分子克隆-DNA测序技术
荧光定量PCR、基因克隆和基因测序
临床分子生物学1. 试述荧光定量PCR技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用。
（1）原理：实时荧光定量PCR是一种将PCR扩增和扩增结果的检测有机地结合在一起的一种分子生物学技术，系在PCR反应体系中加入能够反映PCR反应进程的荧光报告基团，随着PCR 反应的进行，荧光信号强度也按特定的规律随PCR产物不断累积而增加。
同时，每经过一个热循环，定量PCR仪收集一次荧光信号，通过实时监测反应体系荧光强度的变化来实时监测PCR扩增过程，最终得到荧光强度随PCR循环数的变化曲线。
理论上，PCR的扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,其荧光量与扩增产物量亦成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。
最后根据该曲线的特征及标准曲线实现起始模板数的精确定量。
荧光定量PCR的扩增曲线可以分为三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。
在荧光信号背景阶段，由于PCR扩增产生的荧光信号远远小于荧光背景信号，为背景荧光所掩盖，我们难以判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已经不再呈指数增加，PCR的终产物量与起始模板之间没有线性关系，所以用终产物量不能计算出起始模板的量。
为了定量和比较的方便，在定量PCR中引入了三个非常重要的概念：荧光基线、荧光阈值和CT值。
基线是指PCR循环开始时，虽然荧光信号累积，但仍在仪器可以检测的灵敏度下。
基线范围的定义是从三个循环开始起到CT值前的第三个循环止。
荧光阈值的确定是3－18个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
CT值的定义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
可见CT值取决于阈值，而阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，因此CT值是一个完全客观的参数。
（2）方法：1、引物设计遵守的原则2、探针设计遵守的原则3、RNA提取4、逆转录逆转录成cDNA5、常规PCR扩增（1）反应体系（2）混匀，瞬时离心。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
分子克隆基本流程及技术原理
分子克隆基本流程及技术原理分子克隆是一种重要的实验技术，可用于制备大量的DNA和蛋白质，探索基因功能，研究生物学过程等。
其基本流程包括DNA片段选择、PCR 扩增、限制性内切酶切割、连接、转化和筛选等步骤。
以下将详细介绍分子克隆的基本流程及技术原理。
PCR扩增：接下来，使用聚合酶链反应（PCR）技术扩增DNA片段。
PCR是一种有效的DNA扩增方法，它通过反复复制DNA模板，生成大量的DNA片段。
PCR反应基本包括三个步骤：变性、引物结合和扩增。
-变性：将DNA模板加热至95°C，使其两个链分离，得到单链DNA。
-引物结合：将反应体系温度下调到适宜的引物结合温度，引物与DNA模板的互补序列结合，形成DNA-DNA复合物。
-扩增：在一定的温度下，聚合酶通过DNA-DNA复合物进行扩增。
扩增过程包括DNA链合成、DNA链延长、DNA链分离和DNA链结合。
多次循环后，可以得到大量的目标DNA片段。
限制性内切酶切割：在PCR扩增后，可选用特定的限制性内切酶切割目标DNA片段。
内切酶是一种具有特异性的酶，它能够在特定的DNA序列上切割产生特定的片段。
通过切割，可以克隆所需的片段，并在连接过程中提供黏性末端。
连接：将目标DNA片段与载体DNA（如质粒）连接起来。
连接可采用多种方法，如T4DNA连接酶方法、PCR重叠延伸法等。
连接时，需要确保目标DNA片段与载体DNA能够互补配对，并生成稳定的连接。
转化：将连接后的混合物转化到宿主细胞中。
转化可通过化学方法（如钙离子转化法）或生物方法（如细菌电穿孔法）实现。
转化后，将细胞培养在含有适当选择压力（如抗生素）的培养基中，这样只有转化成功的细胞才能存活。
筛选：根据实验目的选择合适的筛选方法。
通常，使用抗生素抗性标记和荧光蛋白等进行筛选，以识别并纯化所需克隆产物。
