植物内生菌分离处理方法汇总
植物内生菌DNA提取方法
在提取植物内生菌之前，植物需要表面灭菌，其具体操作为将植物浸泡在添加了0.02%的Tween-20的质量分数为1%的次氯酸钠溶液中1 min，再将植物浸泡在70%酒精中1 min，然后用硫代硫酸盐/Ringer’s（林格氏液）清洗3次，每.次1 min。
根和茎（土表面以上1 cm处）都要灭菌处理，将根茎切成片状。
为了更好地分析细菌的位置，灭菌后茎表皮撕下，茎内部按照之前的方法灭菌。
表皮组织和根最后一次淋洗液中的细胞都用来提取DNA。
植物不同组织的内生菌群落DNA提取通过直接研磨植物组织，步骤为溶解、提取和纯化步骤（方案一），或者在DNA提取前从片状植物组织中淋洗出细胞（方案二）。
东南景天表面灭菌方法：整株植物用自来水冲洗30 min，用蒸馏水洗3次，每次3 min。
用吸水纸吸去植物表面水分，用无菌剪刀在根基部将根系剪下，与植物地上部分开。
将根系用70 %酒精浸泡2 min，无菌水洗3次，3 % NaClO浸泡2次，每次1 min，然后用无菌水冲洗3次，每次2 min，最后一次清洗液涂LB平板。
1. 将2 g左右消毒后植物组织于无菌研钵中，加5 mL磷酸钠缓冲液（19.9 g Na2HPO4·H2O，1.27 g NaH2PO4·2H2O，H2O 定容到1 L）研磨至匀浆。
2. 将植物匀浆转移至50 mL无菌离心管中，摇床200 rpm振荡1-2 h，使细菌细胞尽可能的从植物组织中释放出来。
3. 取4 mL悬液于新的无菌离心管中，12 000×g离心10 min收集菌体细胞。
4. 弃上清，将收集的菌体细胞重新溶于550μL 1×TE buffer（Tris-EDTA；pH8）中加入10 mg mL-1溶菌酶10μL，37℃水浴1-4h。
5. 加入50μL 20% SDS和8μL 20 mg mL-1蛋白酶K，混匀，65℃水浴3h，期间轻轻上下颠倒混匀数次。
6. 加入200μL 5M NaCl，涡旋振荡15 s，12000×g离心10 min。
植物病原菌分离方法
病原菌分离方法一、实验原理：植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。
二、实验用具：酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等三、实验前的准备工作：1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml（1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。
（2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。
（3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌30min。
2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。
四、实验步骤：1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。
2、取样，病斑大小约20个（含病缘线）3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定）（2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装(3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸）（4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
4、表面消毒：（1）75%的酒精3ml~4ml没过样表面10s，快速吸掉酒精（2）3%~5%次氯酸钠（现配现用、避光）10ml消毒2~3min（3）无菌水冲洗2~3次5、转样：（1）器具经酒精灯消毒后无菌水水洗（2）培养皿上写明名称、分离时间后，在酒精灯旁转五点于培养基上。
菌类的分离和培养技术
