糖基化终末产物对人表皮角质形成细胞周期调控的影响机制
晚期糖基化终末产物(AGEs)与衰老
晚期糖基化终末产物(AGEs)与衰老孙红艳;刘洪臣【摘要】晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products,AGEs)是人体内的还原糖与蛋白质或脂质发生不可逆反应所形成的,是非酶糖基化衰老理论的最终产物.近年来的研究表明,AGES的存在不仅与糖尿病关系密切,还与衰老有着紧密的联系.AGEs在人类和动物的多种组织中随着年龄的增长不断的积聚,可作为研究衰老的一项重要指标[1].本文从AGEs和衰老的角度综述了AGEs的形成过程、化学结构、以及在组织器官中的致衰老的机理.【期刊名称】《中华老年口腔医学杂志》【年(卷),期】2010(008)005【总页数】4页(P314-317)【关键词】晚期糖基化终末产物;衰老;年龄;标志物【作者】孙红艳;刘洪臣【作者单位】解放军总医院口腔医学中心,北京,100853;解放军总医院口腔医学中心,北京,100853【正文语种】中文【中图分类】R781.6随着世界人口老龄化问题的日趋严重，防衰抗老成为人们所关注的问题。
非酶糖基化衰老理论是目前已被众多学者公认的衰老理论之一。
晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products,AGEs)是非酶糖基化反应的终产物，它是一种蛋白质，随着年龄的增长，它在血清、组织中的生成和积聚是不可避免的。
人体内AGEs的蛋白修饰是老年性疾病的介导因素，可作为测试老化进程的时钟[2]。
糖基化会造成的蛋白质的交联损伤，能使正常的蛋白结构转变成老年蛋白的结构，AGEs随着年龄增长在体内积聚增多，会造成人体内血管壁的硬度增加；会通过直接或间接的作用导致骨代谢的失衡，导致骨质疏松；[3]AGEs存在还会使大脑神经中枢的星形胶质细胞发生一系列形态与功能的变化。
本文将就上述三方面以及AGEs的形成过程、致衰老机理做如下综述。
1.AGEs的形成过程、结构特点AGEs的来源分为外源性和内源性两种，外源性主要来自富含碳水化合物和含脂肪多的食物，另有报导吸烟可产生AGEs[4]。
糖化终末产物刺激胰岛中NADPH氧化酶水平升高
（ Ｐ＜０ ． ０ ５ ） ． 随着 Ａ Ｇ Ｅ ｓ 作 用时间的延 长 ， Ｎ Ａ Ｄ Ｐ Ｈ氧 化酶 活力逐渐 升 高， ２ ４ ｈ时迭 最高 ， 后有 所下 降 ， 但仍高 于对照组 。结论 ： 糖化 终末产物作 用于胰 岛后导致 Ｎ Ａ Ｄ Ｐ Ｈ氧化酶 活性 增加 ， 进 而 引起胰 岛损 害。
ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｌ ｕ ｍｉ ｎ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｃ ｅ ．Ｒｅ ｓ ｕ ｉ ｔ ｓ Ｎｏ ｘ ２ ｍＲＮＡ ｌ ｅ ｖ ｅ ｌ ｗａ ｓ １ ． ７ ５．２ ． ３ １ － ｆ ｏ ｌ ｄ ｈ ｉ ｇ ｈ ｅ ｒ ｉ ｎ ＡＧＥ ｓ ｉ ｎ ｔ ｅ ｖｅ ｒ ｎ ｅ ｄ ｇ ｒ ｏ ｕ ｐ ｔ ｈ ａ ｎ ｃ ｏ ｎ ｈ ｒ ｅ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｌ ｙ ． Ｔ ｈ ｅ ＮＡＤ ＰＨ ｏ ｘ ｉ ｄ ａ ｓ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｗ ａ ｓ ｉ ｎ ｃ ｒ ｅ ａ ｓ ｅ ｄ ｂ ｙ ＡＧＥｓ ｓ ｔ ｉ ｍｕ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｍｅ ｄ ｅ ｐ ｅ ｎ ｄ ｅ ｎ ｔ ｍａ ｎ ｎ ｅ ｒ ． Ａ ｄ ｉ ｓ ｔ ｉ ｎ ｃ ｔ ｐ ｅ ａ ｋ ｗ ａ ｓ ａ ｔ ２ ４ ｈ ｏ ｕ ｒ ｓ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｎ ｗ ｉ ｔ ｈ ａ ｄ ｅ ｃ ｌ ｉ ｎ ｅ． ｗｈ ｉ ｃ ｈ ｉ Ｓ ｓ ｔ ｉ ｌ ｌ ｈ ｉ ｇ ｈ ｅ ｒ ｔ ｈ ａ ｎ ｔ ｈ ａ ｔ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ １ ．
