网织红细胞计数 (2)
网织红细胞计数实训报告
一、实训背景网织红细胞是红细胞前体，其计数对于评估骨髓造血功能和红细胞生成情况具有重要意义。
本实训旨在通过学习网织红细胞计数的操作方法，掌握其计数原理和注意事项，提高对血液学检验的认识和技能。
二、实训目的1. 了解网织红细胞计数的基本原理和操作方法。
2. 掌握显微镜下观察和计数网织红细胞的技术。
3. 学会分析网织红细胞计数结果，并应用于临床实践。
三、实训内容1. 网织红细胞计数原理网织红细胞计数是通过染色技术将网织红细胞与成熟红细胞区分开来，然后进行计数。
常用的染色剂有煌焦油蓝、新亚甲蓝等。
染色后，网织红细胞呈现蓝绿色网状或点粒状物质，而成熟红细胞则呈红色。
2. 网织红细胞计数操作方法（1）制备血涂片：取新鲜血液2滴，加入10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液2滴，立即混匀，置37℃下15～20分钟。
（2）制片：取1小滴制成薄血涂片，自然干燥。
（3）染色：将染好的血涂片放入染色缸中，用染液染色5～10分钟。
（4）观察：在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。
（5）计数：在油镜下计数至少1000个红细胞中的网织红细胞数。
（6）计算：网织红细胞分数 = 计数的网织红细胞数 / 1000网织红细胞绝对值 = 红细胞数× 10^12 / L × 网织红细胞分数3. 注意事项（1）染色时间要适中，过长或过短都会影响计数结果。
（2）观察时要选择红细胞分布均匀的部位，避免计数误差。
（3）计数时要仔细区分网织红细胞与HbH包涵体。
（4）计算时要确保数值准确。
四、实训结果与分析本次实训，我们按照操作步骤进行了网织红细胞计数，并计算出网织红细胞分数和绝对值。
通过对计数结果的分析，我们了解到患者的骨髓造血功能和红细胞生成情况。
五、实训总结通过本次实训，我们掌握了网织红细胞计数的操作方法，了解了其计数原理和注意事项。
同时，我们也认识到，在实际操作中，要严格按照操作步骤进行，确保计数结果的准确性。
此外，我们还学习了如何分析计数结果，并将其应用于临床实践。
网织红细胞
②检查骨髓的功能。 ③检测贫血的治疗效果。 ④评估骨髓移植后、再生障碍性贫血细胞毒药物诱 导治疗后或EPO治疗后的红细胞造血情况。
【检测原理】 1．普通显微镜法 活体染料的碱性着色基团可与 网织红细胞RNA的磷酸基结合，使RNA胶体间的负电 荷减少而发生凝缩，形成蓝色的点状、线状或网状结 构。 2．血液分析仪法 特殊染料与网织红细胞中RNA 结合后进行RNA定量，可精确计数网织红细胞占成熟 红细胞的百分数（Ret%），并可根据RNA含量将网织 红细胞分类及计算网织红细胞其他参数。
2. 正确辨认网织红细胞 外周血液网织 红细胞主要为Ⅳ型，凡含有2个或2个以上 颗粒、且颗粒必须远离细胞边缘的红细胞 均应计为网织红细胞。红细胞各种颗粒或 包涵体的鉴别见表2-26。
六、网织红细胞计数
网织红细胞（Ret，RET） 是介于晚幼红细胞和成熟红细 胞之间的过渡细胞，略大于成 熟红细胞，其胞质中残存的嗜 碱性物质RNA经碱性染料活体 染色后，形成蓝色或紫色的点 粒状或丝网状沉淀物。
ICSH将网织红细胞分为4型 （表2-23，图2-20）。
图2-20 网织红细胞
网织红细胞检测的目的：
【方法学评价】网织红细胞计数的方法学评 价见表2-24。
Байду номын сангаас
【质量保证】以手工计数法为重点。 1．选择合适的染料 用于网织红细胞检测 的活体染料很多，有煌焦油蓝（ brilliant cresyl blue）、新亚甲蓝（ new methylene blue）、 中性红、亚甲蓝、甲苯胺蓝等。网织红细胞活 体染料的评价见表2-25。
临检--网织红细胞计数(Ret)
