(三)网织红细胞计数
网织红细胞计数简介
「参考值」成年人0.005～0.015 绝对值（25～75）×109/L平均60×109/L 儿童0.02～0.06 「临床意义」网织红细胞是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间尚未完全成熟的红细胞，经煌焦油蓝染液进行活体染色后胞浆中可见有蓝绿色的网状结构，故名网织红细胞，Heilmyer氏根据其发育阶段把它分为五型：O型：是有核的网织红细胞，胞浆内含有网织物者此型仅见于正常骨髓中。
I型：红细胞几乎被网织物充满，此型亦仅见于正常骨髓中。
II型：位于红细胞中央线团样结构，开始松散、此型大量存在于骨髓中。
Ⅲ型：网织结构稀小，呈不规律枝点状排列，末梢血中可见少量。
IV型：胞浆中嗜碱物质很少呈单独的细颗粒粒可短丝状，正常血液中的网织细胞大多见于此型。
为了充分利用从网织红细胞发育过程中获得的有关红细胞生成活性的全部信息，除计数网织红细胞外，确定网织红细胞的成熟分型是十分必要的，从外周血中正常情况下能检测到Ⅲ型网织红细胞约0.2～0.3，IV型约0.7～0.8，但在激活的红细胞生成中还能检测到I型和II型网织红细胞并且Ⅲ型网织红细胞明显增多，这将对红细胞生成研究提供良好信息，对临床诊断提供有力帮助。
网织红细胞增多：表示骨髓红细胞生成旺盛，常见于溶血性贫血，特别是急性溶血（高达0.6～0.8）。
急性失血后5～10天网织红细胞达高峰，2周后恢复正常。
网织红细胞减少：见于再生障碍性贫血，溶血性贫血再生危象时，典型再生障碍性贫血，网织红细胞计数常低于0.005。
网织红细胞绝对值低于15×109/L为再生障碍性贫血的诊断标准之一。
网织红细胞计数
网织红细胞计数网织红细胞是未完全成熟的红细胞。
红细胞由骨髓进入外周血，需24-48h合成最后20％的血红蛋白，残余的嗜碱性物质才能完全消失，成为成熟的红细胞。
将其分为五型：花冠型、丝球型、网型、破网型、点粒型。
●仪器型号：Sysmex XE-2100型多项目自动血球分析装置●检测原理：一份血液样品经过吸液和定量、稀释至指定的稀释比，并进行染色。
然后将该样品送入流动的池中。
一个半导体激光束通过流动池照射到细胞上。
前向散射光由光二极管接收，侧面的散射光和侧面的荧光则由光点信增管（PMT）接收。
光信号被转化为电脉冲，从而可以得到有关血液细胞的信息。
⑴前向散射光和侧向散射光：当光通路中存在诸如粒子之类的障碍物时，该光束就在每个障碍物的不同方向上产生出散射光。
通过检测散射光，可以得到有关细胞体积大小和材质的信息。
与此同时，当一束激光照射到血细胞颗粒上时，就产生光散射。
散射光的强度，取决于颗粒直径和观察角度这样的因素。
对前向散射光进行检测，提供有关血液细胞体积大小的信息；同时对侧向散射光进行检测，提供有关细胞内部的信息。
⑵侧向荧光：当光照射到经过荧光染色的血液细胞上时，就产生比入射光波长更长的光。
随着染色集团浓度的增加，荧光强度也增加。
通过测●试剂：⑴CELLPACK（EPK）⑵RET SEARCHⅡ（RED）●标本吸入量：⑴手工模式130lμ⑵自动进样器模式200lμ●静脉血采血方法：抽取病人静脉血2ml，于EDTA二钾抗凝的真空采血管中（1.5mgEDTA-K2／ML）24小时室温保存。
●操作步骤：⑴当机器经过电源接通和一系列自检无误后，在机器左上放状态栏显示“READY”及确认“READY LED”（准备状态灯）呈绿色时，机器进入准备测量状态。
⑵要在允许空白值内：WBC RBC HGB PLT0.3⨯109/L 0.02⨯1012/L 1g/L 10⨯109/L⑶检测质控数值合格。
⑷标本的测量：手工模式：在准备测量状态下，按下屏幕最上一行数字键输入标本的编号，按吸液管放进待测标本试管中并按下开始键。
临检--网织红细胞计数(Ret)
