实验二 网织红细胞计数
网织红细胞计数实训报告
一、实训背景网织红细胞是红细胞前体，其计数对于评估骨髓造血功能和红细胞生成情况具有重要意义。
本实训旨在通过学习网织红细胞计数的操作方法，掌握其计数原理和注意事项，提高对血液学检验的认识和技能。
二、实训目的1. 了解网织红细胞计数的基本原理和操作方法。
2. 掌握显微镜下观察和计数网织红细胞的技术。
3. 学会分析网织红细胞计数结果，并应用于临床实践。
三、实训内容1. 网织红细胞计数原理网织红细胞计数是通过染色技术将网织红细胞与成熟红细胞区分开来，然后进行计数。
常用的染色剂有煌焦油蓝、新亚甲蓝等。
染色后，网织红细胞呈现蓝绿色网状或点粒状物质，而成熟红细胞则呈红色。
2. 网织红细胞计数操作方法（1）制备血涂片：取新鲜血液2滴，加入10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液2滴，立即混匀，置37℃下15～20分钟。
（2）制片：取1小滴制成薄血涂片，自然干燥。
（3）染色：将染好的血涂片放入染色缸中，用染液染色5～10分钟。
（4）观察：在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。
（5）计数：在油镜下计数至少1000个红细胞中的网织红细胞数。
（6）计算：网织红细胞分数 = 计数的网织红细胞数 / 1000网织红细胞绝对值 = 红细胞数× 10^12 / L × 网织红细胞分数3. 注意事项（1）染色时间要适中，过长或过短都会影响计数结果。
（2）观察时要选择红细胞分布均匀的部位，避免计数误差。
（3）计数时要仔细区分网织红细胞与HbH包涵体。
（4）计算时要确保数值准确。
四、实训结果与分析本次实训，我们按照操作步骤进行了网织红细胞计数，并计算出网织红细胞分数和绝对值。
通过对计数结果的分析，我们了解到患者的骨髓造血功能和红细胞生成情况。
五、实训总结通过本次实训，我们掌握了网织红细胞计数的操作方法，了解了其计数原理和注意事项。
同时，我们也认识到，在实际操作中，要严格按照操作步骤进行，确保计数结果的准确性。
此外，我们还学习了如何分析计数结果，并将其应用于临床实践。
实习二红细胞、网织红细胞检测
[注意事项]
氰化钾是剧毒品，配制稀释液时要按剧毒品管理程序保管、 操作 配制好的HiCN稀释液中因氰化钾含量低，又有高铁氰化钾 存在，毒性不是很大。若进入体内，高铁氰化钾氧化血红 蛋白，生成高铁血红蛋白。后者结合CNˉ，起到一定的解 毒作用，但仍应妥善保管 测定后的废液不能与酸性溶液混合－－氰化钾遇酸可产生 剧毒的氰氢酸气体 为防止氰化钾污染环境，比色测定后的废液集中于广口瓶 中－－应注意废液处理，可用除毒液除毒
170~200g / L (17~20g /dl)
临床意义
红细胞及血红蛋白增多－－单位容积血液中 RBC 及血红 蛋白量高于参考高限
－－可分为相对性增多和绝对性增多两大类
红细胞及血红蛋白减少－－单位容积循环血液中 RBC 、 血红蛋白量及红细胞比积低于参考值低限，称为贫血。
贫血可概括为两大类：即生理性减少和病理性减少 各种贫血红细胞与血红蛋白的减低不一定呈平行关系
操作：取一滴血与煌焦油蓝染液混合，制成涂片
在油镜下，观察红细胞胞质内蓝色的丝网状结构－－计数 1000个红细胞，求得其中网织红细胞百分数
染色及涂片要点
在洁净载玻片上加1％煌焦油兰酒精液一滴；待干 取新鲜血液一滴，滴于载玻片的染液上，轻轻搅拌 保持载玻片上血液不致干涸，染色5分钟或更长 常规涂片方法，推成薄而均匀的血膜片，自然干燥
器材及试剂：
取血吸管，一次性定量采血管 (20ul) 计数板：是一块厚玻璃制成，板上刻度分为 9 个大方格 面积为 Imm 2 。中央大方格用于红细胞计数，被双线等 分成 25 个中方格，每个中方格又划分为 16 个小方格 。 计数板与盖玻片组成计数池，计数池深度为 0.1mm 显微镜 、盖玻片、刺血针、棉花等
网织红细胞计数操作规程
网织红细胞计数操作规程目的：本实验旨在规范网织红细胞计数的标准操作，以确保实验数据的准确性。
原理：网织红细胞是未完全成熟的红细胞，其包体较一般红细胞稍大，胞浆中尚有嗜碱性残留物质，可被煌焦油蓝等染成蓝色颗粒状、线状及网状结构物。
网织红细胞的数量可用百分率或每立方毫米血液中的绝对值数来表示。
