网织红细胞计数
《临床检验基础》课件——第九讲：网织红细胞计数实验
不允许以血红 蛋白浓度来折 算红细胞数
充池要均匀， 不能有气泡混 入、溢出或不
满
请认真书写实 验报告
谢谢 大家
数板等
试剂
红细胞稀释液
改良牛鲍氏计数板
操作步骤
01
02
03
04
取中号试管1支 ，加红细胞稀 释液20ml。用清洁干燥微量吸管 取末梢血10μl ，擦去 管外余血后加至红细 胞稀释液底部，再轻 吸上层清洗吸管2-3次
立即混匀。
混匀后，用干净 微量吸管将红细 胞悬液充人计数 池，不得有空泡 或外溢，充池后 静置2-3 min后计
参考区间
男：
（4.09～5.74）×1012/L
女：
（3.68～5.13）×1012/L
新生儿：（5.2～6.4）×1012/L
注意事项
1
2
3
4
5
采血时不能 挤压过甚， 因此针刺深 度必须适
当。。
稀释液要过滤， 试管、计数板 均须清洁，以 免杂质、微粒 等被误认为红
细胞
参考范围数 值内，两次 红细胞计数 相差不得超
临床检验基础
第九讲 网织红细胞计数
目录
CONTENTS
实验原理 实验器材 实验试剂 操作步骤
计算 参考值 注意事项 思考题
实验原理
用等渗稀释液将血液按一定倍 数稀释，充人计数池后显微镜下 计数一定体积内红细胞数，换算 求出每升血液中红细胞的数量
试验器材、试剂
试验器材
显微镜、改良 Neubauer血细胞计
数。
高倍镜下依次计 数中央大方格内 四角和正中共5 个中方格内的红 细胞。对压线细 胞按"数上不数下 、数左不数右"的
10-网织红细胞计数
10-网织红细胞计数B D I S R e t i c-C O U N T（T h i a z o l e O r a n g e）Catalog No. 349204简介早期红细胞细胞核丢失后，胞浆内仍残留有细胞器（如核糖体、线粒体），这样的早期红细胞就是网织红细胞，它有别于不含细胞器的成熟红细胞。
这些细胞器富含核酸物质（RNA和DNA），而在成熟红细胞中不含有此种物质。
正常人（非贫血者）中，网织红细胞在骨髓中三天成熟，第四天出现在外周循环血中。
网织红细胞计数可以评估红细胞造血系统活性，但是如果网织红细胞的骨髓成熟时间缩短而循环血成熟时间延长，这种评估方法就会有误差。
这时，外周血相中一至三天的网织红细胞（“漂移”网织红细胞）也会被当做第四天网织红细胞而计算在内。
如遇此种情况，应当对“漂移”网织红细胞做修正（修正公式见流式细胞仪分析一节）。
BD公司生产的Retic-COUNT试剂主要成分为噻唑橙（TO），与丫啶橙（AO）的作用类似。
TO 与DNA碱基对以1:2的比例结合，分解常数、正电荷数和膜通透性与AO相近。
Retic-COUNT试剂既可与DNA结合，也可与RAN结合，形成的荧光-核酸复合物，吸收光谱为475nm，荧光发射光谱为530nm，因此，适合在安装了488nm激光的流式细胞仪上使用，如FACSCalibur，FACSort，FACScan等。
网织红细胞计数的传统方法是使用新亚甲基蓝染料，染色涂片后，光镜下计数。
但此方法费时，且由于只计数1000个细胞，因而存在固有的取样误差。
使用Retic-COUNT流式细胞术方法进行网织红细胞计数，与传统的新亚甲基蓝方法相比，存在很多优势。
使用流式细胞术，可以检测上万个细胞，具有很好的取样精确性。
由于使用的是细胞悬液，可以消除涂片时的分布误差。
同时，它还具有省时、操作简便等优点。
另外，由于可以使用配套的Retic-COUNT自动软件，不需要做阴性对照，还可以减少操作的变异性。
临检--网织红细胞计数(Ret)
网织红细胞计数（Ret）【定义】网织红细胞是晚幼红细胞脱核后到完全成熟红细胞间的过渡细胞，属于尚未完全成熟的红细胞，其胞质中残存嗜碱性物质核糖核酸（RNA），经活体染色后，嗜碱性物质凝聚成蓝黑色颗粒，颗粒与颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。
【分型】根据网织红细胞发育阶段分为4型，分别是：Ⅰ型（丝球型）：红细胞充满网状物，见于骨髓。
Ⅱ型（网型）：红细胞网状物结构松散，见于骨髓。
Ⅲ型（破网型）：红细胞网状物结构稀少，呈不规则枝点状排列，见于外周血。
Ⅳ型（点粒型）：红细胞内为分散的细颗粒、短丝状网状物，见于外周血。