网织红细胞计数（Ret）【定义】网织红细胞是晚幼红细胞脱核后到完全成熟红细胞间的过渡细胞，属于尚未完全成熟的红细胞，其胞质中残存嗜碱性物质核糖核酸（RNA），经活体染色后，嗜碱性物质凝聚成蓝黑色颗粒，颗粒与颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。
【分型】根据网织红细胞发育阶段分为4型，分别是：Ⅰ型（丝球型）：红细胞充满网状物，见于骨髓。
Ⅱ型（网型）：红细胞网状物结构松散，见于骨髓。
Ⅲ型（破网型）：红细胞网状物结构稀少，呈不规则枝点状排列，见于外周血。
Ⅳ型（点粒型）：红细胞内为分散的细颗粒、短丝状网状物，见于外周血。
【检测原理】1.普通光学显微镜法2.网织细胞计数仪法和血液分析仪法【操作方法】1.显微镜试管法操作（1）加染液：于试管中加入10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液2滴，再加新鲜血2滴，立即混匀，置37℃下15～20min。
（2）制片：取1小滴制成薄血涂片，自然干燥。
（3）观察：在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。
（4）计数：在油镜下计数至少1000个红细胞中网织红细胞数。
（5）计算：网织红细胞分数=（计数的网织红细胞数）/1O00，网织红细胞绝对值（×109/L）=红细胞数×1012/L×网织红细胞分数。
2.显微镜法注意事项（1）网织红细胞必须活体染色，WH0推荐使用新亚甲蓝染液，其染色力强且稳定。
煌焦油蓝染液操作简单、费用低廉，但易产生沉淀、工作效率不高、精度差。
染液与血液比例以1:1为宜，严重贫血时，可适量增加血量。
（2）为提高网织红细胞计数精度和速度，ICSH推荐使用Miller窥盘，方法是将Miller 窥盘置于目镜内，选择红细胞散在且分布均匀的部位（3）用小方格（A）计数红细胞，大方格（B）计数网织红细胞，按下式计算：（4）注意鉴别网织红细胞与HbH包涵体。
Ret为蓝绿色网状或点粒状物质，分布不均，HbH包涵体为蓝绿色圆形小体，均匀散布于整个红细胞内。
(三)网织红细胞计数
三、操作步骤
1.于小试管中加入染液2滴。 2.在已加入染液的小试管中加入新鲜全血2滴，立即混匀，室温下 静置15-20min。
3.制片：去混匀染色血液1滴制成薄血涂片，自然干燥。
4.观察：低倍镜下观察红细胞分布和染色情况，选择红细胞分布 均匀、着色好的部位。
5.计数：在油镜下，在Miller窥盘下计数。
临床应用： • ＞3提示溶血性贫血或急性失血性贫血； • ＜2提示为骨髓增生低下或红细胞系成熟障碍性贫 血。
（2）评价疗效
网织红细胞反应：IDA或巨幼细胞贫血分别给予铁剂、维
生素B12或叶酸治疗2~3d后，网织红细胞计数值开始上升，
7~10d达到最高(10%左右)；两周以后逐渐降至正常水平， 红细胞、血红蛋白开始升高。 骨髓移植、EPO治疗后：若骨髓开始恢复造血功能，网 织红细胞计数值上升。
思考题
一溶血性贫血患者，红细胞计数2.6x1012/L，血细胞比 容0.29，网织红细胞计数相对值为35%，如何报告网织 红细胞检测结果？
（2）显微成像系统：
图2-21 Miller窥盘结构示意图
试剂器材
1、试剂 新亚甲蓝溶液 2、器材 静脉采血用具、EP管、载玻片、推片、 显微镜、香柏油、二甲苯及擦镜纸、Miller窥盘 或直径约20 mm（较目镜内径稍小）的圆形硬 纸片（正中央开一边长为3mm的菱形或正方形 小孔，置目镜光阑处，用于缩视野法计数）
【方法】
1．普通显微镜法 活体染料的碱性着色基团可与
网织红细胞RNA的磷酸基结合，使RNA胶体间的负电
荷减少而发生凝缩，形成蓝色的点状、线状或网状结
构。 2．血液分析仪法 特殊染料与网织红细胞中RNA 结合后进行RNA定量，可精确计数网织红细胞占成熟 红细胞的百分数（Ret%），并可根据RNA含量将网
网织红细胞计数
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3．作为病情观察的指标
