网织红细胞染色液操作步骤及注意事项
常用染色方法.
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中性杆状核粒细胞
中性分叶核粒细胞
嗜酸性粒细胞
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嗜碱性粒细胞
单核细胞
淋巴细胞
网织红细胞染色方法
一、概述： 根据网织红细胞的形态特征和成熟程度将其分为五型： 花冠型、丝球型、网型、破网型、点粒型。网织红细胞经 体外活体染色后，显微镜下凡含有两个以上的深染颗粒或 具有线网状结构的无核红细胞，即为网织红细胞。WHO 推荐使用新亚甲蓝染色液，因其对网织红细胞染色力强且 稳定而被首推。
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革兰染色法
三、注意事项： 1、涂片：菌液涂片时，用接种环蘸取菌液直接在玻片 上涂布；若是菌落，先取生理盐水1滴，置于玻片上，用 接种针挑取菌落，在盐水中涂布。 2、干燥：制备的涂片应自然干燥。 3、固定：多采用加热固定，目的在于保持细胞原有的 形态和结构，杀死细菌，使染料易于着色，并是细菌附着 于玻片上不易脱落。自然冷却后在染色。 4、革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度， 革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如 脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性 菌。因此必须严格把握脱色时间。
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Miller窥盘法
由于目测计数误差较大,用Miller 窥盘法可减低标准误,特别是 RBC较少时. 盘:厚1mm,直径19mm,圆玻片上 划出格子:大方格内Ret/(小方格 内RBCx9)X100%
网织红细胞
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革兰染色法
一、基本原理： 革兰染色是细菌最基本的染色法，可用于标本涂片或 菌落涂片。细菌的等电点较低，约在PH2-5，一般情况下 细菌带负电荷，易于被带正电荷的碱性染料（结晶紫，碱 性复红）着色。染色结果将细菌分为革兰阳性（紫色）和 革兰阴性（红色）两类。
常用的染色方法
网织红细胞报告
网织红细胞报告引言网织红细胞（reticulocyte）是指还保留有核的红细胞前体细胞，其通过骨髓释放入循环中，并最终成熟为无核的红细胞。
网织红细胞反映了人体红细胞的再生能力和骨髓功能的活跃程度。
本文将介绍网织红细胞的意义、影响因素以及相关的检测方法。
网织红细胞的意义网织红细胞作为红细胞再生的指标，可以用来评估人体骨髓功能和红细胞的更新速度。
正常情况下，网织红细胞的百分比是很低的，但在某些疾病状态下，这个比例会显著增加。
因此，通过检测网织红细胞的比例，可以评估红细胞再生的活跃程度，进而判断疾病的类型和程度。
影响网织红细胞比例的因素1. 缺铁性贫血缺铁性贫血是指机体缺乏足够的铁元素，导致红细胞无法正常合成血红蛋白的一种贫血类型。
在这种情况下，骨髓会释放更多的网织红细胞来进行红细胞的再生，以弥补缺铁造成的红细胞数量减少的情况。
因此，在缺铁性贫血患者中，网织红细胞比例往往会显著增加。
2. 贫血贫血是指血液中红细胞数量减少或者红细胞功能异常，无法满足组织需氧的状态。
在贫血患者中，由于红细胞的量减少，骨髓会增加网织红细胞的合成和释放，以弥补红细胞的减少。
因此，贫血患者的网织红细胞比例也会显著增加。
3. 血液失血大量的血液失血会导致红细胞数量急剧减少，进而刺激骨髓释放更多的网织红细胞来进行红细胞再生。
因此，在血液失血的情况下，网织红细胞比例也会升高。
4. 骨髓异常骨髓异常可以导致红细胞生成障碍，进而影响网织红细胞的生成和释放。
例如，骨髓增生异常综合症（MDS）等疾病可以导致网织红细胞比例明显增加。
网织红细胞的检测方法网织红细胞的检测可以通过流式细胞仪或者显微镜等方法进行。
以下是常用的流式细胞仪的检测步骤：1.准备血液样本：采集适量的静脉血，将血液样本放入抗凝剂处理。
2.处理血液样本：将血液样本进行稀释处理，使白细胞和红细胞分散均匀。
3.流式细胞仪检测：将样本放入流式细胞仪中进行检测。
流式细胞仪通过使用荧光染料或抗体标记网织红细胞，以便于识别和计数。