网织红细胞计数（Ret）【定义】网织红细胞是晚幼红细胞脱核后到完全成熟红细胞间的过渡细胞，属于尚未完全成熟的红细胞，其胞质中残存嗜碱性物质核糖核酸（RNA），经活体染色后，嗜碱性物质凝聚成蓝黑色颗粒，颗粒与颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。
【分型】根据网织红细胞发育阶段分为4型，分别是：Ⅰ型（丝球型）：红细胞充满网状物，见于骨髓。
Ⅱ型（网型）：红细胞网状物结构松散，见于骨髓。
Ⅲ型（破网型）：红细胞网状物结构稀少，呈不规则枝点状排列，见于外周血。
Ⅳ型（点粒型）：红细胞内为分散的细颗粒、短丝状网状物，见于外周血。
【检测原理】1.普通光学显微镜法2.网织细胞计数仪法和血液分析仪法【操作方法】1.显微镜试管法操作（1）加染液：于试管中加入10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液2滴，再加新鲜血2滴，立即混匀，置37℃下15～20min。
（2）制片：取1小滴制成薄血涂片，自然干燥。
（3）观察：在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。
（4）计数：在油镜下计数至少1000个红细胞中网织红细胞数。
（5）计算：网织红细胞分数=（计数的网织红细胞数）/1O00，网织红细胞绝对值（×109/L）=红细胞数×1012/L×网织红细胞分数。
2.显微镜法注意事项（1）网织红细胞必须活体染色，WH0推荐使用新亚甲蓝染液，其染色力强且稳定。
煌焦油蓝染液操作简单、费用低廉，但易产生沉淀、工作效率不高、精度差。
染液与血液比例以1:1为宜，严重贫血时，可适量增加血量。
（2）为提高网织红细胞计数精度和速度，ICSH推荐使用Miller窥盘，方法是将Miller 窥盘置于目镜内，选择红细胞散在且分布均匀的部位（3）用小方格（A）计数红细胞，大方格（B）计数网织红细胞，按下式计算：（4）注意鉴别网织红细胞与HbH包涵体。
Ret为蓝绿色网状或点粒状物质，分布不均，HbH包涵体为蓝绿色圆形小体，均匀散布于整个红细胞内。
网织红计数的方法与原理
2 检测原理及方法
2.1检测原理
网织红细胞的核糖核酸以弥散胶体状态存在。常 规细胞染色法在涂片及染色过程中对细胞进行了 固定，使网织红细胞的核酸物质即使着色也难于 在普通显微镜下识别。Ret须经活体染色或荧光染 色后才可用显微镜识别或经仪器计算分离。 因此就有两大类计数方法：显微镜计数法和仪器 计数法。
网织红细胞计数
马强虎
网织红细胞计数
1 概念、分型及形态特征 2 检测原理及方法 3 方法学评价 4 质量控制 5 参考值 6 临床意义
1 概念、分型及形态特征
1.1概念：
网织红细胞是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间 的过渡阶段细胞，略大于成熟红细胞，直径 8.0~9.5um，其胞质中残存的嗜碱性物质核糖核酸 （RNA）源自有核红细胞，嗜碱性物质RNA经碱 性染料（煌焦油蓝或新亚甲蓝等）活体染色，形 成蓝色或紫色的点粒状或丝网状结构沉淀物，故 称作网织红细胞。
3.方法学评价
检测方法
评价
普通显微镜法 玻片法 试管法
简便、成本低，可直观细胞形 态；影响因素多，重复性差
水份易蒸发，染色时间短，结Hale Waihona Puke 果偏低易掌握，重复性好，易复查
Miller窥盘计数法 仪器法
规范计算区域，减少了实验误 差，ICSH推荐方法
检测细胞多，精密度高，与手 工法相关性好，易标准化，仪 器贵；出现Howell-jolly小体， 有核红细胞，巨大血小板可是 结果假性增高。
细胞数÷1000 ×100%
网织红细胞
2.3 Miller窥盘计数法（ICSH推荐使用的Ret显微镜 计数法）
1．标本采集：真空采血管或普通空针采静脉血， 用EDTA-K2抗凝（1.5~2.2mg/ml）
网织红细胞测定讲稿
血沉过程一般分为3期： 1、缗钱状红细胞形成期，一般要经 过数分钟至10min. 2、 快速沉降期，形成缗钱状红细胞 以等速下降，约40min.