溶血性贫血及失血性贫血，治疗过程中 连续观察网织红细胞计数，可作为判断 病情变化的参考指标。 如治疗后网织红细胞逐渐降低，表示溶 血或出血已得到控制。 如网织红细胞持续不减低，甚至更增高， 表示病情未得以控制，甚至加重。
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四、红细胞沉降率测定
红细胞沉降率（ESR），简称血沉率 指红细胞在一定条件下沉降的速率。 正常情况下，红细胞在血浆中具有相对 的悬浮稳定性，沉降极其缓慢。 在病理情况下，血沉率可明显增快。
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临床意义
2．血细胞比容减低 见于各种贫血。 不同类型的贫血，红细胞体积大小不同， 故血细胞比容的减少与红细胞数量减少 并不—定成正比。 因此必须将红细胞数、血红蛋白量和血 细胞比容三者结合起来，计算红细胞各 项平均值才有参考意义。
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(二)红细胞平均值的计算
1．平均红细胞容积(MCV) 指每个红细胞的平均体积，以飞升（ fl ）为单 位。
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参考值
魏氏(Westergoen)法： 成年男性0~15mm/1小时末
成年女性0~20mm/1小时末
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临床意义
(一)生理性变化 12岁以下的儿童血沉略快。 妇女月经期血沉略增快，可能与子宫内膜破损 及出血有关。 妊娠3个月以后至分娩后3周血沉快，与生理性 贫血及纤维蛋白原含量增加等有关。 老年人血浆纤维蛋白原含量增加血沉加快。 高原地区居民红细胞增多，血沉低于平原地区。
网织红细胞计数操作规程
网织红细胞计数操作规程目的：本实验旨在规范网织红细胞计数的标准操作，以确保实验数据的准确性。
原理：网织红细胞是未完全成熟的红细胞，其包体较一般红细胞稍大，胞浆中尚有嗜碱性残留物质，可被煌焦油蓝等染成蓝色颗粒状、线状及网状结构物。
网织红细胞的数量可用百分率或每立方毫米血液中的绝对值数来表示。
材料：煌焦油蓝（灿烂甲酚蓝）、枸橼酸钠、生理盐水、香柏油、载物片（玻璃片）、推片（磨去边的玻璃片）、试管（2ml）、毛细吸管或枪头（200微升）、光学显微镜。
操作规程：染色液配制：将煌焦油蓝0.4g和3.5%枸橼酸钠20ml研磨溶解后加入生理盐水至100ml，过滤备用。
室温下可保存6个月。
血膜片制备：1.染色：取试管一支，用毛细管或枪头于其中加入染液2～5滴，然后再加入新鲜血液1滴轻摇混合，染色10～15min。
2.制片：取载物片一片，用毛细管或枪头吸取血液染色液1小滴于载物片上，并用推片约45度角推制成舌型血膜片，自然干燥备用。
3.观察：用显微镜观察，取血膜片滴入香柏油1滴，将血膜片置于显微镜载物台，用油镜观察网织红细胞。
4.计数：取计数器在油镜下检查计数红细胞，即计数红细胞中网织红细胞的数量，检查计数1000个红细胞中网织红细胞的数量，并得出千分率再除以10即为百分率。
计算公式：百分率=1000个红细胞中网织红细胞的数量/1000注意事项：1.载物片使用前必须经过酸或碱液浸泡脱脂处理后方可使用。
2.血膜片制备需要反复练推片，熟练推制血膜片的技巧。
3.血膜片的厚薄要适中，过厚或过薄均无法进行观察。
4.室温过低时，血液染色时间要适当延长，以确保细胞着色更充分。
5.血膜片需在3天内检查计数，否则其网状结构会褪色，不易观察清晰。
网织红计数
网织红计数
操作：
1、取小试管1支加10g/L新亚甲蓝盐水溶液20ul
2、加入末梢血（或EDTA钾抗凝静脉血）2ul于上述试管中，混匀。
3、室温下放臵10-15min后，取1滴制成薄片。