材料：煌焦油蓝（灿烂甲酚蓝）、枸橼酸钠、生理盐水、香柏油、载物片（玻璃片）、推片（磨去边的玻璃片）、试管（2ml）、毛细吸管或枪头（200微升）、光学显微镜。
操作规程：染色液配制：将煌焦油蓝0.4g和3.5%枸橼酸钠20ml研磨溶解后加入生理盐水至100ml，过滤备用。
室温下可保存6个月。
血膜片制备：1.染色：取试管一支，用毛细管或枪头于其中加入染液2～5滴，然后再加入新鲜血液1滴轻摇混合，染色10～15min。
2.制片：取载物片一片，用毛细管或枪头吸取血液染色液1小滴于载物片上，并用推片约45度角推制成舌型血膜片，自然干燥备用。
3.观察：用显微镜观察，取血膜片滴入香柏油1滴，将血膜片置于显微镜载物台，用油镜观察网织红细胞。
4.计数：取计数器在油镜下检查计数红细胞，即计数红细胞中网织红细胞的数量，检查计数1000个红细胞中网织红细胞的数量，并得出千分率再除以10即为百分率。
计算公式：百分率=1000个红细胞中网织红细胞的数量/1000注意事项：1.载物片使用前必须经过酸或碱液浸泡脱脂处理后方可使用。
2.血膜片制备需要反复练推片，熟练推制血膜片的技巧。
3.血膜片的厚薄要适中，过厚或过薄均无法进行观察。
4.室温过低时，血液染色时间要适当延长，以确保细胞着色更充分。
5.血膜片需在3天内检查计数，否则其网状结构会褪色，不易观察清晰。
(三)网织红细胞计数
（2）评价疗效
网织红细胞反应： 网织红细胞反应：IDA或巨幼细胞贫血分别 或巨幼细胞贫血分别 给予铁剂、维生素B 或叶酸治疗2~3d后，网织 给予铁剂、维生素 12或叶酸治疗 后 红细胞计数值开始上升， 达到最高(10% 红细胞计数值开始上升，7~10d达到最高 达到最高 左右)；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、 左右 ；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、 血红蛋白开始升高。 血红蛋白开始升高。 骨髓移植、 治疗后： 骨髓移植、EPO治疗后：若骨髓开始恢复造 治疗后 血功能， 升高， 血功能，RMI升高，网织红细胞计数值上升。 升高 网织红细胞计数值上升。
六、参考值
成人： 成人：0.005-0.015（0.5%-1.5%） （ ） 新生儿： 新生儿：0.02-0.06（2%-6%） （ ） 儿童： 儿童：0.005-0.075（0.5%-7.5%） （ ） 成人绝对值（ 成人绝对值（24-84） ×109/L ）
七、临床意义
（1）评价骨髓增生能力，判断贫血类型 ）评价骨髓增生能力， 再障时 明显降低。绝对值低于 × 再障时，明显降低。绝对值低于5×109/L可 可 做为急性再障的辅助诊断指标。 做为急性再障的辅助诊断指标。 失血、多数溶血性贫血患者网织红细胞可明 失血、多数溶血性贫血患者网织红细胞可明 溶血性贫血 显高于正常。 显高于正常。 营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持 营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持 正常、轻度升高或降低。 正常、轻度升高或降低。
（3）放、化疗监测 机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制， 机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制， 早期HFR和MFR降低，然后才检测到网织 降低， 早期 和 降低 红细胞的降低。而停止放、化疗， 红细胞的降低。而停止放、化疗，骨髓功 能恢复后，又见上述指标依次上升。 能恢复后，又见上述指标依次上升。可指 导临床医师适时调整治疗方案， 导临床医师适时调整治疗方案，避免造成 严重的骨髓抑制。 严重的骨髓抑制。
网织红细胞计数
号的部位，按一定顺序计数。由于网织红细胞体
积较大，应兼顾血涂片的边缘和尾部。凡含有2个
问答题
1.网织红细胞的分类和特点。 2.网织红细胞计数可用哪些染液？ 3.影响网织红细胞计数的因素有哪些? 4.网织红细胞计数增高的临床意义。 5.Ret测定注意事项。 6.如何根据血液标本的血红蛋白浓度推 一张好的血玻片?
