发酵工程菌种保藏
发酵学第章生产菌种的培养与保藏[可修改版ppt]
![发酵学第章生产菌种的培养与保藏[可修改版ppt]](https://img.taocdn.com/s3/m/d0ee7bb01711cc7930b716c4.png)
2、孢子的冷藏时间
关 如土霉素ห้องสมุดไป่ตู้产菌种孢子斜面培养4天左
冷藏时间宜短不宜长。
右冷藏，发现冷藏7~8天菌体开始自溶。 而培养5天后冷藏，20天未发现自溶。
冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。 例如在链霉素生产中，斜面孢子在6˚ C
冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降
低18%，冷藏3个月后降低35%。
(四) 接种量
发酵学第章生产菌种的培养与保 藏
生产菌种的制备：
即种子制备，是发酵生产的第一道工序。即将保存 在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试 管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培 养,最终获得一定数量和质量的菌种的过程。
目的：
提供发酵产量高、生产性能稳定、数量充足、未被 杂菌污染的生产用菌种
(三) 种龄
种龄：种子罐中培养液从开始接种到移入下一级 种子罐或发酵罐的培养时间。
最适的种龄为生命力极为旺盛的对数生长期， 菌体量尚未达到最高峰时移种。
种龄过短—→前期生长缓慢、整个发酵周期延长。 种龄过长—→生产能力下降、菌丝过早自溶
(四) 接种量
接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例
接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。采 用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间， 使产物的形成提前到来。
生产上多以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的措施。 双种法：二只种子罐接一只发酵罐 倒种法：以适宜的发酵液倒出适量给另一发酵罐作种子
三、种子质量标准
细胞或菌体：以单细胞菌体为种子的质量要求菌体健壮、
种子罐种子制备：
一级种子、二级种子……N＋1级发酵 种子罐的级数主要决定于菌种的性质、菌体生长速度、 发酵设备的合理应用。
发酵工程考试必备简答题
五.简答题1.菌种保藏的原理与方法？答：菌种保藏的方法很多，其基本原理都是根据微生物的生理生化特性，人为的创造条件，是微生物处于代谢不活跃(泼)，生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。
一般可以通过降低培养基营养成分、低温、干燥和缺氧等方法，达到防止突变、保持纯种的目的。
常用菌种保藏方法有①斜面冰箱保藏法；②沙土管保藏法；③石蜡油封保藏法；④真空干燥冷冻保藏法；⑤液氮超低温保藏法⑥低温冷冻保藏。
2.培养基成分选择要考虑的问题？答：（1）菌体的同化能力（2）代谢的阻遏和诱导，（3）合适的碳氮比，（4）pH的要求。
3.培养基营养成分包括那几类？答：培养基的成分包括：能源物质、 碳源物质、氮源物质、无机盐、微量元素、特殊生长因子、前体、促进剂和抑制剂、水分。
4.发酵培养基由哪些成份组成？答：（1）碳源 构成菌体和产物的碳架及能量来源（2）氮源 构成微生物细胞物质或代谢产物中氮素来源的营养物质（3）无机盐和微量元素（4）生长因子：微生物生长不可缺少而细胞自身不能合成的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。
（5）水、产物形成的诱导物、前体和促进剂5.简述培养基的类型有哪些？答：培养基的类型有很多，按照组成成分，有合成培养基和天然培养基，按照培养基的状态，可以分为固体，液体和半固体培养基，也可以按照用途分为孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。
6.什么是一类发酵？二类发酵？三类发酵？（分类依据发酵类型可分哪几类？）答：根据产物形成与底物利用的关系，即碳源利用与产物形成速度的关系，将微生物发酵过程分成以下三个类型：第Ⅰ型（又称为与生长相关型）、第Ⅱ型（又称为与生长部分相关型）、第Ⅲ型（又称为与生长不相关型）。
一类发酵：产物形成与底物利用直接相关，为生长联系型，又称简单发酵型，产物直接由碳源代谢而来,产物生成速度的变化与微生物对碳源利用速度的变化是平行的，产物生成与微生物的生长也是平行的。
微生物工程4--菌种保藏原理和方法
微生物工程4--菌种保藏原理和方法微生物工程4--菌种保藏原理和方法一、菌种保藏的意义---菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。
所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。
其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。
二、菌种的衰退和复壮-----菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象称为菌种衰退。
1.菌种衰退的原因:菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。
所谓负突变是指生产菌株的生产性状下降的突变2.防止菌种衰退的方法有①控制传代次数②选择合适的培养条件③利用不同类型的细胞进行传代④选择合适的保藏方法1.斜面低温保藏法：将菌种接种在不同成分的斜面培养基上，待菌种充分生长后，便可放在4℃左右的冰箱中进行保藏。
细菌、酵母菌、放线菌和霉菌都可使用这种保藏方法。