4、油镜下至少计数1000个红细胞中网织红细胞数。
计算：
网织红细胞百分数=计数1000个红细胞中的网织红细胞数/1000
网织红细胞绝对数（个/L）=网织红细胞百分比数*红细胞数/L
【参考区间】
网织红细胞百分数
成人： 0.005-0.025
新生儿： 0.03-0.06
儿童： 0.005-0.025
网织红细胞绝对数：成人：（24-84）*10*9/L
【分型】
Ⅰ型：致密丝：团状红细胞充满网状物，见于骨髓。
Ⅱ型：松散：红细胞网状物结构松散，见于骨髓。
Ⅲ型：枝点状：红细胞网状结构稀少，呈不规则枝点状排列，见于外周血。
Ⅳ型：细颗粒状：红细胞内为分散的，细颗粒，短丝状网状物，见于外周血。
网织红细胞计数
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手工法
魏氏法、温氏法、ζ血沉率及潘氏法, 检测原理相似。 差别在于抗凝剂、用血量、血沉管规 格、观察时间的不同，故各种方法的参 考值不同。 ICSH推荐魏氏法为血沉测定参考方法
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魏氏法
将枸橼酸钠抗凝血吸入
10mm
特制血沉管内，垂直立 ESR：10mm/h 于室温中，1h末读取红
细胞层下沉的距离，用
Ⅳ点粒型
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对网织红细胞的描述
是晚幼红细胞脱核后的未完全成熟的红细胞 体积比成熟红细胞体积稍大 胞浆内残存有正常核糖核酸(RNA) 具有合成血红蛋白的能力 核糖核酸越多，网织红细胞越幼稚 外周血中主要是Ⅳ型网织红细胞 网织红细胞经瑞氏染色为嗜多色性红细胞 存在于骨髓与外周血中
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网织红细胞计数（Ret）
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毫米（mm）数值报告。
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魏氏血沉测定
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自动血沉仪法
抗凝血液静置后，红细胞下降，红细胞 与血浆分离，其界面随时间而下移。血 沉仪用光电比浊法、红外线扫描法或摄 影法定时扫描红细胞与血浆界面位置， 得到血沉值并显示红细胞沉降高度H与 对应时间t相关的H-t曲线。
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方法学评价
方法 优点
缺点
魏氏法 国内规范方法， 测定血沉某时刻最
贫血→RBC总面积减少，ESR↑ RBC增多，ESR ↓ RBC直径愈大，ESR ↑ 球形RBC增多，ESR↓
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其他因素
血沉管位置 血沉管倾斜，血沉增快
温度 温度＞25℃，血沉增快，结 果应校正
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质量保证（魏氏法）
抗凝剂用量准确：枸橼酸钠（109mmol/L） 与血液之比（1：4）。
网织红细胞数 100%
1000
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（2）评价疗效