网织红细胞比值=
1000
网织红细胞绝对值（个/L）=网织红细胞比值×红细胞数/L
[注意事项]
• 血液与染液的比例以1：1为宜，贫血时适当增加
血量。
• 染色时间不能过短，室温低时，可适当延长染色
时间或放置37℃恒温水浴箱染色，否则会因为染
色浅造成结果偏低。
• 选择红细胞分布均匀、不重叠、网织红细胞着色
的一角轻轻将血液与染料混匀。用另张载玻片盖于其上，使
两玻片黏合，以防染色过程中水分蒸发而使血液和染料干燥。 （3）染色和制片室温放置5-10min后，移开上层载玻片,取1 小滴制成薄血涂片(或两载玻片贴合轻轻对拉，制备成两张 涂片)。 （4）观察、计数和计算。
网织红细胞
四、结果计算
计数1000个全部红细胞中的网织红细胞数
（2）加血标本 于上述试管内加人新鲜全血2滴，立 即混匀。
（3）染色和制片 水浴15-20min,取混匀染色血1小 滴制成薄血涂片，自然干燥。 （4）观察网织红细胞 低倍视野下观察红细胞的分 布和染色情况，并选择红细胞分布均匀、平铺、着 色好的部位。
2.玻片法
（1）滴加染液取载玻片1张,在其 一端滴染液1滴,待自然干 燥后备用。 （2）加血液标本加人新鲜全血1滴于千燥的染料上，用推片
实验四
网织红细胞计数
一、实验目的及原理
网织红计数的方法与原理
6.临床意义
6.1．评价骨髓增生能力，判断贫血类型 6.2. 评价疗效 6.3. 放疗和化疗的监测
6．计算：网织红细胞百分数=大方格内的 网织红细胞数÷（小方格内的红细胞数 ×9 ）×100%
7.报告方式：百分数（%）或绝对值（个/L）
网织红细胞绝对值=红细胞浓度数（ 1012 /L） ×网织红细胞百分数
2.4仪器法 包括流式细胞仪法、网织红细胞计 数仪法和血液分析仪法
网织红细胞计数仪法：根据荧光强度对RNA进 行定量分析，精确计数网织红细胞占成熟红细 胞的百分数（Ret%），可将Ret分为 HFR,MFR,LFR三类,见下图：
嗜碱性物质少，呈 主要存在与外周血 分散的细颗粒，短 中 丝状
2 检测原理及方法
2.1检测原理
网织红细胞的核糖核酸以弥散胶体状态存在。常 规细胞染色法在涂片及染色过程中对细胞进行了 固定，使网织红细胞的核酸物质即使着色也难于 在普通显微镜下识别。Ret须经活体染色或荧光染 色后才可用显微镜识别或经仪器计算分离。 因此就有两大类计数方法：显微镜计数法和仪器 计数法。
ICSH根据网织红细胞的形态特征和成熟程度将 Ret分为4型：
分型
形态特征
正常存在部位
Ⅰ型（丝球型） Ⅱ型（网型） Ⅲ型（破网型） Ⅳ型（点粒型）
RBC几乎被网织物 仅在正常骨髓 充满
位于RBC中央、线 大量存在与骨髓， 团样，结构松散 外周血中很难见到
网状结构稀少，呈 少量存在与外周血 不规则点状排列 中
2.2显微镜计数法（玻片法、试管法和Miller窥盘计数 法） 。
.试管法
1.取小试管滴加2滴10g/L的煌焦油蓝生理盐水，混 匀；
网织红计数
1．项目名称网织红细胞计数2．检验目的2．1观察贫血疗效2．2骨髓移植后监测骨髓造血恢复2．3其他疾病协诊等临床实验室3．检验原理：网织红细胞是尚未完全成熟的红细胞，其胞浆内尚存在有嗜碱性的RNA物质，甲蓝活体染色后，其胞浆内尚存在有嗜碱性的RNA物质，经煌焦油蓝或新亚呈浅蓝或深蓝色的网状结构。
4．性能参数4．1重复性4．2分析和计算参数：百分比（%）4．3样本量：染液量=1：14．4精密度5．原始样品系统：全血6．容器和添加剂类型容器采用真空负压专用抗凝管，添加剂类型为0.109M乙二胺四乙酸钾7．试剂显微镜7．1 10G/L新亚甲蓝（或煌焦油蓝）生理盐水溶液：新亚甲蓝 1.0G枸橼酸钠0.4G氯化钠0.85G溶于双蒸馏水100ML中，混匀，过滤后备用。
7．2 显微镜7．2．1 商标8．校准程序:显微镜的验证，光路系统校正灯泡大约半年更换一次9．程序步骤：9．1标本采集与要求9．1．1标本采集：抽取静脉血1.8ml，加入到含有乙二胺四乙酸钾溶液的抗凝真空试管中，并轻轻颠倒10次使之充分混匀，不得有凝块、不得形成泡沫，总量不得超过2.0±0.2ml，并在试管上做好标识。
采血应避免溶血，采血后2小时内送到检验科，需要运输时应在低温条件下运输。