【检测原理】1.普通光学显微镜法2.网织细胞计数仪法和血液分析仪法【操作方法】1.显微镜试管法操作（1）加染液：于试管中加入10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液2滴，再加新鲜血2滴，立即混匀，置37℃下15～20min。
（2）制片：取1小滴制成薄血涂片，自然干燥。
（3）观察：在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。
（4）计数：在油镜下计数至少1000个红细胞中网织红细胞数。
（5）计算：网织红细胞分数=（计数的网织红细胞数）/1O00，网织红细胞绝对值（×109/L）=红细胞数×1012/L×网织红细胞分数。
2.显微镜法注意事项（1）网织红细胞必须活体染色，WH0推荐使用新亚甲蓝染液，其染色力强且稳定。
煌焦油蓝染液操作简单、费用低廉，但易产生沉淀、工作效率不高、精度差。
染液与血液比例以1:1为宜，严重贫血时，可适量增加血量。
（2）为提高网织红细胞计数精度和速度，ICSH推荐使用Miller窥盘，方法是将Miller 窥盘置于目镜内，选择红细胞散在且分布均匀的部位（3）用小方格（A）计数红细胞，大方格（B）计数网织红细胞，按下式计算：（4）注意鉴别网织红细胞与HbH包涵体。
Ret为蓝绿色网状或点粒状物质，分布不均，HbH包涵体为蓝绿色圆形小体，均匀散布于整个红细胞内。
网织红细胞计数
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3．作为病情观察的指标
溶血性贫血及失血性贫血，治疗过程中 连续观察网织红细胞计数，可作为判断 病情变化的参考指标。 如治疗后网织红细胞逐渐降低，表示溶 血或出血已得到控制。 如网织红细胞持续不减低，甚至更增高， 表示病情未得以控制，甚至加重。
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四、红细胞沉降率测定
红细胞沉降率（ESR），简称血沉率 指红细胞在一定条件下沉降的速率。 正常情况下，红细胞在血浆中具有相对 的悬浮稳定性，沉降极其缓慢。 在病理情况下，血沉率可明显增快。
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临床意义
2．血细胞比容减低 见于各种贫血。 不同类型的贫血，红细胞体积大小不同， 故血细胞比容的减少与红细胞数量减少 并不—定成正比。 因此必须将红细胞数、血红蛋白量和血 细胞比容三者结合起来，计算红细胞各 项平均值才有参考意义。
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(二)红细胞平均值的计算
1．平均红细胞容积(MCV) 指每个红细胞的平均体积，以飞升（ fl ）为单 位。
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参考值
魏氏(Westergoen)法： 成年男性0~15mm/1小时末
成年女性0~20mm/1小时末
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临床意义
(一)生理性变化 12岁以下的儿童血沉略快。 妇女月经期血沉略增快，可能与子宫内膜破损 及出血有关。 妊娠3个月以后至分娩后3周血沉快，与生理性 贫血及纤维蛋白原含量增加等有关。 老年人血浆纤维蛋白原含量增加血沉加快。 高原地区居民红细胞增多，血沉低于平原地区。
网织红细胞计数操作规程
网织红细胞计数操作规程目的：本实验旨在规范网织红细胞计数的标准操作，以确保实验数据的准确性。
原理：网织红细胞是未完全成熟的红细胞，其包体较一般红细胞稍大，胞浆中尚有嗜碱性残留物质，可被煌焦油蓝等染成蓝色颗粒状、线状及网状结构物。
网织红细胞的数量可用百分率或每立方毫米血液中的绝对值数来表示。
材料：煌焦油蓝（灿烂甲酚蓝）、枸橼酸钠、生理盐水、香柏油、载物片（玻璃片）、推片（磨去边的玻璃片）、试管（2ml）、毛细吸管或枪头（200微升）、光学显微镜。
操作规程：染色液配制：将煌焦油蓝0.4g和3.5%枸橼酸钠20ml研磨溶解后加入生理盐水至100ml，过滤备用。
室温下可保存6个月。
