者认 为在 当前形 势下 ， 笔 为有 效监 测地 区或 国 家的 布鲁 氏茵病 流行 情 况， 少经济损 失 ， 有针 对性 地 、 减 应 有所侧 重地 选择 实验 室诊 断 方法 ， 以保 障试验 结果 与 实际情 况一致相 符 ， 而有效 地预 防与控 制布 鲁 氏茵病 。 从 关键词 ： 鲁氏 茵病 ； 布 实验 室； 断 方法 诊 中图分类号 ：８５１ ￥５ ． ２ 文 献标识码 ： Ａ 文章编号 ：０ １ Ｏ６ｆ １）３ ｏ７— １０一 ７ ９ Ｏ２ｏ一 ０４ ２ ２
公 猪 的 ／ ｓｉ变 型 ２目 ３ｕ ． ｓ ｕ 。由于 以上 方 法各 自的步 骤 不尽 相 同且 分
１直接诊断方法
１ 染 色法 ． １
布鲁氏菌属球杆菌 ， ０ 长 ． ． ｉ， ０ ０ ｉ， 常 ６～１ ｎ宽 ． ． ｎ通 ５ ５～ ７ 呈单个出现 ， 有时呈两个 或多个存在 ， 对弱酸有抵抗力 ， 革兰 氏 染色呈红色。 该方法常应用于对流产物质 的分析 ， 但不具有特异 性， 因为一些导致流产的病原体如猪流产嗜性衣原体（ 过去称禽
布鲁氏菌病诊断的金标准
布鲁氏菌病诊断的金标准
布鲁氏菌病的金标准诊断方法是通过分离和鉴定布鲁氏菌。
具体诊断布鲁氏菌病的步骤包括：
1. 临床症状分析：布鲁氏菌病的典型症状包括发热、关节痛、乏力、头痛等，临床医生根据患者的症状进行初步判断。
2. 实验室检查：通过采集患者的血液、骨髓、尿液、淋巴组织或其他体液或组织进行培养。
3. 分离布鲁氏菌：将采集到的样本进行无菌条件下的培养处理，将培养基上的菌落进行进一步的鉴定。
4. 鉴定布鲁氏菌：通过对分离的菌落进行生理生化试验，如氧化酶试验、嗜碱性试验、免疫荧光试验、PCR等，判断菌株
是否为布鲁氏菌。
金标准诊断布鲁氏菌病的主要依据是从患者体液或组织样本中成功分离和鉴定出布鲁氏菌。
但由于布鲁氏菌的培养和鉴定过程较为复杂，诊断通常需要时间，并且技术要求高，因此常常需要结合临床症状、实验室检查及其他辅助诊断方法来综合判断。
布鲁氏菌病实验室诊断研究进展
布鲁氏菌病实验室诊断研究进展高明华樊庆德徐春光杨晓刚（呼伦贝尔学院生命科学与化学学院内蒙古呼伦贝尔021008）布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种重要人兽共患病。
根据致病性和宿主特异性，将布鲁氏菌分为6个种19个生物型，即羊种布鲁氏菌(B.meltensis)、牛种布鲁氏菌(B. abortus)、猪种布鲁氏菌(B. suis)、绵羊附睾种布鲁氏菌(B.ovis)、犬种布鲁氏菌(B. canis)和沙林鼠种布鲁氏菌(B. neotomae)。
另外，从海洋动物中分离到在致病性和分子特征上有别于前6种的布鲁氏菌，定为海洋种布鲁氏菌(B. maris)。
据CDC报告，我国人布鲁氏菌病发生严重，2005~2007年全国布鲁氏菌病新发病人分别为18 416、19 013、21 901例，2008年1~10月新发病数已达27 264例，形势十分严峻。
流行病学调查表明，感染来源主要是患布鲁氏菌病的羊，其次是牛及其他动物。
并且具有疫区范围扩大、爆发点增多、典型病例增多、人群分布以农民和牧民为主等特点。
为有效预防和控制人和动物布鲁氏菌病，加强对动物布鲁氏菌病的检疫监测力度十分重要。
为此本文就布鲁氏菌病实验室诊断方法研究进展作以综述。