保存期为3-6个月。
原理：低温下微生物代谢慢②砂土管保藏法：适合于产孢子或芽胞的微生物。
一般保存期为2年左右，有的可达十～几十年。
沙、土洗净，烘干，过筛，按1-2：1混匀，分装小试管中，高度1cm左右，121℃高压蒸汽灭菌2-3次，烘干，检验无菌备用。
ν试管中加入菌悬液或孢子，干燥，真空封口即可。
原理：干燥，寡营养③真空冷冻干燥保藏法：加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。
适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。
原理：干燥，低温。
④液氮保藏法：将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196℃）。
适用于各种微生物的较理想的保藏方法。
对一些不产孢子的菌丝体用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法。
其保存期最长。
原理：低温⑤悬液保藏法（寡营养保藏）：将微生物悬浮在不含养分的溶液中，如水、缓冲液、生理盐水，室温保藏，一般为一年。
发酵菌种：菌种建库流程及管理安全性问题
发酵菌种：菌种建库流程及管理安全性问题1. 菌种建库流程1.1菌种筛选菌种筛选是微生物菌种建库的第一步，其目的是从自然环境、生物体或实验室保存的菌种中，筛选出具有特定生理生化特征或能够合成特定代谢产物的菌株。
这一过程包括样品采集、菌种分离、初筛和复筛等环节。
1. 样品采集：从目标环境（如土壤、水、空气）或目标生物体（如植物、动物）中采集样品。
2. 菌种分离：将采集的样品经过适当的处理（如稀释、培养、纯化），分离得到单一菌株。
3. 初筛：通过生理生化实验，对分离得到的菌株进行初步筛选，以选择具有特定特征的菌株。
4. 复筛：对初筛中具有特定特征的菌株进行进一步的筛选，以确定最佳菌株。
1.2菌种鉴定在筛选出具有特定特征的菌株后，需要对菌种进行鉴定，以确定其分类学地位和生物学特性。
菌种鉴定主要包括形态学鉴定、生理生化鉴定和分子生物学鉴定等方法。
1. 形态学鉴定：观察菌株的形态、大小、结构、染色等特征，以确定其分类学地位。
2. 生理生化鉴定：对菌株进行一系列生理生化实验，如对碳源、氮源的利用，pH、温度等生长条件的适应性，以及代谢产物等的分析，以了解其生物学特性。
3. 分子生物学鉴定：通过基因序列测定、多态性分析等方法，对菌株进行分子水平的鉴定，以更准确地区分不同微生物物种。
1.3基因组测序基因组测序是微生物菌种建库的重要环节，其目的是获得菌株的全部基因组序列，从而为后续的基因组分析提供基础数据。
基因组测序一般采用第二代测序技术（如Illumina HiSeq、MiSeq等）或第三代测序技术（如PacBio RS II等）。
1. 基因组提取：从菌株中提取高质量的基因组DNA。
2. 测序建库：将基因组DNA构建成适合测序的文库。
3. 测序：将文库上机进行高通量测序。
4. 质控：对测序得到的原始数据进行质量控制，去除低质量序列和噪声。
5. 拼接：将高质量的序列拼接成完整的基因组序列。
1.4数据库构建数据库是微生物菌种建库的核心部分，其目的是将菌株的基因组数据存储起来，以便后续的数据分析和挖掘。
菌种保藏方法_菌种应该怎么保存
菌种保藏方法_菌种应该怎么保存引导语：菌种应该怎么保存呢?以下是小编收集整理的关于菌种保藏方法相关内容，欢迎阅读参考!菌种保藏方法1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如*奶等常用生产菌种的保存。
传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产*菌种，则应在培养基中添加少量碳*钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传*状容易发生变异;③反复传代时，菌株的病原*、形成生理活*物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种，工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳*杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。
常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。
方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。
保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤(5克)，置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜)，然后高压灭菌。
实验室菌种保藏的方法
实验室菌种保藏的方法菌种是主要的生物资源，也是食用菌生产首要的生产资料。
一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低生产性能，能长期在生产中使用。
因此，菌种保藏在食用菌生产上具有重要的意义。
各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。
一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。
下面介绍几种常用的菌种保藏方法：1斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4。
C左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。
此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。