终末糖基化产物
终末糖基化产物终末糖基化产物（Advanced Glycation End Products，简称AGEs）是指一类由糖类与蛋白质、核酸及脂质等生物大分子结合而形成的化合物，在机体老化、糖尿病、心血管疾病、癌症等广泛疾病的发生和发展中起到了重要的作用。
本文将详细介绍终末糖基化产物的形成、生物学功能及与疾病的关系。
被糖化的蛋白质具有许多特征性质，如蛋白质的极性、降解等特征均受到明显的影响。
许多生物大分子的糖化都是可逆的，但也有一些是不可逆的，例如骨胶原，糖化使其变得坚韧，难以降解，形成了复杂的交联构形，影响了正常的生物学功能。
终末糖基化产物具有许多生物学功能，其中最明显的是其具有致炎性和氧化应激作用。
这是因为终末糖基化产物可以通过介导核因子κB（NF-κB）信号传导通路来激活白细胞，增强炎症反应。
此外，终末糖基化产物也能够促进ROS的产生和耗尽抗氧化物质，导致细胞氧化应激的加重以及细胞凋亡的发生。
尽管终末糖基化产物具有负面生物学效应，但它们同样也具有一些正面的生物学效应。
例如，终末糖基化产物与蛋白质结合以促进干扰素的释放，在抗病毒网络中发挥了特定的角色。
此外，糖化的人体骨胶原不仅更加坚韧，而且通过诱导成纤维细胞的增殖、侵袭和分化等机制，也能促进伤口的愈合，参与生物体的组织修复过程。
终末糖基化产物在疾病的进展中发挥了重要作用。
根据一些研究的结果表明，血液中AGEs的浓度与多种慢性疾病的发生和发展有着非常密切的关系。
其中最显著的是老年痴呆症、糖尿病、心血管疾病和肿瘤等。
在这些疾病的进展中，终末糖基化产物的积累和沉积不断加重，从而加速了机体的生理衰老。
老年痴呆症是一种常见的神经系统退行性疾病。
研究表明，炎症介导的终末糖基化产物和其受体RAGE的信号转导通路与老年痴呆症的发病和发展密切相关。
与此相应的是，抗衰老和抗糖基化活性药物能够减轻终末糖基化产物在老年痴呆症中的病理变化。
糖尿病是世界范围内的公共卫生问题。
晚期糖基化终末产物与糖尿病慢性并发症的研究进展2023
晚期糖基化终末产物与糖尿病慢性并发症的研究进展2023摘要糖尿病已经成为威胁民众健康的重要公共卫生问题。
晚期糖基化终末产物(AGE)是体内葡萄糖或其他还原糖的醛基或酮基与蛋白质、核酸、脂质等一些大分子物质的自由氨基经过系列反应生成的不可逆终末产物，其可在机体内引起一系列氧化级联反应,进而诱导组织损伤。
研究表明,AGE的临床检测对糖尿病慢性并发症的早期诊断及预后评估具有重要作用。
其中皮肤自体荧光光谱法(SAF)测得的AGE与年龄相结合的新参数SAF-AGEage在预测糖尿病大血管并发症上可能具有良好的临床应用前景。
止矽卜,近年研究发现AGE与糖尿病患者的认知功能障碍亦密切相关。
该文就AGE的形成、测量方法、AGE与糖尿病不良结局的关系以及AGE干预治疗相关研究进展进行综述。
随着社会的进步和经济的高速发展，糖尿病已经成为威胁民众健康的重要公共卫生问题。
据流行病学调查显示，2023年全球20~79岁的成年人中有5.37亿糖尿病患者,预计2045年全球糖尿病患病人数将增长至7.83亿［1］。
除糖尿病高患病率外，糖尿病相关大血管和微血管并发症导致医疗花费大、致残致死率高，因此防治糖尿病慢性并发症极为重要。
晚期糖基化终末产物(advancedg1ycationendproducts,AGE)是在非酶促条件下，体内葡萄糖等还原糖的醛基或酮基与蛋白质、核酸、脂质等一些大分子物质的自由氨基经过系列反应生成的不可逆终末产物。
AGE能够在体内快速生成与积聚，引起一系列氧化级联反应，进而诱导组织损伤［2,3］,在糖尿病慢性并发症的发生、进展中发挥重要作用。