网织红细胞计数实训报告
一、实训背景网织红细胞是红细胞前体，其计数对于评估骨髓造血功能和红细胞生成情况具有重要意义。
本实训旨在通过学习网织红细胞计数的操作方法，掌握其计数原理和注意事项，提高对血液学检验的认识和技能。
二、实训目的1. 了解网织红细胞计数的基本原理和操作方法。
2. 掌握显微镜下观察和计数网织红细胞的技术。
3. 学会分析网织红细胞计数结果，并应用于临床实践。
三、实训内容1. 网织红细胞计数原理网织红细胞计数是通过染色技术将网织红细胞与成熟红细胞区分开来，然后进行计数。
常用的染色剂有煌焦油蓝、新亚甲蓝等。
染色后，网织红细胞呈现蓝绿色网状或点粒状物质，而成熟红细胞则呈红色。
2. 网织红细胞计数操作方法（1）制备血涂片：取新鲜血液2滴，加入10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液2滴，立即混匀，置37℃下15～20分钟。
（2）制片：取1小滴制成薄血涂片，自然干燥。
（3）染色：将染好的血涂片放入染色缸中，用染液染色5～10分钟。
（4）观察：在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。
（5）计数：在油镜下计数至少1000个红细胞中的网织红细胞数。
（6）计算：网织红细胞分数 = 计数的网织红细胞数 / 1000网织红细胞绝对值 = 红细胞数× 10^12 / L × 网织红细胞分数3. 注意事项（1）染色时间要适中，过长或过短都会影响计数结果。
（2）观察时要选择红细胞分布均匀的部位，避免计数误差。
（3）计数时要仔细区分网织红细胞与HbH包涵体。
（4）计算时要确保数值准确。
四、实训结果与分析本次实训，我们按照操作步骤进行了网织红细胞计数，并计算出网织红细胞分数和绝对值。
通过对计数结果的分析，我们了解到患者的骨髓造血功能和红细胞生成情况。
五、实训总结通过本次实训，我们掌握了网织红细胞计数的操作方法，了解了其计数原理和注意事项。
同时，我们也认识到，在实际操作中，要严格按照操作步骤进行，确保计数结果的准确性。
此外，我们还学习了如何分析计数结果，并将其应用于临床实践。
临检--网织红细胞计数(Ret)
网织红细胞计数（Ret）【定义】网织红细胞是晚幼红细胞脱核后到完全成熟红细胞间的过渡细胞，属于尚未完全成熟的红细胞，其胞质中残存嗜碱性物质核糖核酸（RNA），经活体染色后，嗜碱性物质凝聚成蓝黑色颗粒，颗粒与颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。
【分型】根据网织红细胞发育阶段分为4型，分别是：Ⅰ型（丝球型）：红细胞充满网状物，见于骨髓。
Ⅱ型（网型）：红细胞网状物结构松散，见于骨髓。
Ⅲ型（破网型）：红细胞网状物结构稀少，呈不规则枝点状排列，见于外周血。
Ⅳ型（点粒型）：红细胞内为分散的细颗粒、短丝状网状物，见于外周血。
【检测原理】1.普通光学显微镜法2.网织细胞计数仪法和血液分析仪法【操作方法】1.显微镜试管法操作（1）加染液：于试管中加入10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液2滴，再加新鲜血2滴，立即混匀，置37℃下15～20min。
（2）制片：取1小滴制成薄血涂片，自然干燥。
（3）观察：在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。
（4）计数：在油镜下计数至少1000个红细胞中网织红细胞数。
（5）计算：网织红细胞分数=（计数的网织红细胞数）/1O00，网织红细胞绝对值（×109/L）=红细胞数×1012/L×网织红细胞分数。
2.显微镜法注意事项（1）网织红细胞必须活体染色，WH0推荐使用新亚甲蓝染液，其染色力强且稳定。
煌焦油蓝染液操作简单、费用低廉，但易产生沉淀、工作效率不高、精度差。
染液与血液比例以1:1为宜，严重贫血时，可适量增加血量。
（2）为提高网织红细胞计数精度和速度，ICSH推荐使用Miller窥盘，方法是将Miller 窥盘置于目镜内，选择红细胞散在且分布均匀的部位（3）用小方格（A）计数红细胞，大方格（B）计数网织红细胞，按下式计算：（4）注意鉴别网织红细胞与HbH包涵体。
Ret为蓝绿色网状或点粒状物质，分布不均，HbH包涵体为蓝绿色圆形小体，均匀散布于整个红细胞内。
(三)网织红细胞计数
三、操作步骤
1.于小试管中加入染液2滴。 2.在已加入染液的小试管中加入新鲜全血2滴，立即混匀，室温下 静置15-20min。