技术原理：-PCR技术：PCR技术是通过DNA聚合酶的模板依赖性合成，将DNA片段按特定序列进行扩增。
分子克隆技术的发展和应用
分子克隆技术的发展和应用随着生物科技的发展，分子克隆技术已经成为了当今生物领域中最具有前瞻性和影响力的技术之一。
分子克隆技术主要是指利用特定的分子工具来切割、连接和精确修改DNA分子，从而实现对基因、涉及DNA分子的序列和结构等方面进行精确操作的技术。
本文主要就分子克隆技术的发展和应用进行阐述。
一、分子克隆技术的发展历程分子克隆技术的历史可以追溯至1951年，美国生物学家亨利.道德曼首次提出了DNA分子可以作为遗传信息传递的基本单位。
随着技术的进步和科学研究的深入，分子克隆技术越来越成熟。
1970年，美国生物学家波尔在构建细菌基因中首次使用了限制性内切酶切割DNA分子的方法，为后来的DNA粘连和基因重组打下了坚实基础。
1983年，基因测序技术的发明加速了分子克隆技术的发展，许多生物学家开展了大量基因研究，为分子克隆技术的突飞猛进奠定了基础。
二、分子克隆技术的应用1.建立基因库和基因工程分子克隆技术可以用于构建基因库，进而深入研究基因在细胞和生物体中的功能和调控机制。
同时，分子克隆技术还可以用于基因工程，从而通过精确修改和重组基因来实现对某些遗传性疾病的治疗。
2.探究生命现象和生物多样性通过分子克隆技术的精确定位和修改，生物学家能够更好地掌握生命现象和生物多样性，在此基础上开展更为深入的研究。
比如说，研究某些基因是否在特定时期或环境下会发生变异，从而揭示生命现象的规律。
3.医学诊疗分子克隆技术对医学诊疗也有实际应用。
例如，在癌症治疗领域，通过精确锁定某些癌变基因的位置和结构，研究生物学家设计出匹配的药物，进而实现更为精确的癌症治疗。
三、分子克隆技术的机遇和挑战尽管分子克隆技术在生命科学领域中有着广阔的应用前景，但面临着很多挑战和机遇。
首先是分子克隆技术的权益归属问题，在西方国家这样的问题凸显，同时在学术研究领域也需要加强知识产权保护。
此外，对分子克隆技术涉及到的伦理和生物安全等问题也需要加强研究。
分子克隆主要步骤
分子克隆主要步骤分子克隆是一种常用的分子生物学技术，用于复制DNA分子。
下面是分子克隆的主要步骤：1.DNA提取：首先需要从一个已知的DNA源（例如细菌、动物组织等）中提取所需的DNA。
这可以通过使用不同的提取方法（如酚/氯仿提取、自动提取仪等）来实现。
2.限制性内切酶切割：将目标DNA切割成片段。
此步骤可以通过使用限制性内切酶来实现，这些酶可以识别特定的DNA序列，并在这些序列中切割DNA，形成切割产物。
3.DNA修饰：如果需要，在第2步切割的DNA片段末端添加修饰，以便后续步骤的操作。
例如，可以在DNA片段的末端添加磷酸基团（通过激酶酶和ATP）或羟基（通过糖转移酶和dTTP）。
4.连接DNA片段：将目标DNA片段与载体DNA（通常是质粒）连接起来。
这可以通过使用DNA连接酶，如DNA连接酶I或T4DNA连接酶，将DNA片段与载体DNA的末端连接。
5.转化：将连接好的DNA导入到宿主细胞中。
这可以通过转化（常见的转化宿主细胞包括大肠杆菌和酵母）来实现。
转化可以通过热冲击法、电转化或使用化学方法来进行。
6.筛选：在经过转化的细胞中筛选出带有目标DNA的细胞。
这可以通过将转化后的细胞接种到含有适当选择标记的培养基上来实现。
只有带有目标DNA的细胞才能生长并形成克隆。
7.复制：选取带有目标DNA的细胞进行培养，并使其进行大量复制。
这可以通过将细胞培养在含有适当培养基和条件的培养皿中来实现。
8.提取：从大量复制的细胞中提取含有目标DNA的质粒。
这可以通过使用质粒提取试剂盒来实现，其中包含了一系列的化学试剂和步骤，用于纯化和提取目标DNA。
9.鉴定：验证提取的DNA是否为目标DNA。
这可以通过进行限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法来实现。
分子克隆是一种重要的实验技术，可用于构建重组DNA分子、研究基因功能、制备蛋白质等。
虽然上述步骤描述了分子克隆的基本过程，但具体操作可能会因实验目的和需求而略有不同。
遗传学中的细胞生物学技术与应用
遗传学中的细胞生物学技术与应用细胞生物学技术在遗传学中的应用细胞生物学技术是一门研究细胞组成、结构和功能的学科，它在遗传学领域中具有重要的应用价值。
通过细胞生物学技术，科学家们能够深入了解细胞的基本特性，揭示细胞与遗传信息的密切关系，推动了遗传学研究的发展。
一、细胞培养技术细胞培养技术是细胞生物学中最基本的技术之一，也是许多其他细胞生物学技术的基础。
