限制性内切酶一览表
限制性内切酶酶切位点汇总
限制性内切酶酶切位点汇总Acc65I识别位点AccI识别位点AciI识别位点AclI识别位点AcuI识别位点AfeI识别位点AflII识别位点AflIII识别位点AgeI识别位点AhdI识别位点AleI识别位点AluI识别位点AlwI识别位点AlwNI识别位点ApeKI识别位点ApoI识别位点AscI识别位点AseI识别位点AsiSI识别位点AvaI识别位点AvaII识别位点AvrII识别位点BaeI识别位点BamHI识别位点BanI识别位点BanII识别位点BbvCI识别位点BceAI识别位点BcgI识别位点BciVI识别位点BclI识别位点BfaI识别位点BfuAI识别位点BglI识别位点BglII识别位点BlpI识别位点Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点BmtI识别位点BpmI识别位点BpuEI识别位点BsaAI识别位点BsaBI识别位点BsaHI识别位点BsaI识别位点BsaJI识别位点BsaWI识别位点BsaXI识别位点BseRI识别位点BseYI识别位点BsiEI识别位点BsiHKAI识别位点BsiWI识别位点BslI识别位点BsmBI识别位点BsmFI识别位点BsmI识别位点BsoBI识别位点Bsp1286I识别位点BspCNI识别位点BspDI识别位点BspEI识别位点BspHI识别位点BspMI识别位点BspQI识别位点BsrBI识别位点BsrDI识别位点BsrFI识别位点BssHII识别位点BssKI识别位点BssSI识别位点BstAPI识别位点BstBI识别位点BstEII识别位点BstNI识别位点BstXI识别位点BstYI识别位点BstZ17I识别位点Bsu36I识别位点BtgI识别位点BtgZI识别位点Cac8I识别位点ClaI识别位点CspCI识别位点CviAII识别位点CviKI-1识别位点CviQI识别位点DdeI识别位点DpnI识别位点DpnII识别位点DraI识别位点DraIII识别位点DrdI识别位点EaeI识别位点EaeI识别位点EagI识别位点EarI识别位点EciI识别位点EcoNI识别位点EcoO109I识别位点EcoP15I识别位点EcoRI识别位点EcoRV识别位点FatI识别位点FauI识别位点Fnu4HI识别位点FokI识别位点FseI识别位点FspI识别位点HaeII识别位点HaeIIIHgaI识别位点HhaI识别位点HincII识别位点HindIII识别位点HinfI识别位点HinP1I识别位点HpaI识别位点HpaII识别位点HphI识别位点Hpy188I识别位点Hpy188III识别位点Hpy99I识别位点HpyAV识别位点HpyCH4III识别位点HpyCH4IV HpyCH4V识别位点KasI识别位点KpnI识别位点MboI识别位点MboII识别位点MfeI识别位点MluI识别位点MlyI识别位点MmeI识别位点MnlI识别位点MscI识别位点MseI识别位点MslI识别位点MspA1I识别位点MspI识别位点MwoI识别位点NaeI识别位点NarI识别位点NciI识别位点NdeI识别位点NgoMIV识别位点NheI识别位点NlaIII识别位点NlaIV识别位点NmeAIII识别位点NotI识别位点NruI识别位点NsiI识别位点NspI识别位点PacI识别位点PaeR7I识别位点PciI识别位点PflFI识别位点PflMI识别位点PhoI识别位点PleI识别位点PmeI识别位点PmlI识别位点PpuMI识别位点PshAI识别位点PsiI识别位点PspGI识别位点PspOMI识别位点PspXI识别位点PstI识别位点PvuI识别位点PvuII识别位点RsrII识别位点SacI识别位点SacII识别位点SalI识别位点SapI识别位点Sau3AI识别位点Sau96I识别位点SbfI识别位点ScaI识别位点ScrFI识别位点SexAI识别位点SfaNI识别位点SfcI识别位点SfiI识别位点SfoI识别位点TseI识别位点SgrAI识别位点Tsp45I识别位点SmaI识别位点Tsp509I识别位点SmlI识别位点TspMI识别位点SnaBI识别位点TspRI识别位点SpeI识别位点Tth111I识别位点SphI识别位点XbaI识别位点SspI识别位点XcmI识别位点StuI识别位点XhoI识别位点StyD4I识别位点XmaI识别位点StyI识别位点XmnI识别位点SwaI识别位点ZraI识别位点TaqαI识别位点TfiI识别位点。
限制性内切酶
5’-G BamH I 3’-CCTAG
GATCT-3’ A-5’
Bgl Ⅱ
BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’ Sau 3A
Bgl Ⅱ
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
III类限制性内切酶
能完全肯定的识别位点和切割位点，但切 割位点也是在识别位点的一侧的一定距离，通 常距特异性位点24bp-26bp。
I 型：切割位点不确定，不适用于基因工程。 Ⅱ型：基因工程的工具酶。 Ⅲ型：切割位点不在识别位点，对分子克隆操作 亦无实用意义。
I型限制性内切酶