3.制片：去混匀染色血液1滴制成薄血涂片，自然干燥。
4.观察：低倍镜下观察红细胞分布和染色情况，选择红细胞分布 均匀、着色好的部位。
5.计数：在油镜下，在Miller窥盘下计数。
临床应用： • ＞3提示溶血性贫血或急性失血性贫血； • ＜2提示为骨髓增生低下或红细胞系成熟障碍性贫 血。
（2）评价疗效
网织红细胞反应：IDA或巨幼细胞贫血分别给予铁剂、维
生素B12或叶酸治疗2~3d后，网织红细胞计数值开始上升，
7~10d达到最高(10%左右)；两周以后逐渐降至正常水平， 红细胞、血红蛋白开始升高。 骨髓移植、EPO治疗后：若骨髓开始恢复造血功能，网 织红细胞计数值上升。
思考题
一溶血性贫血患者，红细胞计数2.6x1012/L，血细胞比 容0.29，网织红细胞计数相对值为35%，如何报告网织 红细胞检测结果？
（2）显微成像系统：
图2-21 Miller窥盘结构示意图
试剂器材
1、试剂 新亚甲蓝溶液 2、器材 静脉采血用具、EP管、载玻片、推片、 显微镜、香柏油、二甲苯及擦镜纸、Miller窥盘 或直径约20 mm（较目镜内径稍小）的圆形硬 纸片（正中央开一边长为3mm的菱形或正方形 小孔，置目镜光阑处，用于缩视野法计数）
【方法】
1．普通显微镜法 活体染料的碱性着色基团可与
网织红细胞RNA的磷酸基结合，使RNA胶体间的负电
荷减少而发生凝缩，形成蓝色的点状、线状或网状结
构。 2．血液分析仪法 特殊染料与网织红细胞中RNA 结合后进行RNA定量，可精确计数网织红细胞占成熟 红细胞的百分数（Ret%），并可根据RNA含量将网
(三)网织红细胞计数
（2）评价疗效
网织红细胞反应： 网织红细胞反应：IDA或巨幼细胞贫血分别 或巨幼细胞贫血分别 给予铁剂、维生素B 或叶酸治疗2~3d后，网织 给予铁剂、维生素 12或叶酸治疗 后 红细胞计数值开始上升， 达到最高(10% 红细胞计数值开始上升，7~10d达到最高 达到最高 左右)；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、 左右 ；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、 血红蛋白开始升高。 血红蛋白开始升高。 骨髓移植、 治疗后： 骨髓移植、EPO治疗后：若骨髓开始恢复造 治疗后 血功能， 升高， 血功能，RMI升高，网织红细胞计数值上升。 升高 网织红细胞计数值上升。
六、参考值
成人： 成人：0.005-0.015（0.5%-1.5%） （ ） 新生儿： 新生儿：0.02-0.06（2%-6%） （ ） 儿童： 儿童：0.005-0.075（0.5%-7.5%） （ ） 成人绝对值（ 成人绝对值（24-84） ×109/L ）
七、临床意义
（1）评价骨髓增生能力，判断贫血类型 ）评价骨髓增生能力， 再障时 明显降低。绝对值低于 × 再障时，明显降低。绝对值低于5×109/L可 可 做为急性再障的辅助诊断指标。 做为急性再障的辅助诊断指标。 失血、多数溶血性贫血患者网织红细胞可明 失血、多数溶血性贫血患者网织红细胞可明 溶血性贫血 显高于正常。 显高于正常。 营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持 营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持 正常、轻度升高或降低。 正常、轻度升高或降低。
（3）放、化疗监测 机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制， 机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制， 早期HFR和MFR降低，然后才检测到网织 降低， 早期 和 降低 红细胞的降低。而停止放、化疗， 红细胞的降低。而停止放、化疗，骨髓功 能恢复后，又见上述指标依次上升。 能恢复后，又见上述指标依次上升。可指 导临床医师适时调整治疗方案， 导临床医师适时调整治疗方案，避免造成 严重的骨髓抑制。 严重的骨髓抑制。
网织红细胞计数
号的部位，按一定顺序计数。由于网织红细胞体
积较大，应兼顾血涂片的边缘和尾部。凡含有2个
问答题
1.网织红细胞的分类和特点。 2.网织红细胞计数可用哪些染液？ 3.影响网织红细胞计数的因素有哪些? 4.网织红细胞计数增高的临床意义。 5.Ret测定注意事项。 6.如何根据血液标本的血红蛋白浓度推 一张好的血玻片?