通过细胞培养技术，科学家可以将细胞放置在特定的培养基中，提供适宜的温度、pH值和营养物质，从而使细胞以正常的生长方式进行增殖和分化。
在遗传学中，细胞培养技术的应用非常广泛。
首先，通过细胞培养技术，研究人员能够获得大量纯化的细胞，为遗传学研究提供了必要的实验材料。
其次，在遗传学中，细胞培养技术常用于检测与疾病相关的基因突变。
科学家可以将患者的细胞分离培养，并测定相关基因的突变状态，从而帮助医生进行疾病诊断和治疗方案的制定。
二、细胞染色技术细胞染色技术是一种常用的细胞生物学技术，通过给细胞染色剂进行染色，可以使细胞的结构和组成更加清晰可见。
在遗传学中，细胞染色技术广泛应用于染色体变异的研究。
一种常用的细胞染色技术是核型分析，它通过染色染剂对细胞中的染色体进行染色，然后利用显微镜观察染色体的结构和数量。
核型分析可以帮助科学家检测染色体异常，包括染色体数目异常、结构异常和染色带位点的变异等，从而进一步研究与疾病相关的遗传变异。
三、分子克隆技术分子克隆技术是一种重要的遗传学技术，通过将DNA序列插入到载体中，再将载体转化到特定的宿主细胞中，从而进行基因的复制和研究。
分子克隆技术在遗传学研究中起着举足轻重的作用。
一方面，在分子克隆技术中，科学家能够将感兴趣的遗传物质从原细胞中剪切出来，并进行扩增和研究。
这使得我们可以对基因的结构、功能以及表达进行深入研究，从而推动遗传学的进展。
另一方面，在遗传工程中，分子克隆技术被广泛应用于基因工程的制备和表达。
科学家可以将感兴趣的基因插入到载体中，然后将载体转化到宿主细胞中，进而实现对特定基因的表达和功能研究。
分子克隆的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。
本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。
2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。
四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。
（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。
2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。
（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。
3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。
（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。
4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。
（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。
5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。
（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。
（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。
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第一节 工具酶 一、 分子克隆的主要因素：工具酶、载体和受体细胞。 二 、工具酶的定义 工具酶(tool enzyme)是在DNA的切割 、合成、 剪切 (tool enzyme) DNA 补平、 连接和修饰等过程中起重要作用的酶类。常用 的主要有:限制性核酸内切酶、 DNA聚合酶I、 反转录 酶、 DNA连接酶 、碱性磷酸酶、 多核苷酸激酶和末 端脱氧核苷酰转移酶等。
图5-1 末端终止法测定DNA序列 末端终止法测定 序列
第三节 化学降解法
一、测序原理：首先对待测DNA作末端放射性标记，标记后的 识读DNA分成4组或5组，分别用不同的化学试剂对不同的碱 基进行特异性的化学切割，通过控制化学反应条件，使碱基 的断裂只随机发生在某一个特定的位点，由此各组均产生不 同长度的DNA片段，通过高分辨率的变性聚丙稀酰胺凝胶电 泳分离，放射自显影检测后直接识读待测DNA的序列。 二、测序体系 （一）、待测DNA：对标记的待测DNA的纯度要求较高。 （二）、待测DNA的末端标记和碱基特异的化学切割 （三）、电泳图谱的 三、特点：一次可测600个碱基序列，应用不如链末端终止法。