血膜片制备：1.染色：取试管一支，用毛细管或枪头于其中加入染液2～5滴，然后再加入新鲜血液1滴轻摇混合，染色10～15min。
2.制片：取载物片一片，用毛细管或枪头吸取血液染色液1小滴于载物片上，并用推片约45度角推制成舌型血膜片，自然干燥备用。
3.观察：用显微镜观察，取血膜片滴入香柏油1滴，将血膜片置于显微镜载物台，用油镜观察网织红细胞。
4.计数：取计数器在油镜下检查计数红细胞，即计数红细胞中网织红细胞的数量，检查计数1000个红细胞中网织红细胞的数量，并得出千分率再除以10即为百分率。
计算公式：百分率=1000个红细胞中网织红细胞的数量/1000注意事项：1.载物片使用前必须经过酸或碱液浸泡脱脂处理后方可使用。
2.血膜片制备需要反复练推片，熟练推制血膜片的技巧。
3.血膜片的厚薄要适中，过厚或过薄均无法进行观察。
4.室温过低时，血液染色时间要适当延长，以确保细胞着色更充分。
5.血膜片需在3天内检查计数，否则其网状结构会褪色，不易观察清晰。
实验三网织红细胞计数血沉测定专家讲座
实验三网织红细胞计数血沉测定
第2页
▪ 器材 显微镜、试管、吸管、玻片、推片、 香柏油、擦镜纸、擦镜液
▪ 试剂 新亚甲蓝 ▪ 标本 新鲜全血
实验三网织红细胞计数血沉测定
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操作步骤
▪ 1.加染液 将Ret染液2滴加至小试管中，做好标识。
▪ 2.加血 在已加入染液小试管内注入新鲜全血2滴， 马上混匀。
实验三网织红细胞计数血沉测定
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注意事项
▪ 1.试剂准备 推荐使用新亚甲蓝染液, 试剂应定 时配制, 用前过滤。
▪ 2.染色 染液与血液比以1:1为宜,染色时间不能 过短。试剂用后及时盖好盖子, 以免挥发。
▪ 3.标本 应及时染色, 及时测定。 ▪ 4.计数 选择红细胞分布均匀, 网织红细胞着色
实验三网织红细胞计数血沉测定
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二、血液沉降率测定（魏氏法）
参考值 ＜50岁: 男性 < 15mm/h 女性 <20mm/h
＞50岁: 男性 < 20mm/h 女性 <30mm/h
实验三网织红细胞计数血沉测定
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注意事项
1.严格控制采血量，使抗凝剂与血液百分比为 1: 4。
2.血沉管应垂直放置，不得倾斜。
实验三网织红细胞计数血沉测定
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白细胞计数
一、目标
掌握显微镜白细胞计数方法。
二、原理
用白细胞稀释液将血液稀释
一定倍数, 同时破坏溶解红细胞。 将稀释血液冲入计数池后, 在显微 镜下计数一定体积内白细胞数, 经 换算求出每升血液中白细胞数。
实验三网织红细胞计数血沉测定
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三、器材
显微镜、改良计数板、血盖片、试管、微量 吸管、加样枪、乳胶吸头、纱布
10-网织红细胞计数
10-网织红细胞计数B D I S R et i c-C O U N T（Thi azol e O r ange）Catalog No. 349204简介早期红细胞细胞核丢失后，胞浆内仍残留有细胞器（如核糖体、线粒体），这样的早期红细胞就是网织红细胞，它有别于不含细胞器的成熟红细胞。
这些细胞器富含核酸物质（RNA和DNA），而在成熟红细胞中不含有此种物质。
正常人（非贫血者）中，网织红细胞在骨髓中三天成熟，第四天出现在外周循环血中。
网织红细胞计数可以评估红细胞造血系统活性，但是如果网织红细胞的骨髓成熟时间缩短而循环血成熟时间延长，这种评估方法就会有误差。
这时，外周血相中一至三天的网织红细胞（“漂移”网织红细胞）也会被当做第四天网织红细胞而计算在内。
如遇此种情况，应当对“漂移”网织红细胞做修正（修正公式见流式细胞仪分析一节）。
BD公司生产的Retic-COUNT试剂主要成分为噻唑橙（TO），与丫啶橙（AO）的作用类似。
TO 与DNA碱基对以1:2的比例结合，分解常数、正电荷数和膜通透性与AO相近。