此外，近年亦有研究着眼于AGE与糖尿病患者认知功能障碍间的关系。
本文就AGE的形成、测量方法、AGE与糖尿病不良结局的关系及AGE干预治疗的研究新进展进行综述。
一、AGE概论1 .AGE的形成与结构：机体内蓄积的AGE可分为内源性与外源性两类。
内源性AGE产生的经典机制为葡萄糖或还原糖与蛋白质之间的美拉德反应，分为3个阶段:(1)还原糖的粉基和蛋白质的氨基缩合形成希夫碱；(2)希夫碱经分子内重排形成更为稳定的随氨类化合物，至此阶段的反应均是可逆的［4,5］;(3)酮氨类化合物通过断裂、环化、降解等一系列反应生成活性粉基中间体，再与蛋白质的自由氨基进行一系列复杂的反应最终形成不可逆产物AGE。
S100蛋白家族在肿瘤中的研究进展
S100蛋白家族在肿瘤中的研究进展【摘要】S100蛋白家族在肿瘤发生发展中发挥重要作用。
在s100基因家族中，共有22种异构体聚集在染色体1q21上且常在肿瘤组织中异常表达。
S100蛋白参与许多细胞内外功能，比如调节细胞内环境Ca2+稳态、细胞增殖与凋亡、细胞侵袭、蛋白磷酸化、细胞支架构成、自身免疫和炎症等。
许多研究表明s100蛋白异常表达与肿瘤进展及预后密切相关。
因此，S100蛋白将有望成为新的肿瘤标志物和靶向治疗目标。
本文将重点阐述s100蛋白在肿瘤中的作用。
【关键词】s100；细胞凋亡；细胞增殖；细胞分化；肿瘤【中图分类号】R730.2 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）05-0698-01S100蛋白在细胞内外各种生物学过程中的复杂功能对肿瘤的发生进展发挥重要作用。
对于s100蛋白促进肿瘤恶化和转移中的生物性行为，未来研究需要更深的揭露其具体的分子机制和信号通路，为临床治疗提供新的治疗靶点和标志物。
1 S100的生物性S100基因家族是EF-hand类型Ca2+结合蛋白中最大的亚族。
迄今为止，S100基因至少有25种不同的异构体，其中有22种位于异变染色体1q21上。
S100蛋白以同源二聚体或二聚体复合物的形式存在[1]。
大多数S100蛋白经过构象的改变都可与Ca2+结合，这种与不同靶蛋白结合的能力使其表现出广泛的细胞内外活性。
S100蛋白细胞内功能包括调节内环境Ca2+稳态、细胞周期循环、细胞生长与迁移、细胞支架构成、转录分子调控等。
与此相反，细胞外S100蛋白以细胞因子结合到细胞表面受体的方式，如晚期糖基化终末产物（RAGE）和Toll样受体（TLRs）发挥功效[2]。
s100密切参与肿瘤发生和进展的生物学行为，使其备受瞩目。
许多研究支持S100蛋白与肿瘤的密切关系，首先大多数S100基因聚集在1q21染色体上，后者极易发生染色体的重组，促肿瘤发生；其次，在许多恶性肿瘤中S100蛋白表达增加，推测其异常表达与肿瘤发展相关；最后，某些S100蛋白可与肿瘤相关蛋白作用并调节NF-kB、p53和β连锁蛋白等肿瘤因子，加速肿瘤发展。
糖尿病微血管并发症
随着糖尿病发病率的上升、糖尿病患者寿命的延长、糖尿病微血管并发症患者数量逐渐增加，糖尿病微血管并发症已经成为糖尿病患者主要的致残病因，严重影响糖尿病患者的生活质量。
多年来，学者们对糖尿病微血管并发症发病机理、病理改变、临床表现和治疗进行了研究，现综述如下。
发病机理晚期糖基化终末产物(AGEs)生成增多：高血糖可与血液循环中游离氨基酸和组织中的蛋白质非酶性结合，形成AGEs，被AGEs前体修饰的细胞内蛋白质功能发生改变，内皮细胞的通透性增加，细胞外蛋白质糖基化可干扰基质与基质的相互作用，影响多种基质分子的结构和功能，AGEs与细胞内的特异性受体结合，向细胞外分泌基质，抑制基质分子清除降解，基底膜增厚，与细胞上的特异性受体结合后，还诱导炎性因子和生长因子的产生，参与炎性反应，AGEs还与低密度脂蛋白结合，导致血管的动脉硬化。