1 免疫学诊断技术1.1 血清凝集性试验布鲁氏菌病传统检测方法有血清凝集试验、全乳环状试验(MRT)和抗人免疫球蛋白试验(Coomb’s)等。
经典血清凝集试验包括标准试管凝集试验(SAT)和平板凝集试验(PAT)等在发达国家已基本上停止使用，取代方法是缓冲布鲁氏菌抗原试验，如虎红平板凝集试验(RBT)等。
在国际贸易中，缓冲布鲁氏菌抗原试验是牛、羊、猪种布鲁氏菌病的指定试验。
乳牛MRT依然是乳牛布鲁氏菌病监测的主要方法。
由于凝集性试验是基于检测针对布鲁氏菌多糖O-链的抗体，因此会与有类似多糖O-链的细菌如耶尔森氏菌O:9等出现交叉反应。
1.2 补体结合试验（CFT）CFT至今仍是布鲁氏菌病诊断的重要方法，是牛、羊及绵羊附睾种布鲁氏菌病国际贸易指定试验，并作为确诊用。
布鲁氏菌病的实验室检查
布病简介
牛种
绵羊附睾种 Brucella
沙林鼠种
犬种
羊种 猪种
布病血清学诊断
标本的采集、保存及运输
1） 血清学诊断需要的标本类型为人及疑似动物 血清。
2） 使用负压采血管或注射器进行采集。 3） 分离到的血清存放到灭菌后的血清管内。 4） 两周内进行实验的血清可4℃冷藏保存。
• 检测试剂需使用R型布鲁氏菌虎红平板凝集抗原。
• 在条件允许的情况下，建议虎红平板凝集抗原 （检测S型布鲁氏菌抗体的虎红平板凝集抗原）和 R型布鲁氏菌虎红平板凝集抗原同时进行检测。
• 器材
试管凝集实验
小试管 试管架 诊断试剂
• 器材
试管凝集实验
加样枪
吸头吸头
操作方法
• 每份血清取6-8支小试管，放于试管架上。 • 血清稀释：第一管加入960ul生理盐水，其余各管
内，放到37℃温箱内培养。
运送
• 采集到的双相血培养瓶尽快送至贵州省疾病预防 控制中心布病实验室，进行培养检测，检测结果 会在一个半月内反馈至县疾控中心。
• 血培养瓶的运输，不需要冷藏，常温运输。
谢 谢！
• 每个方格内加入布病虎红平板凝集抗原30ul，备 检血清30ul。 注意：虎红平板凝集抗原使用前需充分摇匀。
• 使用牙签将两者混匀。 • 旋转摆动玻璃平板，室温5分钟之内观察结果。 • 每个平板需做阴、阳性血清对照，方法同备检血
清。
结果判断
阳性 阴阳性血清对照同时成立，本次实验成立。
阴性
• 因犬种布鲁氏菌为天然粗糙型，所以产生的血清 抗体为粗糙型布鲁氏菌血清抗体。
血清的反复冻融会引起布病抗体效价的降低 5） 检测后的血清-25℃冷冻保存。 6） 使用冷藏箱进行长距离运输。 注意：采集血清需使用红色或者黄色盖子的负压采
(整理)动物布鲁氏菌病诊断技术GB
动物布鲁氏菌病诊断技术GB/T18646—20021 范围本标准规定了动物布鲁氏菌病的诊断技术。
本标准规定的虎红平板凝集试验、乳牛全乳环状试验适用于家畜布病田间筛选试验和乳牛场布病的监测及诊断泌乳母牛布病的初筛试验；试管凝集试验和补体结合试验适用于诊断羊种、牛种和猪种布病感染的家畜。
本标准规定的试管凝集试验不适用于犬种和绵羊副睾种布病感染家畜的检疫。
2 虎红平板凝集试验2.1 材料准备2.1.1 抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。
2.1.2 受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味。
2.1.3 洁净的玻璃板，其上划分成4cm2的方格。
2.1.4 吸管或分装器，适于滴加0.03mL。
2.1.5 牙签或火柴杆，供搅拌用。