Retic-COUNT试剂既可与DNA结合，也可与RAN结合，形成的荧光-核酸复合物，吸收光谱为475nm，荧光发射光谱为530nm，因此，适合在安装了488nm激光的流式细胞仪上使用，如FACSCalibur，FACSort，FACScan等。
网织红细胞计数的传统方法是使用新亚甲基蓝染料，染色涂片后，光镜下计数。
但此方法费时，且由于只计数1000个细胞，因而存在固有的取样误差。
使用Retic-COUNT流式细胞术方法进行网织红细胞计数，与传统的新亚甲基蓝方法相比，存在很多优势。
使用流式细胞术，可以检测上万个细胞，具有很好的取样精确性。
由于使用的是细胞悬液，可以消除涂片时的分布误差。
同时，它还具有省时、操作简便等优点。
另外，由于可以使用配套的Retic-COUNT自动软件，不需要做阴性对照，还可以减少操作的变异性。
(三)网织红细胞计数
（2）评价疗效
网织红细胞反应： 网织红细胞反应：IDA或巨幼细胞贫血分别 或巨幼细胞贫血分别 给予铁剂、维生素B 或叶酸治疗2~3d后，网织 给予铁剂、维生素 12或叶酸治疗 后 红细胞计数值开始上升， 达到最高(10% 红细胞计数值开始上升，7~10d达到最高 达到最高 左右)；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、 左右 ；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、 血红蛋白开始升高。 血红蛋白开始升高。 骨髓移植、 治疗后： 骨髓移植、EPO治疗后：若骨髓开始恢复造 治疗后 血功能， 升高， 血功能，RMI升高，网织红细胞计数值上升。 升高 网织红细胞计数值上升。
六、参考值
成人： 成人：0.005-0.015（0.5%-1.5%） （ ） 新生儿： 新生儿：0.02-0.06（2%-6%） （ ） 儿童： 儿童：0.005-0.075（0.5%-7.5%） （ ） 成人绝对值（ 成人绝对值（24-84） ×109/L ）
七、临床意义
（1）评价骨髓增生能力，判断贫血类型 ）评价骨髓增生能力， 再障时 明显降低。绝对值低于 × 再障时，明显降低。绝对值低于5×109/L可 可 做为急性再障的辅助诊断指标。 做为急性再障的辅助诊断指标。 失血、多数溶血性贫血患者网织红细胞可明 失血、多数溶血性贫血患者网织红细胞可明 溶血性贫血 显高于正常。 显高于正常。 营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持 营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持 正常、轻度升高或降低。 正常、轻度升高或降低。
（3）放、化疗监测 机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制， 机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制， 早期HFR和MFR降低，然后才检测到网织 降低， 早期 和 降低 红细胞的降低。而停止放、化疗， 红细胞的降低。而停止放、化疗，骨髓功 能恢复后，又见上述指标依次上升。 能恢复后，又见上述指标依次上升。可指 导临床医师适时调整治疗方案， 导临床医师适时调整治疗方案，避免造成 严重的骨髓抑制。 严重的骨髓抑制。
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【临床意义】
★放疗和化疗的监测：网织红细胞 的动态观察可指导临床适时调整 治疗方案，避免造成严重的骨髓 抑制。
本节要点
1、什么是网织红细胞？ 2、根据发育阶段网织红细胞分哪几型？ 3、网织红细胞的参考值是多少？ 4、网织红细胞计数的临床意义有哪些？
【方法学评价】
手工法 ：具有操作简便、成本低的优点 ；但该法 操作烦琐、工作量大，且影响因素多、重复性差的 缺点 网织红细胞计数仪法：流式细胞术Ret计数法可提供 Ret绝对值、高荧光强度、中等强度和低荧光强度网 织红细胞百分率（LFR）等多种参数。临床应用价值 更大。 血液分析仪法：提高了检测的灵敏度、精密度和检 测速度。但本法成本高，假阳性增高，其检验结果 的准确性并不十分理想。无法完全取代手工计数法。