3、细胞堆积期，又称缓慢沉积期或 堆挤期，此时红细胞堆积在试管底 部。健康人血沉波动于一个狭窄范 围内，而在许多病理情况下血沉可 明显增快。
二、检测原理
五、质量控制
（一）、网织红细胞目视计数误差较 大，影响因素主要有： 1、操作人员对网织红细胞认识不同； 2、用煌焦油兰乙醇染液时，应待乙 醇完全挥发干后才能加入血液，否 则可使血液凝固，染色时间要充足。
3、血涂片质量好坏，血膜厚薄； 4、计数红细胞数量的多少和计数方法 等； 5、染液与血液比例以1：1为宜，严重 贫血时可适当增加血液比例 ；
（四）、Zeta红细胞沉降率测定：
1、原理：红细胞表面唾液酸所带负 电荷形成zeta电位，使红细胞之间 互相排斥，在血浆中保持一定的悬 浮稳定性。
肿瘤患者化疗过程
网织红细胞动态变化
结果：化疗后骨髓造血功能明显受抑，白细胞、 网红及血小板极度降低，其中中性粒细胞绝对数 降至0.02×109/L以下、网红绝对数降至10×109/L 以下，高荧光强度网红百分率和中荧光强度网红 百分率(HFR%+MFR%)逐步降至最低水平或0，网红 分类几乎全部由低荧光强度网红(LFR)组成。造血 功能开始恢复时高荧光强度网红和中荧光强度网 红的出现或升高较中性粒细胞绝对数达到 0.2×109/L早4.5天（中位数）、达到0.5×109/L 早7.5天（中位数），较网红绝对数（RET#）达到 正常范围低限早15天（中位数）。
6、目前，首选Miller窥盘法计数网织红细胞。
（二）、仪器法：虽可计数红细胞10000－50000 个，但如存在Howell-Jolly小体、有核红细胞、 巨血小板，则可见假阳性。
网织红细胞计数
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3．作为病情观察的指标
溶血性贫血及失血性贫血，治疗过程中 连续观察网织红细胞计数，可作为判断 病情变化的参考指标。 如治疗后网织红细胞逐渐降低，表示溶 血或出血已得到控制。 如网织红细胞持续不减低，甚至更增高， 表示病情未得以控制，甚至加重。
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四、红细胞沉降率测定
红细胞沉降率（ESR），简称血沉率 指红细胞在一定条件下沉降的速率。 正常情况下，红细胞在血浆中具有相对 的悬浮稳定性，沉降极其缓慢。 在病理情况下，血沉率可明显增快。
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临床意义
2．血细胞比容减低 见于各种贫血。 不同类型的贫血，红细胞体积大小不同， 故血细胞比容的减少与红细胞数量减少 并不—定成正比。 因此必须将红细胞数、血红蛋白量和血 细胞比容三者结合起来，计算红细胞各 项平均值才有参考意义。
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(二)红细胞平均值的计算
1．平均红细胞容积(MCV) 指每个红细胞的平均体积，以飞升（ fl ）为单 位。
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参考值
魏氏(Westergoen)法： 成年男性0~15mm/1小时末
成年女性0~20mm/1小时末
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临床意义
(一)生理性变化 12岁以下的儿童血沉略快。 妇女月经期血沉略增快，可能与子宫内膜破损 及出血有关。 妊娠3个月以后至分娩后3周血沉快，与生理性 贫血及纤维蛋白原含量增加等有关。 老年人血浆纤维蛋白原含量增加血沉加快。 高原地区居民红细胞增多，血沉低于平原地区。
网织红细胞计数操作规程
网织红细胞计数操作规程目的：本实验旨在规范网织红细胞计数的标准操作，以确保实验数据的准确性。
原理：网织红细胞是未完全成熟的红细胞，其包体较一般红细胞稍大，胞浆中尚有嗜碱性残留物质，可被煌焦油蓝等染成蓝色颗粒状、线状及网状结构物。
网织红细胞的数量可用百分率或每立方毫米血液中的绝对值数来表示。
