流式细胞内染色方法
流式荧光染色法实验原理及步骤
流式荧光染色法实验原理及步骤原理：荧光染料CFSE，即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。
当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。
这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。
实验步骤，以小鼠脾细胞为例：1.取一只6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，将其全部浸泡于75%酒精中；2.在超净工作台上无菌取出小鼠脾脏；3.用无菌注射器内芯研磨脾脏，尽量不残留较大组织块；再用3mlPBS冲洗后，将脾脏研磨液经200目尼龙网过滤至15mL离心管中，离心350g，5min；4.弃上清后，加入2mL红细胞裂解液，轻微吹打，裂解2min后加入等体积PBS终止裂解反应，混匀后离心350g，5min；5.弃上清，用RPMI1640完全培养基重悬沉淀，并取10μL细胞液计数，将细胞浓度调至2.0×106/ml；6.提前将CFSE按照说明书用DMSO配成5mM母液，并分装储存于-80冰箱，其工作浓度为0.5-25μM；7、取部分细胞作为不染色组阴性对照，其他细胞加入CFSE溶液，使得终浓度为5μM，37°C避光孵育15min；8、加入1ml冰冷的RPMI1640完全培养液，4℃，5min以中止染色；9、弃上清，加入冰冷的含10%FBS的完全1640培养液洗2次，最后用1640完全培养基重悬细胞沉淀，充分吹打成单细胞悬液，将上述细胞悬液加入96孔培养板,每孔105个细胞（阳性对照用PHA刺激）；10、37℃，5%CO2培养3天后用流式细胞仪分析细胞488nm激光器检查细胞增殖情况。
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
单克隆抗体染色方法参考(用于流式)
单克隆抗体染色方法参考（用于流式）一、基本操作流程1. 根据细胞密度，计算出5×105 细胞所要吸取细胞悬液的量，把相应量悬液加到流式管中。
1700 rpm离心5 min，弃去上清。
2. 染色（1）CD8单染：计算出本次CD8单染所需抗体的总量，1:50稀释后，往流式管加入50 μL，4℃避光孵育30 min。
（2）CD4单染：计算出本次CD4单染所需抗体的总量，抗体1:25稀释后，往流式管加入50 μL，4°C避光孵育30 min。
（3）CD8、CD4双染：计算出本次CD4、CD8双染所需抗体的总量，按照CD4:CD8:PBS=2.5:1:50比例稀释液加入到流式管中，4°C避光孵育30 min。
3. 往流式管加入1 mL PBS，1700 rpm离心5 min，去除未结合的抗体，离心后小心吸取上清。
加80~150 μL 流式缓冲液混匀上机检测，流式细胞仪分析染色结果（不超过4 h），当仪器读取到10×104个细胞数就可以分析数据。
如果暂时无法检测，避光储存在4℃。
附：96孔板染色操作步骤：1. 根据细胞密度，计算出5×105 细胞所要吸取细胞悬液的量，把相应量悬液加到96孔板中（U型孔），1700 rpm离心5 min。
2. 抗体稀释按照上述方法，每孔加50 μL抗体稀释液染色，4°C避光孵育30 min。
3. 往孔板中加入200 μL PBS，1700 rpm离心5 min，去除未结合的抗体，离心后小心吸取上清。
每孔加入80 μL流式缓冲液混匀后转移到流式管中。
备注：（1）流式缓冲液：含2% FBS和0.4% 0.5 M EDTA的PBS 溶液；（2）用96孔板板进行染色要注意不同样本要隔开2~3个孔避免交叉污染；（3）染色细胞数量为5×10 5，假设悬液细胞计数为6×106 细胞/1000 μL；（4）我们要取5÷60×1000=83.3 μL悬液才是5×105个细胞数。
流式细胞术实验方法
流式细胞术实验方法PI 染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。
4、离心，弃上清液。
5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。
GFP PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。
以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9）细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。
3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。
用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4、离心弃上清液。
5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。
细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。
离心，弃上清。
4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
流式胞内染色步骤
一、surface marker染色
1、收获细胞，用1%BSA /PBS 1ml洗涤一次（1500rpm，10min），倾倒后滤纸吸干管口液体。
2、加入预先配置好的surface marker抗体混合液（溶于50ul 1%BSA
/PBS），用枪轻轻吹打充分混匀，4度孵育30分钟。
3、1%BSA /PBS 1ml洗涤一次（1500rpm，10min），倾倒后滤纸吸干管口液体。
二、Intracellular Staining的步骤
1、Fix/permeabilizatioin Buffer（ebioscience）固定破膜剂
2、固定：加入IC Fix/Perm Buffer 100ul 后，混匀，室温孵育20分钟
3、用1x Perm Wash Buffer 1ml洗涤1次（2000rpm，10min），倾倒后滤纸吸干管口液体。
4、破膜：加入1x Perm Wash Buffer 1ml，混匀，4度孵育45分钟。