多元醇通路活性增高：高血糖使细胞内葡萄糖水平升高，激活醛糖还原酶，导致葡萄糖大量转换为山梨醇，造成细胞内髙渗状态，细胞结构破坏，细胞内山梨醇集聚还抑制了肌醇转运系统，使细胞内肌醇储备耗竭，细胞膜Na+-K+-ATP酶活性降低，使得血管的通透性增加，山梨醇被山梨醇脱氢酶氧化为果糖，果糖及其产物3磷酸果糖激发非酶糖基化，AGEs生成增加。
蛋白激酶C(PKC)通路的激活：高血糖使细胞内二酯酰甘油显著升高，导致蛋白激酶活性升高，PKC的活化可使细胞外的基质合成增加，还可抑制一氧化氮合成酶的活性，一氧化氮产生减少，促使血管强烈收缩，使血管通透性增高和血管瘤形成；PKC能够调节血小板的黏附、聚集与分泌功能，促进高凝、低纤溶和高血黏度的形成，血管内容易出现微血栓。
己糖胺通路：高血糖激发谷氨酰胺-6-磷酸果糖转氨酶活性，从而激活己糖胺通路，促进生长因子和炎性介质的释放，促进血管的新生和炎性损伤。
氧化应激：线粒体电子传递链过氧化物产生过量是高血糖诱导氧化应激的主要来源，并且是高血糖增加多元醇通路、AGE形成、PKC活性和己糖胺通路的共同机制。
晚期糖基化终末产物
王兴国 : 烹调致病――“晚期糖基化终末产物”(2014-03-25 19:55:09)下一个高温烹调――食物AGEs增加――血液及其他组织中AGEs (Advanced Glycation End products) 增加――数种慢性病风险增加，这一链条各个环节的证据都已经比较充分，是时候得出结论做出改变了。
油炸、油煎、烧烤、烘烤、焙烧等高温烹调食物不仅会产生致癌物质（如多环芳烃类和丙烯酰胺等）。
还产生“晚期糖基化终末产物”（AGEs）导致糖尿病、冠心病、阿尔茨海默病、骨质疏松等。
当我第一次看到“晚期糖基化终末产物”（AGEs）对健康有重要影响时，我最想了解的是这个名词：“终末产物”都是什么东东？“糖基化”的对象是谁？晚期”意味着还有早期？“产物”意指化学反应生成的结果，“终末产物”则暗示不是一步或一个化学反应，而是一系列或多个化学反应。
实际上，直到目前，这些终末产物的具体分子结构也没完全搞清楚，但已经知道一些，如羧甲基赖氨酸(CML)、戊糖苷素、3- 脱氧葡萄糖酮酸、吡咯素(Pyrraline)、吡咯醛、丙酮醛（MG）等等【对这些名词陌生的人可以笼统地称之为“毒素”】。
最重要的是，这些产物（AGEs）可以用仪器检测，这使广泛、深入研究它们成为可能。
最基本的事实是，人体内绝大多数部位或器官都能检测到AGEs，食物中也能检测到AGEs，而且某一个人体内的AGEs和Ta食物中AGEs的多少有密切关系。
“糖基化”是一系列化学反应的开始，是葡萄糖、果糖、蔗糖等糖类（以及含有它们的基团）与蛋白质（可能还有某些脂质、核酸等）分子末端的胺基发生缩合反应。
这反tt应有点快，且摇摆不定，生成产物称为“早期糖基化产物”。
之后继续发生一系列脱水、氧化及化学重排等发杂反应，产物即“晚期糖基化终末产物”（AGEs）。
这种反应在食品加工（烹调）过程中发生是很早就知道的，食品学称之为“褐变反应”或“美拉德反应”。
但在人体内也会发生类似的反应却是近年才确认的事实。
AKT／GSK—3β—Wnt／β—catenin信号通路调控糖尿病血管钙化的研究新进展
AKT／GSK—3β—Wnt／β—catenin信号通路调控糖尿病血管钙化的研究新进展在全世界范围内，糖尿病的发病率越来越高，而血管钙化作为糖尿病的并发症之一，在2型糖尿病患者的疾病发生、发展过程中占据着越来越重要的地位。
血管钙化是一个与炎症相关的类似于骨组织中的成骨分化形式的大型的主动调控的过程。
有研究表明，在糖尿病血管钙化中，PI3K/AKT信号通路能通过直接或者间接的方式激活wnt/β-catenin信号通路，从而促进了血管平滑肌细胞的成骨分化。
本文分别从AKT、GSK-3β、Wnt/β-catenin等三个方面阐述其与血管钙化之间的联系。
标签：血管钙化；AGEs；AKT；GSK-3β；Wnt/β-catenin血管钙化大多数是在血管壁中以羟磷灰石的形式存在的矿物硫酸钙的沉积。
血管钙化是许多疾病一个共同的显著特点，这些疾病包括动脉粥样硬化，糖尿病，慢性肾脏疾病等，在越来越多的国家，血管钙化逐渐成为心脑血管疾病发病率和致死率的一个强有力的预测指标[1]。