2.2 操作方法2.2.1 将玻璃板上各格标记受检血清号，然后加相应血清0.03mL。
2.2.2 在受检血清旁滴加抗原0.03mL。
2.2.3 用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合。
2.2.4 每次试验应设阴、阳性血清对照。
2.3 判定2.3.1 在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。
2.3.2 受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性(+)，无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性(—)。
3 乳牛布病全乳环状试验3.1 材料准备3.1.1 布病全乳环状抗原由制标单位提供，按说明书使用。
3.1.2 乳样3.1.2.1 受检乳样须为新鲜的全乳。
3.1.2.2 采乳样时应将母畜的乳房用温水洗净、擦干，然后将乳液挤入洁净的器皿中。
3.1.2.3 采集的乳样夏季时应于当日内检查；保存于2℃时，7d内仍可使用。
3.2 操作方法3.2.1 取乳样lml，加于灭菌凝集试验管内。
3.2.2 取充分振荡混合均匀的全乳环状抗原1滴(约50ul)加人乳样中充分混匀。
3.2.3 置37℃一38℃水浴中60min。
3.2.4 加温后取出试管勿使振荡，立即进行判定。
布鲁氏菌病实验室诊断方法
0 引言
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属成员引起的最常见的细 菌性人畜共患病，感染包括狗、反刍动物、人类和海洋 哺乳动物等，主要传播途径是消化道、呼吸道、生殖 道、皮肤、粘膜和气溶胶接触。家畜感染布鲁氏菌病后 其繁殖能力和生产性能会下降，母畜会流产、不孕、胎 盘滞留、死胎或弱胎，公畜会患睾丸炎、关节炎等，影 响畜产品质量和安全，造成严重经济损失。布鲁氏菌病 的实验室检测主要分为细菌分离鉴定、血清学检测和分 子生物学方法等。
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综述与专论 | Summarize and reviews
方法并研究了相应等试剂盒，用该试剂盒对1200份样品 进行检测，其敏感性和特异性分别达到97.7%和95.5%， 解决了中国布鲁氏菌病间接ELISA试剂盒依靠进口的困 境。Wang[6]等建立了牛布鲁氏菌病血清学检测的竞争 ELISA（c-ELISA）方法，并用该法与商业性c-ELISA试 剂盒、玫瑰孟加拉平板凝集试验（RBT）和微孔板凝集 试验做对比，检测6种常见交叉反应病原菌的高免抗血 清和110份临床牛血清样品，结果表明，该方法的特异 性比商业性c-ELISA试剂盒和RBT更高，灵敏度与商业 性c-ELISA试剂盒一致。 2.3 荧光偏振试验
1 细菌分离培养
分离布鲁氏菌仍然被认为是诊断布鲁氏菌病的“金 标准”。根据临床症状选择样本，包括流产胎儿、胎 膜、阴道分泌物、牛奶、乳房组织、乳腺和生殖器淋巴 管等，人类可以从血液、尿液和脑脊液中分离出来。将 样品接种于布鲁氏菌选择琼脂上观察菌落生长情况，再 根据其菌落形态、革兰氏染色、氧化酶试验、脲酶和过 氧化氢酶试验、硫化氢的产生、抗布鲁氏菌单特异性血 清凝集试验、在无二氧化碳条件下的生长和碱性品红染 料的生长情况等进行生物分型。尽管使用了选择性培养 基改进布鲁氏菌的分离和鉴定，并且成功地研发出自动 化培养系统，但布鲁氏菌的分离仍然具有挑战性。这个