菌类的分离和培养技术菌类（Fungi）是一类生物体，包括真菌（True Fungi）和微生物（Microfungi）两个大的类群。
菌类在生物圈中具有广泛的分布和重要的生态功能。
为了研究和利用菌类，科学家们开发了一系列分离和培养技术，以便从自然环境中获取纯种菌株以及大规模培养和应用特定的菌株。
本文将介绍菌类的分离和培养技术的基本原理和常用方法。
一、菌类的分离技术菌类的分离是指从混合菌群中获得纯种菌株的过程。
分离技术的关键是保持菌种的纯度和活力。
下面介绍几种常用的菌类分离技术。
1. 表层分离法表层分离法是最常用的菌类分离技术之一。
它适用于土壤、水域等含大量微生物的环境。
具体操作步骤为：取样→稀释→接种→均匀涂布→培养。
通过稀释操作可以使菌落分布在培养基表面，然后进行培养。
最后通过单菌落转接到新的培养基中得到纯种菌株。
2. 筛选法筛选法适用于需要寻找特定菌株的情况，例如寻找产生特殊代谢产物、拥有特定生态功能的菌株等。
筛选方法一般包括抗生素筛选、生理代谢筛选或染色筛选等。
在培养基中添加适当浓度的抗生素或其他化合物，只有目标菌株具有耐受能力，才能生长并形成菌落。
3. 寄主种菌法寄主种菌法是一种利用特定寄主与菌株共生的技术。
例如，某些菌株只通过与某种植物的根系共生才能生长。
通过将寄主植物的根系或其他寄主组织接种到含有该菌株的培养基上，就可以分离出特定的菌株。
二、菌类的培养技术菌类的培养是指将分离得到的纯种菌株在合适的环境条件下进行大规模的培养和繁殖。
下面介绍几种常用的菌类培养技术。
1. 液体培养法液体培养法是最常用的菌类培养方法之一。
通过将纯种菌株接种到含有营养物质的液体培养基中，利用摇床或震荡培养箱等设备进行培养。
液体培养法适用于大量培养、产生菌体、代谢产物等应用。
2. 固体培养法固体培养法是将菌株接种到固体培养基上，培养出菌落后进行培养的方法，常用的固体培养基有琼脂培养基等。
固体培养法主要用于分离和筛选菌株。
18株植物内生真菌的分离纯化及鉴定
桃金娘科番樱桃属
月橘
Murraya paniculata
芸香科九里香属
半夏
Pinellia ternata
天南星科半夏属
青木
Aucuba japonica 桃叶珊瑚科桃叶珊瑚属
舟山新木姜子 Neolitsea sericea
樟科新木姜子属
水蜡树
Ligustrum obtusifolium
木犀科女贞属
number of isolation and screening to obtain valuable endophytic fungi，it can provide more sources for novel
natural products.In this study，12 kinds of plants were randomly picked.18 strains of endophytic fungi were isolated
山茶花
Camellia japonica
山茶科山茶属
主要功效及用途 清热降火、消肿解毒、活血化瘀 化湿清热、祛风通络，治痢疾、腰痛 药材、调味料，健胃、活血、散寒
叶片肥厚，主要用于观赏 有催吐功效，主要治疗痢疾 盆栽，果肉多汁可食，制作优质软糖 祛风除湿、行气活血、散瘀止痛 用于痰多咳喘，眩晕，呕吐反胃 园林装饰及盆栽，保护肝功能 平喘，抗心律失常，抗真菌
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
收稿日期： 2015－02－12 作者简介： 鲁群（ 1987－ ） ，女，博士，讲师，研究方向： 天然产物化学与食品功能因子，E－ mail： luqun@ 。 基金项目： 中国国家留学基金委资助。
152
表 1 采集植物信息 Table 1 Information of plants
(整理)植物内生菌分离处理方法
d植物内生菌分离处理方法文献材料前处理第一次消毒第二次消毒（含三消）处理对照培养基刘明志，2011 南方红豆杉的老树皮、幼茎、叶截成2～3 cm长的小段，去除树皮层75%酒精中浸泡30s0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次研磨成匀浆液，倾倒于PDA上切成0．5 cm左右的块，接种于有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。