血管钙化过去一度被认为仅仅是一个被动的细胞凋亡和死亡的过程，但越来越多研究结果证明，血管钙化是一个与炎症相关的类似于骨组织中的成骨分化的主动调控过程。
Proudfoot等[2]研究发现，血管平滑肌细胞目前被认为是主要负责血管钙化的细胞，来自平滑肌细胞的凋亡小体能作为钙晶体形成的成核结构来启动血管钙化。
Ox-LDL已经被揭示具有能在在动物体内和体外诱导血管平滑肌钙化的能力[3]。
此外，Trion等[4]研究发现，血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）可以向成骨细胞分化和表达成骨关键转录因子-Runx2和其他骨形成相關蛋白，如Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ），碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素等，这些蛋白导致磷酸钙在细胞外基质沉积。
而这些成骨相关蛋白均受AKT/GSK-3β-Wnt/β-catenin信号通路的调控。
糖病的糖化终末产物的影响
糖病的糖化终末产物的影响糖尿病是一种以高血糖为特征的慢性病，其发生发展与糖化终末产物密切相关。
糖化终末产物（Advanced Glycation End Products, AGEs）是由糖分子和蛋白质或脂肪分子结合而成的复合物，它们的产生与高血糖、长期高糖摄入、氧化应激等一系列因素相关。
在本文中，我们将探讨糖病的糖化终末产物对人体健康的影响，并提出预防和控制的方法。
1. 糖化终末产物的形成与对糖尿病合并症的影响糖化终末产物的形成是一个复杂的过程，当血糖过高时，糖分子会与蛋白质、脂肪等分子发生非酶催化的反应，形成糖化产物。
这些糖化产物进一步发生交联和聚集，形成糖化终末产物。
糖化终末产物的堆积和沉积会引起多种糖尿病合并症的发展，如糖尿病肾病、糖尿病性视网膜病变等。
2. 糖化终末产物对糖尿病患者的心血管系统的影响糖化终末产物会促进动脉粥样硬化的形成，增加心脏病和中风的风险。
其通过多种途径影响心血管系统，包括增加血管内皮细胞的外分泌、促进脂质氧化、加速血小板聚集等。
因此，糖尿病患者要特别关注控制血糖的同时，避免过多摄入糖化终末产物。
均衡的饮食、适当的运动和规律的药物治疗是预防心血管疾病的关键。
3. 糖化终末产物对糖尿病患者的神经系统的影响糖尿病合并神经病变是常见的并发症之一，糖化终末产物在其中起着重要的角色。
它们会直接损伤神经细胞，导致神经传导功能障碍和神经炎症反应。
此外，糖化终末产物还会增加细胞外基质的沉积，使神经细胞周围环境恶化。
因此，降低血糖水平、控制糖化终末产物的积累对于预防和治疗神经病变至关重要。
4. 控制糖化终末产物的方法为了降低糖病的糖化终末产物对人体的不良影响，需要从以下几个方面进行预防和控制：（1）控制血糖水平：保持血糖在正常范围内是预防和减少糖化终末产物形成的基础。
糖尿病患者应该注意饮食控制、适量运动和规律服药，以维持血糖水平的稳定。
（2）饮食调整：限制高糖食物的摄入，增加富含抗氧化物质的食物，如蔬菜、水果和富含ω-3脂肪酸的食物。
表观遗传学在动物发育中的调控作用及机制分析
表观遗传学在动物发育中的调控作用及机制分析表观遗传学是指在不改变DNA序列的情况下，通过修饰DNA、染色体和基因表达的方式，影响遗传信息传递和表现的遗传学分支。
它将外界环境与内部基因表达状态建立联系，提供了一种涉及基因表达调控的机制。
表观遗传学在动物发育过程中起着重要的调控作用，本文将对此进行探讨。
一、表观遗传学的基本机制表观遗传因素可分为DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA三类，其中DNA甲基化作用最为重要。
DNA甲基化是指甲基转移酶将甲基基团连接于DNA中的胞嘧啶基上，从而改变DNA物理性质及对转录的影响，引起基因表达的变化。
组蛋白修饰则指不同酶类在组蛋白上连接不同的功能基团，从而改变组蛋白的电荷、构象和功能，影响DNA的可接近性和基因表达状态。