（四）、DNA连接酶(DNA ligase)是指能催化两个互 补黏性末端或平末端双链DNA分子的5‘磷酸基团与3 ‘羟基形成磷酸二酯键，实现DNA的体外重组的酶类。 （五）、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)是催化去 除DNA、RNA或dNTP上的5-磷酸基团的酶类。 （六）、末端脱氧核苷酰转移酶(TDT) 、T4多核苷酸 激酶与核酸酶S1
四、DNA聚合酶(polymerase)
（一）、DNA聚合酶I和Klenow片段： DNA聚合酶I是单一肽链的多功能酶，且具有3种酶 的活性。 Klenow片段是指用特异的蛋白酶水解 DNA聚合酶I生成的大片段。 （二）、Taq DNA聚合酶(Taq酶)是一种耐热的DNA聚合 酶。最佳作用温度是70-80℃，可用于DNA测序和 PCR反应。 （三）、逆转录酶(reverse transcriptase)是依赖RNA的 DNA聚合酶，以RNA为模板，4种dNTP为底物， 催化合成DNA的酶类。
第二节 载体
一、 载体(vector)的定义：是指能携带外源DNA片段 导入宿主细胞进行扩增或表达的工具,其本质为DNA。 常用的载体有质粒、噬菌体、黏粒、酵母质粒和病 毒等。
图4-1 pBR322质粒物理图谱 质粒物理图谱
图4-2 pUC18/pUC19质粒物理图谱 质粒物理图谱
图4-3 重组杆状病毒的构建和筛选
第四章 分子克隆
一、 分子克隆与基因工程
（一）、分子克隆(molecular cloning)是指按照人的意愿, 在 体外将制备的DNA片段与载体重组, 然后导入受体细胞, 并在 受体细胞中复制、 扩增, 以获得该DNA分子的大量拷贝。此 技术称为分子克隆技术或DNA重组技术. （二）、基因工程(genetic engineering)是指将基因进行克隆, 并利用克隆的基因表达,制备特定的蛋白质或多肽产物, 或定 向改造细胞和个体的特性所用的方法及相关工作。它包括上 游技术(分子克隆)和下游技术(基因表达)。
三 、限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease) （一）、定义：是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列 的核酸水解酶. （二）、分类：根据限制酶的结构与作用特点不同,可将它们分 为I、 II和III。其中II能识别双链DNA特定核苷酸序列,并在此 序列内有特异的切割位点产生特异的DNA片段。有黏性末端 (sticky end)和平末端(blunt end)两类切口。可有同工异源酶 和同尾酶。 （三）、主要用途: 1、在分子克隆中切割DNA以获取目的基因片段，切割载体形 成切口，使目的基因能插入载体; 2、分析限制性片段长度多态性（RFLP），用于遗传病的诊 断，法医DNA指纹图谱分析等; 3、构建DNA物理图谱、基因定位及DNA同源性分析等。
自动化末端终止法DNA序列测定的原理 图5-3 自动化末端终止法 序列测定的原理
思考题
1、何为分子克隆、基因工程、限制性核酸内切酶、克隆载体 和表达载体？ 2、简述分子克隆的基本步骤。 3、简述DNA测序的定义及其经典方法。
参考文献
1.吕建新,尹一兵主编. 分子诊断学. 中国医药科技出版 社.2004.6 2.杨荣武主编.分子生物学. 南京大学出版社.2007.1
图4-5 YAC克隆示意图 克隆示意图
(三)、类别： 1、克隆载体有质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、酵母细胞 中克隆基因常用的载体（YAC）和动物细胞基因克隆的载体 （猿猴空泡病毒40载体SV40、腺病毒载体和逆转录病毒载 体）。 2、表达载体有原核细胞表达载体（启动子-核糖体结合位点-克 隆位点-终止子）、哺乳动物细胞表达载体（启动子/增强子克隆位点-终止位点和加polyA信号）和穿梭载体(在原核和真 核细胞分子克隆中均能应用的载体）。 3、报告基因（reporter gene): 是指处于待测基因下游并通过 转录和表达水平来反映上游待测基因功能的基因。如需检测 某一顺式调控序列的启动子活性，可通过基因重组方法将待 测DNA序列与一个特异报告基因连接并导入受体细胞进行表 达，然后通过检测报告基因产物的量来推测待测DNA序列是 否具有启动子活性。目前比较理想的报告基因有氯霉素乙酰 转移酶（CAT）基因和B-半乳糖苷酶基因等。