首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大 肠杆菌B株和K株分离得到。 作用原理：识别双链DNA未甲基化修饰的特异 序列，与该序列相互作用，然后延DNA分子移 动，在距离特异性识别位点约1000-1500bp处 随机切开一条单链，造成大约75个核苷酸的 切口。
4.DNA的分子结构
DNA分子的不同构型对限制性内切酶 的活性也有很大的影响。某些限制性核酸 内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量 要比消化线性的DNA量高出很多倍。
5. 缓冲液
是影响限制酶活性的重要因素。商品化的限 制酶一般都带有专用缓冲液。
化学组成 MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度 Tris-HCl：维持pH 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定
• 识别序列
通常识别的是4-8bp的回文序列，多为6bp，在 识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键。
• 酶切切口
齐平末端：在识别序列内的对称轴上切割，其 切割产物具平头末端（不易重新连接）。
限制性内切酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
G+
CCTAG
GATCC G
粘端切口
每一种限制酶能辨认特定的限制位点(restriction site) 。
多数限制酶不在两股的同一位置（即限制位点中央）切割，产生两个单股尾巴，
称粘性末端（cohesive/sticky end)，因为它容易与另一个DNA片段的互补黏端相结合。
5’NNNNNG
pAATTCNNNNNN3'
3’NNNNNCTTAAp
GNNNNNN5’
EcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）
16/35
5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘
5’NNNNNGTT 3‘NNNNNCAAp
pAACNNNNN3’ TTGNNNNN5’
甲基化酶 ：在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应 （1）dam甲基化酶
此酶在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，使一些识别顺 序中含有5'GATC3'的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA。
（2）dcm甲基化酶
此酶在序列5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’中的胞嘧啶C5上引入甲基.
6/35
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE) 是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割 双链DNA的一类内切酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
7/35
RESTRICTION ENZYMES
常见限制性内切酶识别序列
常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)（BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等）Time：2009-10-22 PM 15:38Author:bioer Hits: 7681 times在分子克隆实验中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。
无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T 载就不必考虑了）。
先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5' 端。
常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列，不过为了保险起见，还是得查证一下。
下面是一些常用的II型内切酶的识别序列，仅供参考。
先介绍一下什么是II型内切酶吧。
The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine.酶类型识别序列ApaIType II restrictionenzyme5'GGGCC^C 3'BamHIType II restrictionenzyme5' G^GATCC 3'BglIIType II restrictionenzyme5' A^GATCT 3'EcoRIType II restrictionenzyme5' G^AATTC 3'HindIIIType II restrictionenzyme5' A^AGCTT 3'KpnIType II restrictionenzyme5' GGTAC^C 3'NcoIType II restrictionenzyme5' C^CATGG 3'NdeIType II restrictionenzyme5' CA^TATG 3'NheIType II restrictionenzyme5' G^CTAGC 3'NotIType II restrictionenzyme5' GC^GGCCGC 3'SacIType II restrictionenzyme5' GAGCT^C 3'SalIType II restrictionenzyme5' G^TCGAC 3'SphIType II restrictionenzyme5' GCATG^C 3'XbaIType II restrictionenzyme5' T^CTAGA 3'XhoIType II restrictionenzyme5' C^TCGAG 3'要查找更多内切酶的识别序列，你还可以选择下面几种方法：1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站；2. 用软件如：Primer Premier5.0或Bioedit等，这些软件均提供了内切酶识别序列的信息；3. 推荐到NEB的REBASE数据库去查（网址：/rebase/rebase.html）当你设计好引物，添加上了内切酶识别序列，下一步或许是添加保护碱基了，可以参考：NEB公司网站提供的关于设计PCR引物保护碱基参考表下载（也可见图片）双酶切buffer的选择（MBI、罗氏、NEB、Promega、Takara）再给大家推荐一种新的不需要连接反应的分子克隆方法，优点包括：①设计引物不必考虑选择什么酶切位点；②不必考虑保护碱基的问题；③不必每次都选择合适的酶来酶切质粒制备载体；④而且不需要DNA连接酶；⑤假阳性几率低（因为没有连接反应这一步，载体自连的问题没有了）。
限制性内切酶综合资料
限制性内切酶综述(Restriction Endonucleases: An Overview)30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。
细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种"限制"病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。
首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于Heamophilus influenzae的Hind II和Hind III。
这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。
研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。
当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司开始寻找更多的限制性内切酶。
除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现。
人们正在从数以千计的细菌及古细菌中寻找新的限制性内切酶。
而对已测序的原核基因组数据分析表明，限制性内切酶在原核生物中普遍存在--所有自由生存的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶。
限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如Pvu II（157个氨基酸），也可以比1250个氨基酸的Cje I更大。
在已纯化分类的3000种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。
其中有30%是在NEB发现的。
对具有未知特异识别序列的限制性内切酶的研究发现工作仍在继续。
人们从分析细胞提取物的生化角度研究的同时，也采用计算机分析已知的基因组数据，以期有更多的发现。
尽管很多新发现的酶的识别序列与已有的重复--即同裂酶，仍然有识别新位点的酶不断被发现。
上世纪80年代，NEB开始克隆并表达限制性内切酶。
克隆技术由于将限制性内切酶的表达与原有细胞环境分离开来，避免了原细胞中其它内切酶的污染，从而提高了酶的纯度。
此外，克隆技术提高了限制性内切酶的产量，简化了纯化过程，使得生产成本显著降低；克隆的基因很容易进行测序分析，表达出的蛋白也能进行X射线结晶分析，这使得我们对于克隆产物更加确定。
史上最全限制性内切酶酶切位点汇总
专业资料分享A系列Aatll识别位点…G ACGT匕…一丁3：.. CJGC AG,, .5^Acc65l识别位点5…GFMK AC …3，3一. CA KMJG. . 5JAccl识别位点5…Gl\lK AC …丁3J. . CA KMJG. . 5JAcil识别位点5 …dtGC …3’ 宙…GG空…莎Acll识别位点5 …A A\；GTT .33\ .. T TG* A (X)Acul识别位点5；. CTG A AG(N). \ . . 