布鲁氏菌病实验室诊断技术及其适用性评析
ＭＲ 以染 色 的布 鲁 氏菌 全 茵 作 为诊 断抗 原 ，可 用其 异 性 高 的方 法进 行 确诊 ， 以剔除 假 阳性 。例 如 ，首 先 用 Ｔ
检 测 混 合 奶样 ， 当存 在 布 鲁 氏茵 抗体 时 ，红 色 的抗 原抗 虎 红平 板 凝 集试 验 筛选 ，再 用试 管凝 集 试验 确诊 ，或者 体 复 合 物 转移 到 乳脂 层 ，形成 有 色乳 脂 环 （ 红色 为 紫红 ｉＬＳ 筛选 、ｃ Ｌ Ａ Ｅ ＩＡ Ｅ Ｉ 确诊 。 Ｓ
动 ，其 是Ｏｌ规 定 的 “ 易适 用 ”方 法 。 Ｅ 贸 ２ ２２ 奶 液检 测 方法 ｌｌ 常 用 的诊 断方 法 。
实 践 中 ，通 常需 要根 据 检测 目的 （ 证实 疫情 、全 国
ＭＲ （ 乳 环状 试 验 ）、Ｅ ＩＡ Ｆ Ａ （ 光偏 振 普 查 、确 诊 、 国际 贸 易检 测 、无 疫 区监 测等 ） 拟 定诊 Ｔ 全 ＬＳ 和 Ｐ 荧 来
２． １． ＥＬｌＡ ２． ４ Ｓ
Ｅ ＩＡ 奶 样 Ｆ Ａ 敏 感 性也 可 通过 提 高 检 测频 率 予 以 ＬＳ 与 Ｐ的 弥补 。上 述 方 法被 Ｏｌ规 定可 用 于 奶 牛 、小 反 刍兽 的 布 Ｅ
Ｅ ＩＡ 为 两 大 类 ，即 间接 Ｅ ＩＡ （Ｅ ＩＡ ） 竞 病检 测 。 ＬＳ 分 ＬＳ ｉＬＳ 和 争 Ｅ ＩＡ （ Ｅ ＩＡ ） ＬＳ ｃ ＬＳ 。大 部分 ｉＬ Ａ 用纯 化 的 光滑 型 ２２ 皮 肤测 试 ＥＩ 使 Ｓ ｌ． ３ Ｌ Ｓ 为诊 断抗 原 ，但 ｉＬＳ Ｐ作 Ｅ ＩＡ中抗 牛免 疫 球 蛋 白结 合 物 皮 肤 测试 本 质上 是 一种 超敏 反 应 ，检 测 由布鲁 氏菌
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布鲁氏菌病实验室诊断技术
作者：王勤
来源：《湖北畜牧兽医》2018年第04期
摘要：对实验室常用的几种布鲁氏菌病检测方法进行了分析，为实验室检测不同动物群体选择相应的诊断方法提供参考。
关键词：实验室；布鲁氏菌病；检测方法
中图分类号：S858 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2018）04-0025-01
布鲁氏菌病（简称布病）是一种危害性极大的传染性人兽共患病，在世界范围内广泛流行。
其主要临床症状为雌性动物流产、生育力下降，雄性动物睾丸炎，甚至不育，给畜牧业造成严重的损失。
1 病原学方法
从疑似感染布病的个体中提取血液或其他样本，对样本处理后在选择培养基上培养，如有菌落生长则通过细菌染色、生化试验等方法鉴别是否为布鲁氏菌，该方法准确性高，但危险性高、操作难度大、分离时间长，对试验环境要求严格，需在特定试验条件下进行。
2 PCR技术
随着分子生物学技术的发展和普及，可通过 PCR、荧光定量PCR以及环介导等温扩增（LAMP）等技术对布病进行诊断。
其中PCR技术具有特异性高、灵敏度好、操作较简单等优点，可用于鉴别不同种属的布鲁氏菌。
荧光定量PCR 技术相较于传统 PCR 技术具有灵敏度高、高通量和方便快捷等优势，但由于其引物和探针设计较为困难，且限制较多，对专业技术有较高要求。