网织红细胞比值=
1000
网织红细胞绝对值（个/L）=网织红细胞比值×红细胞数/L
[注意事项]
• 血液与染液的比例以1：1为宜，贫血时适当增加
血量。
• 染色时间不能过短，室温低时，可适当延长染色
时间或放置37℃恒温水浴箱染色，否则会因为染
色浅造成结果偏低。
• 选择红细胞分布均匀、不重叠、网织红细胞着色
的一角轻轻将血液与染料混匀。用另张载玻片盖于其上，使
两玻片黏合，以防染色过程中水分蒸发而使血液和染料干燥。 （3）染色和制片室温放置5-10min后，移开上层载玻片,取1 小滴制成薄血涂片(或两载玻片贴合轻轻对拉，制备成两张 涂片)。 （4）观察、计数和计算。
网织红细胞
四、结果计算
计数1000个全部红细胞中的网织红细胞数
（2）加血标本 于上述试管内加人新鲜全血2滴，立 即混匀。
（3）染色和制片 水浴15-20min,取混匀染色血1小 滴制成薄血涂片，自然干燥。 （4）观察网织红细胞 低倍视野下观察红细胞的分 布和染色情况，并选择红细胞分布均匀、平铺、着 色好的部位。
2.玻片法
（1）滴加染液取载玻片1张,在其 一端滴染液1滴,待自然干 燥后备用。 （2）加血液标本加人新鲜全血1滴于千燥的染料上，用推片
实验四
网织红细胞计数
一、实验目的及原理
2018年(三)网织红细胞计数-2019年医学文档资料
目前，FCM检测网织红细胞主要用于 1）预测骨髓移植的效果； 2）解释各种红系增长低下性贫血的 发病原因; 3）评价某些新的重组生物制剂的治 疗效果。
三、操作步骤
1. 染色：于载玻片的一端加煌焦油蓝 酒精溶液1滴，任其自然凉干后备用， 取末梢血或抗凝血一滴，于已干燥的 染料上，用推片角混匀后，将两玻片 盖合（玻片法）；试管法取染液2滴入 试管，加血2滴混匀，封闭好，待15 分钟以上时间， 2. 推片：取混合液1小滴于载玻片的 一端，推制成薄而均匀的血膜，
（3）放、化疗监测 机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制，早期HFR和 MFR降低，然后才检测到网织红细胞的降低。而停止放、 化疗，骨髓功能恢复后，又见上述指标依次上升。可指导 临床医师适时调整治疗方案，避免造成严重的骨髓抑制。
网织红生成指数（Reticulocyte production index,RPI）
RPI=病人网织红细胞（%）/2 * 病人HCT/正常人HCT（男 0.45，女0.40） 临床应用： ＞3提示溶血性贫血或急性失血性贫血；
八、思考题
一溶血性贫血患者，红细胞计数 2.6x1012/L，血细胞比容0.29，网织红 细胞计数相对值为35%，如何报告网织 红细胞检测结果？
外周血网织红细胞计数（百分数和绝对 值）是一反映骨髓红系增生活性的常用 指标。许多学者先后提出应用FCM和不 同的RNA特异性荧光染料自动计数网织 红细胞的方法，如派若宁Y、AO、溴化 乙啶、thiazole orange等。 目前最普遍应用的是 thiazoie orange 染色法，这种特异性RNA 的激 发波（488nm）测量的特点，与人工计
Miller窥盘
将Miller窥盘放在显微镜目镜 中,通过窥盘中大小方格间的9 比1比例关系计算RBC数和Ret 数。
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网织红细胞染色液操作步骤及注意事项
货号：G1400
规格：50mL/100mL
保存：室温，避光保存。
有效期12个月。
产品简介：
网织红细胞是晚幼红细胞到完全成熟的红细胞之间的过度型细胞，由于其细胞浆中尚存在嗜碱性的RNA物质，用网织红细胞染色液进行活体染色后，胞浆中镜检可见有浅蓝色或深蓝色的网状结构。
网织红细胞染色液有新亚甲蓝或煌焦油蓝等组成，呈中性，用于网织红细胞活体染色，利用本染色液所染出的结果，背景颜色明亮清晰，而且不受长时间染色的影响。
该染色液仅用于科研领域，不用于临床诊断或其他用途。
自备材料：
1.新鲜全血或EDTA抗凝血全血
2.细胞计数板
3.显微镜
操作步骤（仅供参考）：
1.将Reticulocyte Stain与病人全血以1:1比例混合，室温静置10-15min或更久。
2.按常规做成血液涂片。
3.显微镜下观察或油镜下计数至少1000个红细胞中网织红细胞数。
染色结果：染色后网织红细胞胞浆中含有浅蓝色或深蓝色的网状结构。
计算：
网织红细胞百分数=计数1000个红细胞中的网织红细胞数/1000
网织红细胞绝对数（个/L）=网织红细胞百分数×红细胞数/L
注意事项：
1.该染色法仅限试管法操作。
2.染色时间要充足，混合后不易立即涂片，当室温较低时，染色时间应相应延长。
3.血涂片应厚薄均匀，不使红细胞重叠，以免影响染色效果。
4.血细胞涂片染色要求新鲜全血或EDTA抗凝血。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。