5、离心（2000rpm，10min），倾倒后滤纸吸干管口液体。
6、加入细胞因子抗体（溶于50ul 1x Perm Wash Buffer），4度孵育45分钟。
7、最后再用1xPerm Wash Buffer 1ml洗一次，倾倒后，加入适量300ul PBS 重悬细胞。
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术实验技巧及数据分析一、实验技巧1.细胞样本的准备在进行流式细胞术之前，首先需要准备好细胞样本。
对于悬浮细胞，可以通过离心分离获得单细胞悬浮液；对于贴壁细胞，需要利用胰酶等方法将细胞从培养皿上剥离。
样本的细胞浓度需要适当调整，以保证在实验过程中细胞数目在仪器检测范围内。
2.细胞标记与染色3.样本的处理与染色控制为了减少噪音和误差，需要进行相应的样本处理和染色控制。
常用的处理包括细胞固定、膜破裂和核酸溶解等。
另外，对照组的设置也非常重要，包括负对照、单标对照和血细胞淋巴细胞控制等，以校正仪器和标记的相关性。
4.流式细胞仪的设置与操作流式细胞仪是进行流式细胞术的关键仪器，需要正确设置和操作。
首先，要校准仪器的激发光源、滤光片和检测器等参数，以确保获得准确的荧光信号。
其次，要根据标记物的激发光和发射光波长选择合适的检测通道。
最后，通过检测标记物阳性细胞的信号强度和分布，调整仪器的敏感度和流速，以获得符合实验要求的数据。
二、数据分析1.数据获取与记录在流式细胞术实验结束后，需要用相应的软件（如FlowJo、CellQuest等）获取和记录仪器所产生的原始数据。
这些数据包括细胞整体的荧光信号和散点图等。
2.质量控制与后处理对于数据质量的控制，首先需要排除掉背景信号。
通过设置负对照，根据荧光信号的阈值来确定阳性细胞的比例。
另外，还需要剔除激活的、死亡的和颗粒干扰的细胞等。
3.数据可视化通过制作直方图、散点图和轮廓图等，可以直观地展示细胞的其中一种特定特征（如表达一些蛋白质、细胞周期等）在整个细胞群体中的分布情况。
从图形中可以得出相应的统计结果，并可以进一步比较不同样本之间的差异。
4.数据统计与分析对于一些研究问题，需要计算不同细胞亚群的百分比、中位数、平均值和标准差等。
此外，还可以利用双参数散点图，通过计算相关系数（如Pearson相关系数）来分析两个特征之间的相关性。
总结：流式细胞术作为一种快速、高通量和灵敏的细胞分析技术，对于研究细胞标记物的表达和功能等提供了有力的手段。
流式细胞仪原理及操作步骤
流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。
其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。
活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
（一）原理一活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
（二）操作步骤制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）用10% FCS RPMI1640调整细胞浓度为5X 106〜IX 107/ ml取40卩1细胞悬液加入预先有特异性McAb（5〜50卩I）的小玻璃管或塑料离心管，再加50卩I 1 : 20（用DPBS（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇J 4 C 30mi n用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpmx 5mi nJ]加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100〜500 ^1固定液）FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5〜7天）（三）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液（见附录）。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
I （四）注意事项1. 整个操作在4C下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
用于流式细胞分析的细胞内抗原染色方法总结
用于流式细胞分析的细胞内抗原染色改进的基本免疫荧光染色和流式细胞分析操作步骤可用于在单细胞水平上同时流式细胞分析表面分子和细胞内抗原。
通常，细胞用甲醛固定以稳定细胞膜，然后用破膜剂或酒精透化，使得抗细胞内抗原的抗体可以在细胞内进行染色。
染色细胞内的蛋白质时，重要的是要考虑它们的位置，因为这可能决定了最优的操作步骤和缓冲系统。
例如，核蛋白和许多分泌蛋白与Foxp3 /转录因子染色液组合配合良好，而分泌蛋白如细胞因子和趋化因子搭配细胞内固定和破膜缓冲液组合很好。
最后，有几种磷酸化的信号蛋白可能在前面提到的两种缓冲系统中不起作用，但可与固定/甲醇方案一起使用。
应根据经验确定不同缓冲系统和方案中的抗体性能。
细胞表面蛋白质染色操作步骤：1，取100-200w细胞（流式收20w），1200rpm离心8min，留100μL，将细胞重悬。
2，加入1mL 5% BSA（PBS配），1200rpm离心5min，留100μL，将细胞重悬。
重复两次。
这步是封闭，封闭非特异性的表面蛋白分子，防止与抗体非特异性结合。
3，每种抗体加0.3-0.5μL，4℃避光30min。
4，加1mL PBS 终止，1200rpm离心5min，留100μL，将细胞重悬。
5，如果不能马上过流式，加100μL4%多聚甲醛（PBS配），4℃固定。
细胞内抗原染色方法：一、两步法：细胞内（细胞质）蛋白质。
二、一步法：细胞内（核）蛋白质。
三、固定/甲醇的两步法。
一、两步法：细胞内（细胞质）蛋白质在该操作步骤中，固定步骤之后是破膜，在细胞膜上穿孔，这需要在所有后续步骤中持续存在破膜液。
这使得抗体可以进入细胞的细胞质。
因此，所有细胞内染色必须在存在破膜液的条件下进行。
该操作步骤推荐用于体外或体内活化后个体细胞中的胞浆蛋白、细胞因子或其他分泌蛋白的。