网织红细胞反应： 网织红细胞反应：IDA或巨幼细胞贫血分别 或巨幼细胞贫血分别 给予铁剂、维生素B 或叶酸治疗2~3d后，网织 给予铁剂、维生素 12或叶酸治疗 后 红细胞计数值开始上升， 达到最高(10% 红细胞计数值开始上升，7~10d达到最高 达到最高 左右)；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、 左右 ；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、 血红蛋白开始升高。 血红蛋白开始升高。 骨髓移植、 治疗后： 骨髓移植、EPO治疗后：若骨髓开始恢复造 治疗后 血功能， 升高， 血功能，RMI升高，网织红细胞计数值上升。 升高 网织红细胞计数值上升。
六、参考值
成人： 成人：0.005-0.015（0.5%-1.5%） （ ） 新生儿： 新生儿：0.02-0.06（2%-6%） （ ） 儿童： 儿童：0.005-0.075（0.5%-7.5%） （ ） 成人绝对值（ 成人绝对值（24-84） ×109/L ）
七、临床意义
（1）评价骨髓增生能力，判断贫血类型 ）评价骨髓增生能力， 再障时 明显降低。绝对值低于 × 再障时，明显降低。绝对值低于5×109/L可 可 做为急性再障的辅助诊断指标。 做为急性再障的辅助诊断指标。 失血、多数溶血性贫血患者网织红细胞可明 失血、多数溶血性贫血患者网织红细胞可明 溶血性贫血 显高于正常。 显高于正常。 营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持 营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持 正常、轻度升高或降低。 正常、轻度升高或降低。
（3）放、化疗监测 机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制， 机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制， 早期HFR和MFR降低，然后才检测到网织 降低， 早期 和 降低 红细胞的降低。而停止放、化疗， 红细胞的降低。而停止放、化疗，骨髓功 能恢复后，又见上述指标依次上升。 能恢复后，又见上述指标依次上升。可指 导临床医师适时调整治疗方案， 导临床医师适时调整治疗方案，避免造成 严重的骨髓抑制。 严重的骨髓抑制。
网织红生成指数（ 网织红生成指数（Reticulocyte production index,RPI） ） • RPI=病人网织红细胞（%）/2 * 病人HCT/正常 病人网织红细胞（ 病人HCT/ HCT/正常
人HCT（男0.45，女0.40） HCT（ 0.45， 0.40）
• 临床应用： 临床应用： • ＞3提示溶血性贫血或急性失血性贫血； 提示溶血性贫血或急性失血性贫血；
五、注意事项
1.用酒精染液时 ， 应待玻璃片上的酒精挥发干燥 用酒精染液时， 用酒精染液时 才能加血液，染色时应用推片角不停搅动， 后，才能加血液，染色时应用推片角不停搅动， 使染料和血液混合，防止凝固。 使染料和血液混合，防止凝固。 2. 染色时间一定要充足 混合后不能立即推片， 2.染色时间一定要充足 ， 混合后不能立即推片 ， 染色时间一定要充足， 室温低时染色时间应适当延长，应覆以另一玻 室温低时染色时间应适当延长， 片防止蒸发。 片防止蒸发。 3.染液与血液比例以 ： 1为宜， 贫血适当加血量 。 染液与血液比例以1： 为宜 贫血适当加血量。 为宜， 染液与血液比例以 4.涂片厚薄均匀适宜，弓形移动，多个区域计数 涂片厚薄均匀适宜， 涂片厚薄均匀适宜 弓形移动， 5.试剂应定期重配，以免变质沉淀。 试剂应定期重配， 试剂应定期重配 以免变质沉淀。 6.与变性珠蛋白小体鉴别 与变性珠蛋白小体鉴别
网织红细胞
计数方法
1、普通光学显微镜法：活 体染色后推片镜检 2、网织细胞计数仪法：荧 光染色后用流式细胞术计数
二、试剂器材
1、试剂 10g/L煌焦油蓝酒精（水）溶液 2、器材 毛细血管采血用具、小试管、 载玻片、推片、显微镜、香柏油、二甲 苯及擦镜纸、Miller窥盘或直径约20 mm Miller 20 （较目镜内径稍小）的圆形硬纸片（正 中央开一边长为3mm的菱形或正方形小 孔，置目镜光阑处，用于缩视野法计数）