非编码RNA（ncRNA）是指不能转化为蛋白质，但能够在mRNA水平或上游参与基因表达调控的RNA。
其中，miRNA是经过剪接和加工处理的20-25nt的小RNA，可以靶调靶向特定的mRNA，在转录后的阶段发挥靶向基因表达的作用。
二、表观遗传材料是动物发育的调控因素表观遗传学在动物发育中起着至关重要的作用。
从受精卵开始，通过在不同时期的表观遗传调控，细胞得以进入细胞周期并进行细胞分化。
例如，发育过程中的细胞增殖、生长、细胞命运决定、细胞通信等都受表观遗传调控。
这是因为，在某些细胞中已经表达的基因会被甲基化修饰，而许多未表达的基因则未被甲基化，这样便可以改变基因表达的状态。
标记物是指可以通过表观遗传调控来标记细胞成长及特定类型活动的物质。
例如，细胞分泌的角色素就是一种表观遗传标记，在神经系统发育过程中起着非常重要的调节作用。
而糖基化的标记器则可以在胚胎发育阶段对细胞进行鉴别，解决胚胎中新生细胞的定向分化问题。
三、表观遗传学对基因诱导的影响表观遗传学对基因诱导的贡献来自于它在成年生物细胞再生、新生细胞命运决定、肥胖病、癌症等情况中的关键作用。
在动物胚胎发育早期，基因诱导是完成固定发育方向的重要基础作用。
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糖基化终末产物对人表皮角质形成细胞周期调控的影响机制（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：董叫云，牛轶雯，谢挺，青春，陆树良【摘要】目的通过体外试验探讨糖基化终末产物(AGEs)对表皮角质形成细胞周期调控的影响机制。
方法体外培养的人表皮角质形成细胞经AGEs(150mg/ml)作用后，用噻唑兰(MTT)法研究其增殖活力、流式细胞仪研究细胞周期和凋亡率。
用小片断RNA干扰(siRNA)的方法阻断细胞中AGEs受体(receptor of AGEs,RAGE)mRNA的表达,realtime PCR鉴定其阻断效率。
RT PCR法检测RAGE阻断前后各组细胞内RAF1、黏着斑激酶(FAK)、周期素(cyclin)D1、cyclinB1、周期表依赖性激酶4(CDK4)的核酸水平表达差异。
结果经AGEs干预后表皮角质形成细胞增殖活性下降，凋亡率升高，细胞周期G2期的比例显著增高，而细胞周期调控相关因子及信号因子RAF1、cyclinD1、cyclinB1、CDK4的核酸表达较对照组却明显升高，用RAGE 阻断以上因子后表达则与对照组相比无差异。
结论在上述体外模型下，表皮角质形成细胞的周期调控因子升高，而增殖却下降且凋亡增加，可能是AGEs干预后细胞内启动内源性代偿调控机制，且这种调控机制与其受体(RAGE)途径相关;AGEs也可能还通过以上细胞周期调控因子以外的其他途径或机制影响细胞生物学功能。
【关键词】糖基化终末产物;周期素D1;周期素B1;周期素依赖性激酶4;细胞增殖Abstract：Objective To explore the mechanisms of disordered cell cycle in keratinocytes that were mediated by advanced glycation end pruducts (AGEs) in vitro.Methods Human epidermal keratinocytes(HEK) were incubated with or without AGEs(150mg/ml),and 150mg/ml BSA(bovine serum albumin) was supported in the normal medium as controls in this study.After 48 hours of incubation,cell apoptosis and cell cycle were detected through flow