每皿10块刘金花2011 黄花蒿的根，茎，叶叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口）将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min1%的次氯酸钙溶液浸泡1min,用无菌水冲洗5次置于含双抗的V A培养基平板培养待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离宋培勇2011 珙桐茎、叶和叶柄将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗2 次75%酒精浸泡 1min再用2%NaClO 溶液中浸泡3 min, 转入75%酒精中浸泡30 s,接着用无菌水漂洗3 次,取最后一次漂洗液涂布NA 平板作为对照平放于NA 平板上,28 °C培养2−3 d孙传伯2011 台湾7303毛豆全株采回的样本用自来水洗净, 并用无菌纸吸干水分, 并用无菌纸吸干水分,切取支根110 cm长的小段, 须根切成115 cm的小块用75% 酒精浸泡5m in、7m in、10min分别用0.1% 升汞溶液处理4 m in、6m in、8 m in进行表面灭菌,此试验分别重复3次。
最后用无菌水冲洗4次,。
最后用无菌水冲洗4次将组织块在研钵中充分研磨成匀浆最后一次冲洗液涂3种不同培养基平板, 26~ 28e下培养2~ 3d, 筛选出最佳消毒时间和培养基, 将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗4次,取上清液涂抹于培养基上。
以无菌水冲洗为对照试验。
取上清匀浆涂抹于3种不同培养基上, 取匀浆涂布于不同培养基平板, 每浓度重复3次, 然后将培养皿置于26~ 28e 恒温箱中培养2~ 3d, 观察培养出的菌落形态精品文档张鑫2011 植物圣罗勒的健康叶子将叶子用流水冲洗10 min1% 的次氯酸钠中浸泡10min0．02 mol / L、pH7．0 的无菌磷酸钾缓冲液( PB) 漂洗4 次加无菌水将材料研磨涂布培养李铭, 2011 石耳目地衣为了诱导产孢，黑化菌株在光照/黑暗( 12 h∶12h) 条件下，于2%的PDA培养基上，18℃下培养 3 个月刘杰凤2011 健康的小白菜，染病的小白菜根，茎，叶流水冲洗干净，剪成小段75％酒精中浸泡3min10％次氯酸钠浸泡茎为8 min，根和叶由于气孔较茎大，浸泡5 min即可，然后用无菌水浸泡多次，每次3 min无菌条件下用适量的PBS缓冲液捣碎以最后一次的漂洗液作对照，30 ℃下培养一个星期搅拌后静置3 min，取上清液0．5 mL分别涂布于分离培养基平板上，每种材料做3次平行精品文档朱士茂2011 新采集的银杏枝条，叶子和根在自来水中冲洗干净，然后将枝条和根截成 3 －4cm长，将叶子和叶柄分开，分别将根，枝，叶放在不同的灭菌后的广口瓶中（一），根的表面灭菌: 0. 1%的土温20 消毒1min，无菌蒸馏水冲洗 2次。
分离植物内生真菌操作流程
分离植物内生真菌操作流程1.材料准备：植物样本、剪刀、镊子、70%乙醇、3%次氯酸钠（本实验用4%84）、酒精灯、计时器、平板、锥形瓶，无菌水，离心管（带盖，灭菌）、打开无菌操作台灭菌30min。
（1）植物样本的采集：选取生长状态良好，不要有病斑或者枯枝烂叶，每种植物采取三株标本，要带有叶子、叶柄和枝条及其他部位，将样本名字写在小纸条上放在装标本的袋子里，采下来的标本与写有名字的纸条一同拍照，样本上有脏东西时，请用纸轻轻擦掉，若不清楚植物名字，请将整棵植物拍照留用于鉴定，并做好相关记录。
（2）制作PDA固体培养基，在无菌操作台中倒平板，每瓶250ml的培养基大概倒15个板，待其凝固后用于接种。
2.清洗：认真用清水将标本洗净，洗去标本表面的灰尘，去除枯叶，备用。
3.取样：（1）在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位进行取样，剪取5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取5~10mm，若是比较粗的枝干或圆圆的果实之类的，总之比较大的，则将它切开，再剪取样本，样本不要剪的太大或太小。