材料：煌焦油蓝（灿烂甲酚蓝）、枸橼酸钠、生理盐水、香柏油、载物片（玻璃片）、推片（磨去边的玻璃片）、试管（2ml）、毛细吸管或枪头（200微升）、光学显微镜。
操作规程：染色液配制：将煌焦油蓝0.4g和3.5%枸橼酸钠20ml研磨溶解后加入生理盐水至100ml，过滤备用。
室温下可保存6个月。
血膜片制备：1.染色：取试管一支，用毛细管或枪头于其中加入染液2～5滴，然后再加入新鲜血液1滴轻摇混合，染色10～15min。
2.制片：取载物片一片，用毛细管或枪头吸取血液染色液1小滴于载物片上，并用推片约45度角推制成舌型血膜片，自然干燥备用。
3.观察：用显微镜观察，取血膜片滴入香柏油1滴，将血膜片置于显微镜载物台，用油镜观察网织红细胞。
4.计数：取计数器在油镜下检查计数红细胞，即计数红细胞中网织红细胞的数量，检查计数1000个红细胞中网织红细胞的数量，并得出千分率再除以10即为百分率。
计算公式：百分率=1000个红细胞中网织红细胞的数量/1000注意事项：1.载物片使用前必须经过酸或碱液浸泡脱脂处理后方可使用。
2.血膜片制备需要反复练推片，熟练推制血膜片的技巧。
3.血膜片的厚薄要适中，过厚或过薄均无法进行观察。
4.室温过低时，血液染色时间要适当延长，以确保细胞着色更充分。
5.血膜片需在3天内检查计数，否则其网状结构会褪色，不易观察清晰。
10-网织红细胞计数
10-网织红细胞计数B D I S R et i c-C O U N T（Thi azol e O r ange）Catalog No. 349204简介早期红细胞细胞核丢失后，胞浆内仍残留有细胞器（如核糖体、线粒体），这样的早期红细胞就是网织红细胞，它有别于不含细胞器的成熟红细胞。
这些细胞器富含核酸物质（RNA和DNA），而在成熟红细胞中不含有此种物质。
正常人（非贫血者）中，网织红细胞在骨髓中三天成熟，第四天出现在外周循环血中。
网织红细胞计数可以评估红细胞造血系统活性，但是如果网织红细胞的骨髓成熟时间缩短而循环血成熟时间延长，这种评估方法就会有误差。
这时，外周血相中一至三天的网织红细胞（“漂移”网织红细胞）也会被当做第四天网织红细胞而计算在内。
如遇此种情况，应当对“漂移”网织红细胞做修正（修正公式见流式细胞仪分析一节）。
BD公司生产的Retic-COUNT试剂主要成分为噻唑橙（TO），与丫啶橙（AO）的作用类似。
TO 与DNA碱基对以1:2的比例结合，分解常数、正电荷数和膜通透性与AO相近。
Retic-COUNT试剂既可与DNA结合，也可与RAN结合，形成的荧光-核酸复合物，吸收光谱为475nm，荧光发射光谱为530nm，因此，适合在安装了488nm激光的流式细胞仪上使用，如FACSCalibur，FACSort，FACScan等。
网织红细胞计数的传统方法是使用新亚甲基蓝染料，染色涂片后，光镜下计数。
但此方法费时，且由于只计数1000个细胞，因而存在固有的取样误差。
使用Retic-COUNT流式细胞术方法进行网织红细胞计数，与传统的新亚甲基蓝方法相比，存在很多优势。
使用流式细胞术，可以检测上万个细胞，具有很好的取样精确性。
由于使用的是细胞悬液，可以消除涂片时的分布误差。
同时，它还具有省时、操作简便等优点。
另外，由于可以使用配套的Retic-COUNT自动软件，不需要做阴性对照，还可以减少操作的变异性。
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一、实验原理
网 织 红 细 胞 胞 浆 内 残 存 有 嗜 碱 性 的 RNA 物质，经煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染色后 RNA中负电荷基团与带正电荷的有色基团结 合，凝聚成颗粒呈浅蓝或蓝黑色的点状、丝状 或网状结构，可在显微镜下识别。计数1000 个红细胞中所有的网织红细胞数直接报告其百 分比，或×红细胞计数结果报告其绝对值。
3香柏油转换至油 镜，在Miller窥盘下计数小方格中的RBC数和大方 格中的网织红细胞数（或数出整个视野中的RBC 总数和其中的网织红细胞数，换一视野同法计数至 几个视野RBC总数>1000为止）。