八、思考题
一溶血性贫血患者，红细胞计数 2.6x1012/L，血细胞比容0.29，网织红细 胞计数相对值为35%，如何报告网织红 细胞检测结果？
实验三
一、实验原理
网织红细胞计数
网织红细胞胞浆内残存有嗜碱性的RNA 网织红细胞胞浆内残存有嗜碱性的 物质，经煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染色后 RNA中负电荷基团与带正电荷的有色基团结 中负电荷基团与带正电荷的有色基团结 凝聚成颗粒呈浅蓝或蓝黑色的点状、 合，凝聚成颗粒呈浅蓝或蓝黑色的点状、丝状 或网状结构， 可在显微镜下识别。 计数1000 或网状结构 ， 可在显微镜下识别 。 计数 个红细胞中所有的网织红细胞数直接报告其百 分比， 红细胞计数结果报告其绝对值。 分比，或×红细胞计数结果报告其绝对值。
三、操作步骤
1. 染色：于载玻片的一端加煌焦油蓝酒精溶液1滴， 染色：于载玻片的一端加煌焦油蓝酒精溶液 滴 任其自然凉干后备用，取末梢血或抗凝血一滴，于 任其自然凉干后备用，取末梢血或抗凝血一滴， 已干燥的染料上，用推片角混匀后， 已干燥的染料上，用推片角混匀后，将两玻片盖合 玻片法） 试管法取染液2滴入试管 加血2滴 滴入试管， （ 玻片法 ） ； 试管法取染液 滴入试管 ， 加血 滴 混匀，封闭好， 分钟以上时间， 混匀，封闭好，待15分钟以上时间， 分钟以上时间 2. 推片：取混合液 小滴于载玻片的一端，推制成薄 推片：取混合液1小滴于载玻片的一端 小滴于载玻片的一端， 而均匀的血膜， 而均匀的血膜， 3. 低倍镜浏览 ， 选取红细胞分布均匀网织红细胞染 低倍镜浏览， 色较好的部分（体尾交界处） 色较好的部分（体尾交界处），滴香柏油转换至油 窥盘下计数小方格中的RBC数和大方 镜，在Miller窥盘下计数小方格中的 窥盘下计数小方格中的 数和大方 格中的网织红细胞数（ 或数出整个视野中的RBC 格中的网织红细胞数 （ 或数出整个视野中的 总数和其中的网织红细胞数， 总数和其中的网织红细胞数，换一视野同法计数至 几个视野RBC总数 总数>1000为止）。 为止） 几个视野 总数 为止
Miller窥盘
将Miller窥盘放在显 Miller窥盘放在显 微பைடு நூலகம்目镜中, 微镜目镜中,通过窥盘 中大小方格间的9 中大小方格间的9比1 比例关系计算RBC RBC数和 比例关系计算RBC数和 Ret数 Ret数。
B
1
3
A
四、计算
ler窥盘法： 网织红细胞 （ Retic） 窥盘法：网织红细胞（ 窥盘法 ） 百分率(%)= （大方格内 大方格内Retic总数） 总数） 百分率 总数 /（小方格内 总数× ） （小方格内RBC总数×9）×100% 总数 2.直接计数法：网织红细胞（Retic）百 直接计数法： 直接计数法 网织红细胞（ ） 分率(%)= 多个视野内 多个视野内Retic总数 多 总数/多 分率 总数 个视野内RBC总数×100% 总数× 个视野内 总数
网织红细胞（ ） 网织红细胞（Ret）
是晚幼红细胞脱核后到成熟红细胞间 的过渡细胞， 尚未完全成熟的红细胞， 的过渡细胞，是尚未完全成熟的红细胞， 其胞浆内残存有嗜碱性的RNA物质 。 嗜 物质。 其胞浆内残存有嗜碱性的 物质 碱性物质与染料凝聚成蓝色颗粒， 碱性物质与染料凝聚成蓝色颗粒，颗粒与 颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。 颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。 分型： 丝球型、 网型、 破网型、 点粒型。 分型 ： 丝球型 、 网型 、 破网型 、 点粒型 。 （Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型）