（2）每种植物的叶子，叶柄，枝干等其他部位，每种部位接种两块板，大板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中，小板每个接种四个样本即左上、右上、左下，右下，计算好所要剪的样本数，尽量多剪几个，以免后面的表面灭菌中冲洗时被冲掉。
（3）若植物标本有剩余，且是没有洗过的，重新装好，放到冰箱里，备用，洗过的扔掉。
（4）每种植物标本所剪的样本放在一个50ml的离心管中，放在试管架上，并且每个离心管上要标好所对应的植物标本。
4.表面灭菌：在无菌操作台中进行（1）先向各离心管内倒入适量（10~20ml）70%乙醇，拧紧盖子，用计时器开始计时1min,每10秒钟晃动离心管几次，使其充分灭菌。
（2）1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管中样本倒出，倒出的样本不要再放入其中，也不要用手碰到样本，样本不可以接触到除了离心管以外的东西。
植物内生菌的分离
植物内⽣菌的分离植物内⽣菌的分离钱昆121140041⼀、实验⽬的1、掌握对植物内⽣菌的分离处理⽅法。
2、熟练掌握对细菌、真菌的染⾊观察技术。
3、了解微⽣物分⼦实验的基本操作流程。
⼆、实验原理在植物的⽣态环境中，存在着各种各样的微⽣物,它们有的附着于植物的表⾯，有的则⽣活于植物体内。
对于附着于植物表⾯和根际的微⽣物已有很多研究，⽽对于植物体内微⽣物的研究却刚刚起步。
但有资料显⽰, ⼀些植物内⽣微⽣物与宿主发⽣关系时，可明显增强宿主的抗病性，提⾼植物的⽣产⼒。
因此，合理利⽤植物的内⽣微⽣物具有重要的理论意义和实⽤价值。
植物内⽣菌作为微⽣物研究领域之⼀，近年来⼀直备受关注。
内⽣菌概念在1866年⾸先由Bary提出的，指那些在其⽣活史的⼀定阶段或全部阶段⽣活于健康植物的组织或器官内部的微⽣物（主要为真菌和细菌）。
其后的很长时间内，内⽣菌研究进展缓慢。
直到1993 年，美国蒙⼤拿州⽴⼤学Strobel等从短叶红⾖杉的韧⽪部位分离到⼀株产新型抗癌物质紫杉醇的内⽣真菌，从⽽启发⼈们可从植物内⽣菌寻找与植物产⽣的相同或相似的化合物，由此促进了植物内⽣菌的研究。
植物内⽣菌为植物组织内的正常菌群，包括植物内⽣真菌、内⽣细菌和内⽣放线菌，⼴泛分布于各种陆⽣及⽔⽣的低等植物和⾼等植物中。
内⽣真菌是在宿主植物的茎和叶内⽣存并完成⽣活周期的真菌。
这类真菌中，有许多种类很少形成孢⼦，或者在宿⽣植物上形成孢⼦（或者孢⼦果），不容易识别。
真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间。
与病原菌不同，这些真菌对宿主植物⼏乎没有害处，它们和植物之间或者是相互依存的共⽣关系，或者是不太密切的共⽣关系。
对于现已分离得到的植物内⽣细菌，⼀般可分为专性内⽣细菌与兼性内⽣细菌，前者指⾄今只能在植物体内分离得到的细菌；后者指能在植物根际与⼟壤中分离得到，也能在植物体内分离得到的细菌，⽽且种类居多。
根据内⽣细菌对宿主植物⽣长发育的影响可以将其分成三类：第⼀类对植物的作⽤是中性的，即尚未发现它们的内⽣定殖对宿主植物⽣长与繁殖有影响；第⼆类对植物⽣长发育有促进作⽤，如能提⾼宿主植物抗病、抗逆能⼒，或能通过固氮与分泌激素促进植物⽣长发育等；第三类对植物⽣长具有负⾯影响，在特别条件下接种到原宿主植物或另外的宿主植物会诱发植物病害。
植物病原菌分离方法
植物病原菌分离方法（综合版）植物病原细菌分离方法：分离培养基（NA）植物病原细菌的方法一般采用稀释分离法：1.取灭菌研钵加无菌水适量，切去4 mm大小病块组织，经过表面消毒和无菌水冲洗3次后放入研钵中研碎，静置10-15 min，使组织中的细菌进入水中制成悬浮液；2.配制不同稀释度的细菌悬浮液；准备3-5个灭菌培养皿，每个加200 µl无菌水；3.用灭菌移植环从第1个培养皿中移植1-2环细菌悬浮液到第2个培养皿中，充分混匀后再从第2个培养皿移植1-2环到第3个培养皿中，依次类推；4.平板划线分离，28℃培养2-3天；5.挑取单菌落划线再次纯化；菌落形态观察：1.形状和大小、颜色和光泽、表面是否隆起或凹陷、边缘的形状、透明度和粘度、培养基颜色的变化等；2.菌苔表面有光滑的、不平整的和皱褶的、易挑取、质地均匀3.菌苔颜色也不同，质地有粘质的、膜质的或蜡质的。