LAMP可用于对奶、组织等样本的检测，具有操作方便、可视性强、特异性高和试验条件要求低等优点，其灵敏性可达10 pg/反应，且可以在普通水浴下完成反应，适于基层检测使用。
但是LAMP存在多重扩增较为困难，样本污染等问题，且对引物设计要求很高限制了该技术的进一步使用。
3 血清学检测方法
3.1 虎红平板凝集试验（RBPT）
BRPT是在平板上将30 μL抗原与30 μL血清样品混合，4 min内观察是否出现凝集来判定阴阳性，该法使用方便、结果判定简单、价格低廉，适用于各种家畜布病的田间筛选，在国际上广泛应用，但是特异性较差，易出现假阳性。
3.2 试管凝集试验（SAT）
SAT定量是所有试验中最准确的，所以一直作为确诊试验使用，曾经在国际上得到了广泛应用。
近年，由于快速凝集试验和ELISA等检测技术的发展，对比研究发现SAT的敏感性和特异性比其他常用方法低。
在发达国家，布病的血清学检测方法基本已淘汰了SAT，在国际贸易中也未将布病SAT列入。
3.3 补体结合试验（CFT）
CFT是公认的特异性和敏感性较高的血清学检测方法，适用于各种家畜布病的检测，至今在国际贸易中仍是重要的诊断方法。
CFT在试验过程中需要对溶血素、补体、抗原等多个组分进行标定，操作十分繁琐，需经验丰富的人员进行组分准确滴定、试剂保存和结果判断等，因此该法在实际检测过程中难以得到推广，仅在相关科研机构和稀有动物检疫确诊中使用。
3.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）
ELISA 技术具有成熟稳定、方便快捷、特异性敏感性高、高通量等优点且其对相关试验人员要求较低，适合临床样本的快速检测。
目前有iELISA 与cELISA两种方法用于布病诊断，其中iELISA具有高度敏感性，但不能用于检测自然病原株诱导产生的布病抗体，因此仅用作对免疫接种过的牛进行筛选，并非确认；cELISA 具有比iELISA更高的特异性，可用于排除牛布鲁氏菌接种产生的抗体反应。
3.5 荧光偏振试验（FPA）
FPA是一种定量免疫分析技术，已经用于北美和欧洲的布病根除计划，是OIE 规定的国际贸易指定方法，其原理和ELISA相似，但操作简便，用时更短。
大量的研究结果表明，在布病的抗体检测方法中，荧光偏振的特异性和敏感性比较高。
但是，该方法试剂盒昂贵，且需要在专门仪器内使用，限制了该方法的推广。
3.6 胶体金试验
国内学者初步建立了检测布病抗体的胶体金方法，其敏感性和特异性均达到了90%以上。
胶体金试验具有方便快捷、敏感性高、结果易判定等优势，适合临床快速诊断的需要。
但是，现有商品化胶体金试纸条标准参差不齐，符合率和敏感性较差，仍需要进一步发展。
4 细胞免疫学检测方法
目前细胞免疫学检测布病的方法较少报道，原因大致如下：一是细胞免疫状态受多种因素影响，难以找到合适的特异性指标进行衡量；二是易感动物个体差异较大，容易引起误差；三是细胞免疫检测方法成本更高，操作更复杂；四是相关研究仍不成熟，且难度较大。
5 小结
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的具有传染性的人畜共患病，OIE将其列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。
诊断布病的方法有多种，但并非每种方法都适用于所有流行病学情况，因此，需根据诊断方法的适应性及其优缺点，针对不同的动物群体选择相应的诊断方法进行检测。