cytometer,and the cell growth activity was assayed by MTT method.The receptors of AGEs(RAGE) were interrupted by siRNA,and the silencing efficiency was affirmed with real time PCR.The expressions of RAF1,FAK,cyclinD1,cyclinB1,CDK4 on mRNA levels were examined with RT PCR before and after gene silencing.Results The reduced cell proliferation and increased apoptosis were found by AGEs (150mg/ml) interruption.The percentages of G2 stages in cell cycle were augmented significantly and the expressions of cell cycle relative factors,such as RAF1,cyclinD1,cyclinB1,CDK4,were raised significantly onmRNA levels mediated by AGEs before genes silencing.But there were no statistical differences in these factors between AGEs group and control ones after RAGE were interrupted by siRNA.Conclusion In this study model,the phenomena of increased cell cycle relative factors and inhibited cell proliferation might be one of the endogenous compensating mechanisms in keratinocytes treated with AGEs.This mechanism was correlated with RAGE signal pathway.AGEs may have impact on cell cycle in other pathways except above relative factors in the study.Key words:AGEs;cyclinD1;cyclinB1;CDK4;cell proliferation 随着人类生活模式的改变，糖尿病已成为新世纪的慢性流行病，目前全世界糖尿病人已近2亿，预测到2025年将上升到3.33亿[1]。
随着糖尿病慢性病程的延长，其并发症发生也越来越普遍，如糖尿病创面难愈是临床的常见现象，近年来关于其治疗手段和病理机制探讨越来越受到关注。
我们课题组经过近十年的研究发现糖尿病大鼠皮肤中糖基化终末产物(AGEs)蓄积增加、参与创面修复的表皮角质形成细胞、成纤维细胞及内皮细胞的活性和功能受抑。
已证实AGEs主要通过AGEs受体(RAGE)途径影响细胞功能[2]。
本研究聚焦于表皮角质形成细胞，旨在探索AGEs对其细胞周期调控蛋白的影响及其可能的机制和途径，试图为临床治疗寻找新的靶点和依据。
材料与方法1 AGEs的制备参照经典的AGEs制备方法，将牛血清白蛋白(BSA)与葡萄糖在体外共同孵育，使BSA糖基化而形成AGEs产物，具体制备过程及鉴定参见林炜栋等文献[3]，并于-20℃长期保存，同时以磷酸盐缓冲液(PBS)替代葡萄糖，同等条件下与BSA共孵育，作为基质空白对照组的添加物。
2 细胞培养人表皮角质形成细胞株，HEKC0015C(Human Epidermal Keratinocytes，C0015C),在HEK基础培养基EpiLife(M EPI500)中培养，添加HEK生长添加剂HKGS(S0015)。