有透明的、半透明的或不透明的，表面有暗色或发亮的4.菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等特征注：1.若分离成功，平板上菌落形态和大小比较一致，即使出现几种不同形状的菌落，终有一种是主要的；2.如果菌落类型很多，且不分主次，很可能未分离到病原细菌，应考虑重新分离；3.如果不熟悉一种细菌菌落的性状，就应选择几种不同类型的菌落，分别培养后接种测定其致病性，最终确定病原菌；4.一种细菌病害一般由一种病原菌引起的，平板上出现几种不同类型的菌落实质上只有一种是真正的病原细菌；5.腐烂型的细菌病害即使是混合侵染的，但也有一种是主要的。
6.各种植物病原细菌生长快慢不同：假单胞菌属和欧文氏菌属1-2天土壤杆菌属细菌2-3天黄单胞菌属细菌3-4天棒杆菌属的细菌5-8天才出现明显的菌落植物病原细菌生长量测定法直接法测体积粗放的方法，将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察沉降物的体积。
称干重采用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%~20%。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
d植物内生菌分离处理方法刘明志。
南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。
热带亚热带植物学报，2011，19(4):360～364剥取红豆杉的老树皮，截成2～3 cm长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次。
用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成0．5 cm左右长的小块，接种于加有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。
每皿放置10块，依次编号，置于25℃恒温培养箱中培养。
幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成1 cm长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA固体培养基上培养。
红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。
1刘金花。
黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。
２０１１，３３（４）：２７～３０黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的VA培养基平板培养泡1min,用无菌水冲洗5次。
待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离。
2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011, 38(1): 8?13将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗 2 次, 75%酒精浸泡 1 min, 再用 2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入 75%酒精中浸泡 30 s,接着用无菌水漂洗 3 次, 平放于 NA 平板上, 28 °C培养 2?3 d。
取最后一次漂洗液涂布 NA 平板作为对照。
内生菌分离和纯化。
将 NA 平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离 1-2 次直到获得纯培养3孙传伯。
毛豆内生菌的分离及生物学特征观察。