第二节 链末端终止法
一、测序原理：Sanger等于1977年在加减法测序的基础上发明 了双脱氧链末端终止法。其原理是利用DNA聚合酶，以单链 DNA为模版，以dNTP(含标记的dNTP）为底物，在四组互相独 立的反应体系中分别加入不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP） 作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下， 合成四组有序列梯度的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性 聚丙稀酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后直接识读待测 DNA的序列。 二、测序体系 （一）、待测模板、测序引物和DNA聚合酶 （二）、dNTP的放射性核素标记 （三）、DNA片段的凝胶电泳。 三、特点：一次可测500个以上的碱基序列，便于实现自动化。
二、载体的分类：克隆载体和表达载体。 （一）、定义：所谓克隆载体是指能将外源基因在受体细胞中 复制扩增并产生足够量目的基因的载体；表达载体是指能将 外源基因在受体细胞中有效表达和正确翻译的载体。在常用 的克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件（DNA序列） 即成表达载体，它不仅可以携带外源基因片段进入宿主细胞， 而且可以在宿主细胞中表达外源基因. （二）、载体具备的特征：能自我复制并具有较高的拷贝数,有 适宜的分子量,一般应<10KB; 带有遗传筛选标记; 有适当的 限制酶切位点,便于外源基因的插入与筛选.
图4-9 DNA克隆的过程 克隆的过程
外源基因在λ噬菌体载体中的克隆 图4-10 外源基因在 噬菌体载体中的克隆
ห้องสมุดไป่ตู้
第五章 DNA测序技术
第一节 DNA测序的意义及策略
一、 DNA测序的定义：测定并分析核酸的序列就叫DNA测序， 是研究其结构、功能及其关系的前提，是分子生物学最基本 的课题，并为临床疾病的分子诊断提供最为精确的判断依据。 二、 DNA测序策略：因待测DNA分子的性质、测序方法和目 的不同而异。 （一）、确证性测序策略 多数情况下, 测序是对已知序列进行鉴定和证实,即确证性测 序(confirmatory sequencing). 如病原微生物保守序列分析、 次级克隆DNA的插入方向、定点突变的检测等。 （二）、未知序列的从头测序策略 未知DNA序列的分析是指确定一个未知序列的准确长度及核 苷酸排列顺序，称为从头测序（de novo sequencing).
图4-6 增强子作用机制
乳糖操纵子的操纵基因和CAP-cAMP结合位点序列 图4-7 乳糖操纵子的操纵基因和 结合位点序列
图4-8 半乳糖操纵子的结构及其调控机制
第三节 分子克隆的基本步骤
一、目的基因的获取（分） （一）、被研究的某一基因或DNA序列称为目的基因或色体DNA中分离。 二、载体的选择（切） 三、目的基因与载体连接（接）： 黏性末端DNA分子的连接和 平末端连接。 四、重组DNA导入受体细胞（转）：转化(transformation)、转 染(transfection)和感受态细胞（competent cell)的概念。 五、重组体的筛选（筛）
1、小片段（ <500bp ）测序，可以直接利用M13mp或质粒系 统克隆、测序。 2、大片段或全基因组测序，可有下列方法： 1）、随机测序法： 鸟枪法（shotgun）与人工转座子法。 2）、定向测序法：是指从靶DNA的某一端开始测序，直到将 靶DNA的序列全部测定。 3）、全基因组测序策略大体可分两种，一种是先作图后测序； 一种是先测序后定位。 三、最经典的两者DNA测序技术：链末端终止法和化学降解法。
图5-2 化学降解法测定核酸序列的原理
第四节 自动化测序
一、最通用和有效的序列分析方法：自动化链末端终止法测序 取代手工测序已成为目前DNA序列分析的主流。因为有下列 突破： （一）、全自动化操作系统代替手工操作； （二）、荧光燃料标记代替放射性核素标记； （三）、PCR循环测序反应代替酶反应； （四）、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳； （五）、高速自动化的分析系统代替人工识读。 二、分类 （一）、基于单一荧光燃料标记的自动化测序系统 （二）、基于多种荧光燃料标记的自动化测序系统