细胞在37℃、5%CO2培养箱中生长，隔天换液。
用胰酶TE(R001100)消化贴壁细胞，并用中和剂TN(R002100)中和胰酶。
所有试验均选用5～10代的细胞。
细胞分3组：对照组(control组):细胞培养于上述基础培养液中;AGEs组：细胞以150mg/mlAGEs干预;BSA组：细胞以150mg/ml基质空白对照液干预。
细胞株及其培养体系均购于Cascade,INC.U.S.A。
3 MTT检测细胞增殖活性5×104细胞接种于6孔板，待细胞融合至70%，分组刺激24、48小时后，各孔加5mg/ml MTT 100ml，37℃培养4小时，弃上清液，各孔加300ml二甲亚砜(DMSO)充分震荡15分钟，将液体吸出移至96孔板100ml/孔，于450nm用全波长酶标仪(SM190,MD,U.S.A)读取吸光度值(OD)。
4 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡细胞接种于25cm2培养瓶中，待生长融合至70%，分组刺激48小时后用TE消化收集细胞，PBS洗涤1次，用膜联蛋白V异硫氰酸荧光黄(Annexin V FITC)和碘化丙啶(propidium iodide,PI) 标记细胞,室温下避光孵育15分钟，经流式细胞仪进行凋亡检测;用脱氧核糖核酸(RNA)酶，表面活性剂Triton X 100 37℃水浴15分钟，再加入PI混匀，经流式细胞仪进行细胞周期检测。
用Lysis软件分析细胞周期(分为G1期、S期、G2期)及凋亡比例。
5 siRNA干扰细胞接种于6孔板，依上所述在基础培养体系中生长，待融合至70%进行RNA干扰。
用300μml 0.1%二乙基焦磷酰胺(DEPC)水溶解RAGE siRNA(sc36374,Santa Cruz)至10μmol/l,每孔用800μl不含HKGS的EpiLife与10μl siRNA充分混匀，再加入12ml转染试剂(13778150,Invitrogen,US)，室温孵育30分钟。
另按此比例配制600μl不含RAGE siRNA的混合液，作为阴性对照。
用不含HKGS的EpiLife培液清洗细胞，后加入600μl/孔上述混合液，37℃、5%CO2培养4小时,再加入含HKGS的EpiLife培液继续培养48小时，收集细胞标本，进行干预结果的检测。
6 细胞核酸提取及PCR检测细胞经TE消化后，用冷PBS清洗1次，依照Trizol (15596026,Invitrogen)说明书所述步骤，提取细胞总RNA。
逆转录体系为两步法：(1)oligo(dT)2μl、RNA 4mg、加水至24μl, 72℃5分钟;(2)5×转录缓冲液10μl、核苷酸混合物3μl、RNA酶抑制剂1μl、逆转录酶 2μl,42℃ 60分钟。
逆转录所用试剂均购于promega 公司。
实时定量PCR检测:10ml FQ PCR Premix(syber green)(轩昊科技)、2μl 引物(2μM)、1μl cDNA、7μl H2O。
95℃ 15分钟;95℃15秒、60℃ 40秒,40个循环;95℃ 15秒、60℃ 1分钟、95℃ 15秒。
用ABI 7500实时定量荧光PCR仪进行扩增和检测。
PCR检测：0.125μl HS Taq、2.5μl 10×PCR缓冲液、2μl核苷酸、1μl引物(20μM)、1μl cDNA、18.375μl H2O，所用试剂均购于Takara(DR001)。
94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分钟，35个循环，72℃ 5分钟。
用T Gradiant 梯度PCR仪(Biometra,德国)进行扩增。
产物经2% agrose Gel、80v电泳，凝胶图像分析仪Universal Hood(Bio Rad)摄取图像，用QuantityOne进行灰度值计算和数据分析。