采集标本时宜“一针见血”,以防止组织损伤。
9．1．2不合格标本的处理对凝固、有凝块、采血量不符合要求、无条码或无标识等不合格的标本,距采集时间超过2小时并且没有按要求储存的标本,按程序文件《样品核收、登记和保存程序》处理9．1．3标本保存检测应在标本采集后2小时内完成,2～8℃保存不超过4小时,分析后的标本保存三天。
9．2检验前准备9．2．1把接收到的标本按顺序编写序号。
9．2．2准备清洁、干燥、无尘、无油脂的载玻片、盖玻片、毛细管，玻璃笔。
9．3病人标本的检验9．3．1取小试管1支加10G/L新亚甲蓝盐水溶液2滴。
9．3．2加入末梢血（或EDTA钾抗凝静脉血）2滴于上述试管中，混匀。
网织红细胞计数检测标准操作规程
网织红细胞计数检测标准操作规程1.【目的】为了规范化操作，保证检测结果准确可靠。
2.【职责】2.1实验室工作人员均应熟知并严格遵守本SOP，室负责人监督落实。
2.2本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：室负责人、科主任。
3.【样本类型及实验前准备】3.1样本类型：静脉血2ml（标本应新鲜，注意避免污染，避免溶血，注意有无血凝块）。
3.2患者准备：要求患者处于安静状态精神、体力、情绪等因素的影响较小。
3.3容器添加剂类型：EDTA-2K3.4实验试剂：煌焦油蓝或新亚甲蓝染液4.【测定原理】网织红细胞是晚幼红细胞到完全成熟红细胞之间的过渡型细胞，由于其细胞浆中尚存在嗜碱性的RNA物质，用煌焦油蓝或新亚甲蓝进行活体染色后，RNA中的负电荷基团与带正电荷的有色基团结合，胞浆中镜检可见有浅蓝色或深蓝色的点状.丝状或网状结构。
5.【操作步骤】5.1样本要求新鲜全血或EDTA抗凝全血。
5.2将网织红细胞染色液与病人全血1：1比例混匀，静置室温20分钟或更久。
制成血涂片，于显微镜下观察，判读。
5.3先在低倍镜下浏览，了解染色好坏和细胞分布情况。
选择涂片体尾交界处染色良好的区域，在油镜下观察1000个红细胞，算出网织红细胞的百分率。
6.【生物参考区间】儿童成人：0.05—0.15%新生儿：0.3—0.6%7.【临床意义】网织红细胞增加见于各种增生性贫血，溶贫尤为显著，巨幼贫和缺铁贫在治疗后显著曾生，表示有治疗效果;减少常见于再生障碍性贫血。
7.1增高提示骨髓造血功能旺盛，见于各种增生性贫血（溶血性、缺铁性、巨幼细胞性、急性失血性贫血）及经相应药物治疗有效时；急性溶血时可高达0.6～0.8；急性失血后5～10d网织红细胞达高峰，2周后恢复正常；恶性贫血或缺铁性贫血使用维生素B12或供铁质后显著增多，表示有疗效。
7.2减低提示骨髓造血功能低下，见于再生障碍性贫血、溶血性贫血再生危象时。
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盐水溶液２滴，加入血液２滴后混匀， 紧塞管口，待15分钟后混匀，倾出１滴 后推片。
⒉ 待干后，低倍镜下选细胞分布均匀 ，着色清晰处，用目镜中加入网格计数 器或用纸圈缩小视野，计数1000个红细 胞中的网织红细胞数，除以1000，即得 网织红细胞数。
四、临床意义 ⒈ 通过网织红细胞计数，可判断骨髓
红细胞系统造血情况。溶血性贫血时， 网织红细胞高达0.20或更高。急性失血 后5~10天，网织红细胞达高峰，２周后 恢复正常。再生障碍性贫血，网织红细 胞比值小于0.005。
⒉ 网织红细胞可作为疗效观察的指标.
三、方法
㈠ 玻片法 ⒈ 在洁净的玻片一端滴加１％的煌焦 油蓝溶液一小滴，待干。 ⒉ 取血液一大滴于煌焦蓝染料，迅速
以推片一角将其混合，然后将两玻片部 分粘合，待2~5分钟后推成血片。
⒊ 用油镜计数1000个红细胞中的网织 红细胞数，求其百分数。
⒋ 参考值：成人0.008~0.020，初生儿 0.020~0.060。
实验二 网织红细胞计数
一、目的
掌握网织红细胞活体染色原理、形 态学特点、计数方法。 熟悉正常参考值及临床意义。
二、原理
网织红细胞是未完全成熟的红细胞， 由于其胞浆中尚残有核糖体等嗜碱性 物质，经煌焦油蓝染液活体染色后， 可见有蓝绿色的点状，线状或网状结 构，网织红细胞点状结构越多，表示 细胞越年轻，反之则更近于成熟。