Miller窥盘
将Miller窥盘放在显 微镜目镜中,通过窥盘 中大小方格间的9比1 比例关系计算RBC数和 Ret数。
B1
3
A
四、计算
ler窥盘法：网织红细胞（Retic） 百分率(%)= （大方格内Retic总数） /（小方格内RBC总数×9）×100%
2.直接计数法：网织红细胞（Retic）百 分率(%)= 多个视野内Retic总数/多 个视野内RBC总数×100%
五、注意事项
1.用酒精染液时，应待玻璃片上的酒精挥发干燥 后，才能加血液，染色时应用推片角不停搅动， 使染料和血液混合，防止凝固。
三、操作步骤
1. 染色：于载玻片的一端加煌焦油蓝酒精溶液1滴， 任其自然凉干后备用，取末梢血或抗凝血一滴，于 已干燥的染料上，用推片角混匀后，将两玻片盖合 （玻片法）；试管法取染液2滴入试管，加血2滴 混匀，封闭好，待15分钟以上时间，
2. 推片：取混合液1小滴于载玻片的一端，推制成薄 而均匀的血膜，
2.染色时间一定要充足，混合后不能立即推片， 室温低时染色时间应适当延长，应覆以另一玻 片防止蒸发。
3.染液与血液比例以1：1为宜，贫血适当加血量。 4.涂片厚薄均匀适宜，弓形移动，多个区域计数 5.试剂应定期重配，以免变质沉淀。 6.与变性珠蛋白小体鉴别
六、参考值
成人：0.005-0.015（0.5%-1.5%） 新生儿：0.02-0.06（2%-6%） 儿童：0.005-0.075（0.5%-7.5%） 成人绝对值（24-84） 109/L
网织红细胞（Ret）
是晚幼红细胞脱核后到成熟红细胞间 的过渡细胞，是尚未完全成熟的红细胞， 其 胞 浆 内 残 存 有 嗜 碱 性 的 RNA 物 质 。 嗜 碱性物质与染料凝聚成蓝色颗粒，颗粒与 颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。
分型：丝球型、网型、破网型、点粒型。 （Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型）
网织红细胞
感谢下 载
骨髓移植、EPO治疗后：若骨髓开始恢复造 血功能，RMI升高，网织红细胞计数值上升。
（3）放、化疗监测
机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制， 早期HFR和MFR降低，然后才检测到网织 红细胞的降低。而停止放、化疗，骨髓功 能恢复后，又见上述指标依次上升。可指 导临床医师适时调整治疗方案，避免造成 严重的骨髓抑制。
计数方法
1、普通光学显微镜法：活 体染色后推片镜检
2、网织细胞计数仪法：荧 光染色后用流式细胞术计数
二、试剂器材
1、试剂 10g/L煌焦油蓝酒精（水）溶液
2、器材 毛细血管采血用具、小试管、 载玻片、推片、显微镜、香柏油、二甲 苯及擦镜纸、Miller窥盘或直径约20 mm （较目镜内径稍小）的圆形硬纸片（正 中央开一边长为3mm的菱形或正方形小 孔，置目镜光阑处，用于缩视野法计数）
网织红生成指数（Reticulocyte production index,RPI）
• RPI=病人网织红细胞（%）/2 * 病人HCT/正常
人HCT（男0.45，女0.40）
• 临床应用： • ＞3提示溶血性贫血或急性失血性贫血；
八、思考题
一溶血性贫血患者，红细胞计数 2.6x1012/L，血细胞比容0.29，网织红细 胞计数相对值为35%，如何报告网织红 细胞检测结果？
七、临床意义
（1）评价骨髓增生能力，判断贫血类型
再障时，明显降低。绝对值低于5×109/L可 做为急性再障的辅助诊断指标。
失血、多数溶血性贫血患者网织红细胞可明 显高于正常。
营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持 正常、轻度升高或降低。
（2）评价疗效
网织红细胞反应：IDA或巨幼细胞贫血分别 给予铁剂、维生素B12或叶酸治疗2~3d后，网织 红细胞计数值开始上升，7~10d达到最高(10% 左右)；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、 血红蛋白开始升高。