(2011)10- 0026- 02（1）从供试材料上取植物组织 1. 0 g, 用 70% (体积分数 )酒精浸泡 30 s, 用无菌水漂洗后, 置于 1% (体积分数 )次氯酸钠水溶液中表面消毒 3- 5min(其中叶片和花消毒 3 m in, 茎和果消毒 5m in), 再取出植物组织用无菌水冲洗 3次. 样品晾干后分别置于无菌研钵中加 5 mL 无菌水研磨成浆状, 静置 10- 15 m in后, 每一样品各取上层澄清液 50 LL 分别涂布在培养基 ( NA、KB和TSA ) 平板上, 每种培养基涂布 3皿, 28 e 黑暗培养48- 72 h, 计算每一平板的菌落数. 表面消毒后, 在研磨前取 50 LL 无菌水冲洗液涂布平板;或是通过组织印迹试验, 将最后一次清洗的植物组织在培养基平板上印一下, 按上述条件培养 48 h, 观察有无菌落产生, 以验证采用该消毒方法是否能杀死供试材料表生微生物. 根据菌落形态、颜色等挑取单菌落, 划线分离、纯化后保存、备用.在融化并冷却至 45 e 的NA 培养基中加入待测病原菌的悬浮液, 其中每 100 mL 培养基加 1 mL 细菌悬浮液, 倒入平板. 采用点接法将内生菌接种于 NA平板上, 每个平板上等距离点接 5株不同的内生细菌菌株, 每组进行 2次平行试验, 在恒温箱中 28 e 下培养, 2 d后观察有无抑菌圈生成.（2）采用组织切块法, 进行表面消毒,再用灭菌的蒸馏水清洗, 检验灭菌效果。
内生细菌的分离前,将采回的样本用自来水洗净, 并用无菌纸吸干水分,切取支根 110 cm 长的小段, 须根切成 115 cm的小块, 进行组织表面清毒, 棉花根部切段后经无菌水冲洗 3次,用 75% 酒精浸泡 5m in、7m in、10m in后, 然后分别用011% 升汞溶液处理 4 m in、6 m in、8 m in进行表面灭菌,此试验分别重复 3次。
最后用无菌水冲洗 4次, 最后一次冲洗液涂 3种不同培养基平板, 26~ 28e 下培养2~ 3d, 筛选出最佳消毒时间和培养基, 将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗 4次,取上清液涂抹于培养基上。
以无菌水冲洗为对照试验。
培养 2d后观察灭菌效果, 直到彻底表面灭菌, 再进行最后的内生菌分离。
将组织块在研钵中充分研磨成匀浆,取上清匀浆涂抹于 3种不同培养基上, 取匀浆涂布于不同培养基平板, 每浓度重复 3次, 然后将培养皿置于26~ 28e 恒温箱中培养2~ 3d, 观察培养出的菌落形态。
（3）再将材料放进经过紫外线消毒的超净工作台内, 切割成小段, 按常规无菌操作进行表面消费处理: 75% 乙醇浸泡 3 min y无菌水冲洗 3 遍 y011% 升汞浸泡 8 m in y 无菌水冲洗 3 遍。
将上述处理过的材料经滤纸吸干水分后, 在无菌条件下切成015 cm@015 cm 的小块, 放置于新鲜的 PDA 平板培养基上, 每个平板放置 4 块, 28 e 恒温培养 3~ 7 d。
待切口边缘长出真菌菌丝, 及时转接至新鲜 PDA 培养基上培养, 采用菌丝顶端纯化法逐步纯化。
同时, 以消毒后不做切割的材料作为空白对照, 同样条件下观察是否有菌长出, 结果对照材料周围无任何菌长出, 证明表面消费彻底。
212 内生真菌的鉴定: 采用真菌学插片培养方法,对分离获得的见血封喉内生真菌进行显微形态特征( 菌丝、孢子形态等) 的观察、分类鉴定。
分类检索参照文献报道[ 8]。
213 内生真菌的发酵上清液制备: 将分离得到的菌株, 切取黄豆粒大小的菌丝块, 接种于 PDB 培养基中。
1 L 三角瓶装400 mL 培养液, 室温, 164 r/ min振荡培养7 d, 同时以纯培养基作空白对照。
无菌条件下取发酵液 15 mL 于离心管中, 12 000 r/ min 离心 30 min 后取上清液, 用 012Lm 微孔滤膜滤过除菌, - 20 e 保存备用。
214 抑菌活性测定: 采用杯碟法测定样品抑菌活性。
金黄色葡萄球菌和 MRSA 采用 NA 培养基, 白色念珠菌采用 YPD 培养基。