放线菌、霉菌和有芽匏的细菌一般可保存6个月左右，无芽抱的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。
如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4。
C冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。
这一改进可使菌种的保藏期延长。
此法由于采用低温保藏，大大减缓了微生物的代谢繁殖速度，降低突变频率；同时也减少了培养基的水分蒸发，使其不至于干裂。
该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。
其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。
2石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端IC明使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4。
C冰箱内保藏。
使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150〜170。
C烘箱内灭菌Ih;或121。
C高压蒸汽灭菌60〜80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。
发酵工程原理与技术_江南大学-陈坚-7第七章生产菌种的扩大培养与保藏
– 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长， 降低发酵罐的生产率，增加染菌机会
– 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而 定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种 子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的 繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
16
16
第二节 种子质量的控制
素含量要高
• 营养成分要尽可能与发酵培养基相近。
27
27
2，培养条件 （1）温度 （2）通气量
在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的 培养基外，有足够的通气量可以提高种子质 量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中 将通气充足和不足两种情况下得到的种子分 别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍 。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种 子罐的通气量小对发酵有利。
41
41
(3)二级种子的质量要求 种龄 7~8h pH 7.2左右 OD值 净增0.5左右 无菌检查 (-) 噬菌体检查(-)
42
42
二、啤酒酵母的扩大培养
• 菌种在固体培养基上可呈现多种不同代 谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的 菌落类型也越多，不利于生产的稳定。
19
19
• 措施
– 培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使 用
– 严格控制灭菌后培养基的质量 – 斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一
定时间 – 供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源
，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂 的有机氮源
• 通常接种量，细菌1~5%，酵母 菌5~10%，霉菌7~15%，有时
20~25%
30
30
三、种子质量的控制措施
• 种子质量的最终指标是考察其在发酵罐 中所表现出来的生产能力。因此首先必 须保证生产菌种的稳定性，其次是提供 种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入， 以获得优良种子。
发酵工程实验实验指导书
发酵工程实验指导书（2014版）宁波大学海洋学院2014.09发酵工程实验指导书目录实验一乳酸菌的分离与初步筛选实验实验二乳酸菌的初步鉴定实验实验三乳酸菌菌种保藏实验实验四乳酸菌的培养与发酵实验实验五乳酸菌发酵产物的分析与测定实验六发酵罐操作训练发酵工程实验指导书（2014版）３实验一 乳酸菌的分离与初步筛选实验一、 实验目的及要求1、 掌握从环境样品中分离所需微生物的一般操作2、 掌握平板划线分离菌种的原理和操作方法3、 掌握利用透明圈法获得单菌落菌株的原理。
二、 实验原理自然样品中存在混杂的微生物，通过选择性培养基及样品稀释使形成细胞分散液，再通过固体培养基在合适的培养条件下培养形成单菌落，由此得到分离的纯培养菌株。
乳酸菌最基本的代谢特性是发酵产酸，待分离样品在合适的培养基和培养条件下，乳酸菌在特定设计的培养基中由于生长产酸产生溶钙形象，从而在培养基中产生透明圈，透明圈直径大小可反映菌落生长产酸量的大小，而不是乳酸菌或不产生酸积累的细菌不能产生透明圈。
三、 实验器材1、 待用分离样品（腌菜，各种泡菜，酸奶，植物汁液，等）；2、 培养基：MRS 培养基或改良乳酸菌分离培养基；无菌水；3、 器皿与设备：培养皿、移液管、试管、三角瓶、接种环、涂布棒、超净工作台、天平、采样瓶，培养箱，等。