3J 3d.. ,GACTTC(N)U A... 5J Afel识别位点5\.. AGC^CT..,3,3 …TCGJCGA..,5JAflll 识别位点5 …(fTT A AG…3，3：…G A A T T& …5"Afllll 识别位点5；.. ^CRYGT , ,3 3：…TGYRqA. . ,5Agel识别位点5P. . /fCCGGT , . .3J3；. . TGGCC^A. , .5^ Ahdl识别位点5P. G ACNN F/N NGTC... 3P 3- CTGNI^NNNCAG^.S^ Alel识别位点5；. .CACNt/NNGTG 3' 3. ..GTGNI^NNCAC, .. h Alul识别位点5 . .. A(jfcT….3P 3…TQSA-SAlwl识别位点5 r,GGATC(N)7「3"3. .. CCTAGIN)^..^AlwNl识别位点5：. CAGNNN T CTG..3F 3；. GTC^NNNG AC.. .5*Apal识别位点5 .., GGGCtft. ..3P3\., C^CCGGG .ApaLl识别位点5\.. (^TGCAC.. ,3J3 .. CACGTjGApeKl识别位点5P. . . t^CWGC., .3r3\. CGWCjp., .5^Apol识别位点5；,. FLATTY,, ,3J3 , _ Y TTA AJl. T.5"Ascl识别位点5：., GG^bGCGCC, .33 CCGCGCJ J G, .5JAsel识别位点5 . B 4A T't A A T t. , 3J3 . .. 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限制性内切酶1
基因工程中必须使用甲基化酶失活突变 的菌株。
3. 温度
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大 多数是37oC，少数要求40-65oC。
5. 缓冲液
是影响限制酶活性的重要因素。商品化的限 制酶一般都带用缓冲液。
化学组成
II型限制性内切酶
首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在 1970年从流感嗜菌株中分离出来。
作用原理：识别双链DNA上未甲基化修饰的 一 小段明确的序列（文序列），然后在识别 位点之内的特定位置切割。
• 一般性状
对热不稳定，通常是溶于含有50％甘油的缓冲 液中贮存于–20℃环境下。取出使用时必须立即置 于冰浴中。NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯 基有保护作用，
BamH I
Bgl Ⅱ
5’-GGATCC-3’
Sau 3A 5’-AGATCT-3’
3’-CCTAGG-5’
3’-TCTAGA-5’
III类限制性内切酶
能完全肯定的识别位点和切割位点，但切割 位点也是的一侧的一定距离，通常距特异性位 点24bp-26bp。
EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG
• 识别序列
通常识别的是4-8bp的回文序列，多为6bp，在 识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键。
• 酶切切口
齐平末端：在识别序列内的对称轴上切割，其 切割产物具（不易重新连接）。 粘性末端：在识别序列2条链对应位上错位切割， 有5’端突出的粘性和3’端突出的粘性末端。
粘性末端的意义：粘性末端突出的单链部分可以与相同的酶或 同尾酶切割得到的粘性末端的单链部分互补配对。
第五章(附)限制性内切酶
III型限制性内切酶
也是兼有限制-修饰两种功能的酶。它们 在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别 位点是反向重复序列；它们很少能产生完全 切割的片段，因而不具备实用价值，也没有 人将其商是用于DNA 分析和克隆的一类。 限制酶和甲基化酶是各自独立的两个酶,例如 EcoRI的限制酶是相同亚基的二聚体，而其相 应的甲基化酶为一单肽链。
一些酶识别连续的序列（如EcoR I识别 GAATTC）；而另一些识别不连续的序列 （如Bgl I识别GCCNNNNNGGC）。限制性 内切酶的切割后产生一个3'羟基端和一个5'磷 酸基团。它们的活性要求镁离子，而相应的 修饰酶则需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。这些酶 一般都比较小，亚基一般都在200-300个氨基 酸左右。
限制性酶的命名：根据分离出此酶的微生物
学名而定。取微生物属名的第一个字母和种 名的头两个字母组成三个斜体字母，遇有株 名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几
个不同的酶，则用罗马数字加以表示。例如
大肠杆菌的Eco RI，R表示株名，I表示该菌
中第一个被分离出来的酶。
已纯化分类3000种限制性内切酶；
新寄主的修饰标记而缺少祖代 寄主的修饰标记，只能感染新
的寄主类型，而不再能感染祖
代寄主。
这里所谓自我DNA和外源DNA是对于它的
限制—修饰模式而言, 凡限制—修饰模式相 同的DNA均为自我DNA，这包括同株系不 同个体的DNA，及寄生于这些菌株中的质 粒和噬菌体。 在同一个细胞内的不同类型的DNA，包括 细胞DNA，质粒DNA，噬菌体DNA等，都 具有同样限制—修饰模式。这些同一细胞 中的不同DNA可统称为该细胞中的居民 DNA(resident DNA)。
限 制 性 内 切 酶