将金黄色葡萄球菌、M RSA 和白色念珠菌分别制成一定浓度的菌悬液( 1@105~ 1@107cfu/ m L) , 用棉签将其均匀涂布在供试无菌培养皿中, 制成含菌平板, 然后在每个平板放入 3 个牛津杯, 分别取样品 200 微升加入其内, 同时以发酵纯培养基作阴性对照。
金黄色葡萄球菌和M RSA 在 37 e 下恒温培养, 白色念珠菌在 28 e 下恒温培养。
24 h 后观察结果, 测量并记录抑菌圈直径。
每个样品做 3 个重复, 以抑菌圈直径的平均值为试验结果4张鑫，生菌的分离方法及其次级代谢产物研究,(2011)02-0023-04内从药用植物圣罗勒的健康叶子上分离出4 种内生细菌 OS －9、OS －10、OS －11和 OS －12。
他们首先将叶子用流水冲洗 10 min，随后于 1% 的次氯酸钠中浸泡 10 min，再用0． 02 mol / L、pH 7． 0 的无菌磷酸钾缓冲液( PB) 漂洗4 次，每次洗后取100 μL 漂洗液转移到装有 5 mL肉汤培养基的离心管中，经过 48 h 震荡培养( 条件是 200 rpm，28 ℃) ，检测样品表面消毒是否彻底。
分离过程为选用紫外线和75%酒精作为表面消毒剂，经过多次消毒，加无菌水将材料研磨后，再将研磨液涂布。
5李铭, 石耳目地衣(2011) 02-0014-07无6刘杰凤, 小白菜内生菌的分离及菌核菌拮抗菌的筛选（2011）13－2676-04健康的小白菜，染病的小白菜。
采回的植株用流水冲洗干净，剪成小段，75％酒精中浸泡3 min，再用10％次氯酸钠浸泡一定时间：茎为8 min，根和叶由于气孔较茎大，浸泡5 min即可，然后用无菌水浸泡多次，每次3 min，表面消毒检测至漂洗液无菌落长出为止，一般为3～4次。
在无菌条件下用适量的PBS缓冲液捣碎，充分搅拌后静置3 min，取上清液0．5 mL分别涂布于分离培养基平板上，每种材料做3次平行，以最后一次的漂洗液作对照，30 ℃下培养一个星期。
挑取不同形态的菌落，平板划线进行3～4次的传代纯化、镜检、斜面低温保存。
选取具有明显菌核菌病症的小白菜，采用常规组织分离方法从长菌丝及菌核处取样，接种于PDA培养基中（添加10％的1 ／ 3 000孟加拉红溶液），30 ℃培养至长出白色菌丝后，取白色菌丝进行多次划线纯化至纯种，斜面低温保存。
7将朱士茂，银杏内生菌的分离与鉴定 2011新采集的银杏枝条，叶子和根放在自来水中冲洗干净，然后将枝条和根截成3 －4cm 长，将叶子和叶柄分开，分别将根，枝，叶放在不同的灭菌后的广口瓶中．之后在超净工作台进行消毒。
根的表面灭菌: 0. 1%的土温 20 消毒 1min，无菌蒸馏水冲洗 2 次，75%的乙醇消毒30s，无菌蒸馏水冲洗 2 次，0. 1% 升汞消毒 5min，无菌蒸馏水冲洗 5 次。
枝的表面灭菌: 75% 的乙醇消毒 30s，无菌蒸馏冲洗 3 次，0. 1% 升汞消毒7min，无菌蒸馏水冲洗 5 次，叶子和叶柄的灭菌: 75% 的乙醇消毒 10s，无菌蒸馏冲洗 3 次，0. 1% 升汞消毒5min，无菌蒸馏水冲洗 5 次，对照实验: ①将以上接入的每种平皿按相同的方法接入 5min 后用无菌镊子取出;②用无菌蒸馏水冲洗已表面灭菌后的材料，然后将此液体移入培养基中，培养观察。
2. 3 内生菌的分离在超净工作台中用无菌镊子挑取根放在无菌培养皿中，将其表皮剥离，用无菌小刀纵切表皮取其中间的部分，然后将其切成0. 5cm ×0. 5cm 大小，插入到培养基中。
茎皮内生菌的获取同上，其次茎的木质部切成半径 1cm 长 2cm 的部分接入培养基中。
叶，叶柄中内生菌的获取一是将叶切成0. 5 ×0. 5 大小接入培养基中，二是用研钵将叶磨碎 ( 内放石英砂和生理盐水) 然后用无菌移液管吸取0. 2ml 放入培养皿中，最后用玻璃涂棒涂布均匀 ( 以上材料均接入五种培养基中，且每种均接三次) 。
对照实验: 将表面消毒过的材料用无菌镊子夹取后在培养基中滚动2min 后弃掉，而且最后一次永无菌蒸馏水冲洗的冲洗液转入到五种培养基中培养( 将上述培养皿放入温箱终于27℃培养) 。
8肖淑贤, 植物内生菌的研究概况及应用进展 2011.01.013分离时可选取长势好、无病害的植株。
分离方法通常是直接切取植物组织或榨取植物组织汁液稀释。