四、 方法和步骤 1、 分离样品的采集 采样须知：结合乳酸菌菌种特性（文献资料查阅），获取乳酸菌在自然界或相关产品等的分布规律，设计样品采集范围。
采集样品经适当保存或立即处理。
2、 菌种的分离称取样品5g 或5ml →加到45ml 无菌水的三角瓶中（30℃恒温处理20分为佳）→充分震荡后（含玻璃珠）使其自然沉淀→用1ml 移液管吸取上清菌悬液1ml 至9ml 无菌水试管中→依次进行10倍稀释至10-4~10-5→用移液管吸取1mL 菌悬液至含碳酸钙的MRS 培养基平板中，涂布均匀→30℃恒温培养2~3天→观察菌落，分别挑取生长良好的含透明圈的可疑乳酸菌单菌落，分别移接至普通乳酸菌培养基的斜面试管，菌种编号，30℃恒温培养1~2天，长菌后在4℃冰箱保存待用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2、液体石蜡覆盖保藏法
由于培养物表面覆盖液体石蜡后可隔绝空气，因 此降低了微生物菌体的物质代谢，延缓细胞的衰 老，同时也防止培养基水分蒸发，是一种简易的 菌种保藏方法。
此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需 经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位 置较大，同时也不便携带。
3、沙土管保藏法
5、真空冷冻干燥保藏法
此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力 强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保 存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌 种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较 复杂。
6、低温保藏法
低温保藏法又叫冷冻保藏，是普通的保藏技术。 此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活 力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很 难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适 用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操 作都比较复杂。
பைடு நூலகம் ㈢
菌种保藏注意事项
1、注意选择适当的保藏方法； 2、采用良好的培养基新鲜培育出来的菌种进行保藏，要求菌 体健壮或孢子丰满，种龄要适宜，细菌要求在稳定期； 3、必须进行严格的无菌操作，注意维持菌种的活性； 4、保藏期间，严格防止杂菌污染，为菌种创造最适宜的保藏 条件，如控制保藏温度等； 5、严格控制传代的次数，采用斜面低温保藏时尤其注意这点； 6、保藏菌种恢复培养时，要转接到保藏以前所用的同一代培养 基上进行培养，以维持优良性能的稳定性。
菌种沙土管保藏法多用于能产生孢子的微生物如霉 菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广， 效果亦好，可保存2年左右，有的微生物可保藏10 年。 保藏效果较好，且微生物转接方便，经济简便。
4、悬液保藏法
悬液保藏法的基本原理是寡营养保藏，是将微生物 混悬于不含养分的媒液中加以保藏的方法。 此法适用于大部分的放线菌，酵母菌，霉菌以及肠 道科细菌等，其关键在于试管口必须防水密封，一般可 保藏1年左右。
菌种的保藏
（1）菌种保藏的目的及原理 （2）菌种保藏的方法 （3）注意事项
㈠菌种保藏的目的及原理
菌种保藏是保证生产菌种质量的重要环节，其目的 在于不污染杂菌，使退化和死亡降低到最低限度，尽可 能使菌种保持原来的优良性状。 基本原理：根据菌种的生理、生化特性，人为的创 造条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受到抑 制的休眠状态，以减少菌种的变异。
保藏时一般利用菌种的休眠体（孢子、芽 孢等）并创造有利于休眠状态的环境条件， 如降低培养基营养成分、低温、干燥、缺氧 和添加保护剂等，使菌种的代谢活性处于最低 状态，以达到防止菌种退化、死亡的目的。
㈡
常用的保藏方法
1、斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后， 棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单， 使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、 变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化 学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而 影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。
7、液氮超低温保藏法
液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、 二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的 方法。 此法操作简便、高效、保藏期一般可达到15年以上，是目前 被公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。除了少数对低温损伤 敏感的微生物外，该法适用于各种微生物菌种的保藏 。 优点是可使用各种培养形式的微生物进行保藏，无论是孢子 或菌体、液体培养物或固体培养物均可采用该保藏法。其缺点 是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。