【临床意义】
★评价骨髓的造血功能 （1）网织红细胞增多：表示骨髓造血 功能旺盛，各种增生性贫血时均可增多， 如急性失血、溶血性贫血。 （2）网织红细胞减少：再生障碍性贫血，通常 低于0.5%，临床将网织红细胞绝对值低 于15×109/L，作为急性再生障碍性贫血 的诊断指标之一。
【临床意义】
★评价疗效 （1）观察贫血疗效:缺铁性贫血，巨幼细胞性贫血治疗 过程中，如网织红增高（2～3天后开始上升，7～ 10天达高峰，2周后逐渐降至正常水平），表明 治疗有效，如网织红不增高，表明治疗无效，并 提示有骨髓造血功能障碍。 （2）骨髓移植后监测造血功能恢复：移植后第21天， 若RET大于15×109/L,常表示无移植并发症；若 RET小于15×109/L,伴中性粒细胞和血小板增高 可能为移植失败
网织红细胞计数
网织红细胞（reticulocyte，Ret或RET） 是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的过渡阶段 的细胞，体积略大于成熟红细胞。网织红细胞是有核 红细胞刚刚脱去核的阶段，仍属未完全成熟红细胞， 胞质中尚残存嗜碱性物质核糖核酸，经碱性染料（煌 焦油蓝、新亚甲蓝）活体染色后，嗜碱性物质凝聚成 蓝黑色颗粒，呈现点状或线网状结构，故名网织红细 胞。
c. 胞核：圆形，居中或偏位， 核染色质凝聚成块状。
图 晚幼红细胞
二、 红细胞系 5.网织红细胞 胞体直径7-8µm，活体 染色后，胞质中出现蓝 绿色或深蓝色网点状结 构，
Ⅰ型
Ⅱ型
Ⅲ型
Ⅳ型
二、 红细胞
胞体直径7-8µm，双凹圆盘状， 粉红色，边缘较深，中央较淡。
Heilmyer根据其发育阶段分五型： O型（有核网织红细胞）：仅见于正常骨髓 Ⅰ型（丝球型）：存在于正常骨髓 Ⅱ型（网型）：大量存在于骨髓 Ⅲ型（破网型）：仅有少量释放到周围血 Ⅳ型（点粒型）：多见于正常周围血。
二、 红细胞系 2. 早幼红细胞
a. 胞体：d:15-18µ m，圆形或椭圆 形。 b. 胞浆：量多，蓝色，不透明， 仍有瘤状突起，核周淡染区 。
c. 胞核：圆或椭圆形，居中或稍偏 位，染色质浓集呈烟丝状或粗密的小 块，较原红粗糙，核仁模糊或消失。
图 早幼红细胞
二、 红细胞系 3. 中幼红细胞
二、 红细胞系 1.原始红细胞
a. 胞体：d:15-20µ m，圆形或椭圆 形，边缘常有钝角状或瘤状突起。
b. 胞浆：量少，深蓝色(油墨蓝)， 不透明，无颗粒，核周淡染(鱼肚白) 常有伪足。
c. 胞核：圆形，居中或稍偏于一 旁，染色质呈细致颗粒状。 核仁 12个，大小不一，染浅蓝色。
图 原始红细胞
a. 胞体：d:8-15µ m，圆形。 b. 胞浆：不同程度的嗜多色核 染色质凝聚成条索状或块状， 有明显空隙，如打碎墨砚感。 核仁完全消失。
图 中幼红细胞
二、 红细胞系 4. 晚幼红细胞
a. 胞体：d:7-10µ m，圆形 。 b. 胞浆：量多，浅灰，浅 红色或同成熟红细胞染色 (血红蛋白化)。
血细胞的发育过程
红细胞的发育过程
红细胞在骨髓中生成，至发育成熟为成熟 红细胞经历了不同阶段：造血干细胞、原始红 细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、 网织红细胞，最后发育为成熟红细胞。 随着红细胞的成熟，RNA含量逐渐减低， 至完全成熟后消失或接近消失，即红细胞中网 状结构越多，表示细胞越幼稚。
新亚甲蓝染色
有内含物的红细胞：网织红细胞（煌焦油蓝活体染色），见丝球型、 网型、破网型、点粒型网织红细胞。
美蓝染色
煌焦油蓝染色
【检测原理】
手工法 ：在光镜下计数至少1000个红细胞分布区域 内的Ret就可得到Ret的百分率。 网织红细胞计数仪法：用荧光染料使含RNA的网织红 细胞着色，用流式细胞术计数并计算出网织红细胞百 分比。 血液分析仪法：最新型的血液分析仪，采用流式细胞 法也可对RET作分类计数
【质量控制】
采血后及时测定 染液用量要适宜 掌握网织红细胞的判定标准 定期进行室内质量考核和室间质量评价
【参考值】
网织红细胞计数参考值
报告方式 成人 初生儿
分数
相对值 百分比 绝对值 ×109/L
0.005～0.015
0.5%～1.5% 24～84
0.02～0.06
2%～6% 3个月后达成人水平