结核杆菌特异性细胞免疫反应监测
结核菌素试验的原理
结核菌素试验的原理结核菌素试验是一种用于检测结核病的常规诊断方法，也被称为结核菌素皮内试验。
它是通过皮内注射结核菌素制剂，观察患者在注射后48-72小时内是否产生局部的皮肤反应来判断结核菌感染的一种方法。
结核菌素试验的原理主要是基于人体对结核菌素的过敏反应。
结核菌素是一种由结核分枝杆菌制备的蛋白质衍生物，其主要成分为结核分枝杆菌抗原。
当人体感染结核分枝杆菌后，免疫系统会产生特异性的细胞免疫应答，包括T细胞介导的细胞免疫和B细胞介导的体液免疫。
在结核分枝杆菌感染后，机体内的T淋巴细胞会对结核菌素产生超敏反应，导致注射结核菌素后，感染者的皮肤在注射部位出现明显的局部红肿和硬结。
结核菌素试验的结果是根据患者注射后48-72小时内皮肤反应的大小来判断的。
通常来说，如果患者对结核菌素有过敏反应，注射部位会出现直径大于5mm的硬结或红肿，这被认为是阳性反应，提示患者可能感染了结核分枝杆菌。
而如果注射部位没有出现硬结或红肿，或者出现的反应小于5mm，这被认为是阴性反应，提示患者可能未感染结核分枝杆菌。
结核菌素试验的原理基于人体的免疫反应机制，因此具有一定的特异性和敏感性。
但需要注意的是，结核菌素试验只能判断患者是否感染了结核分枝杆菌，而不能确定患者是否患有活动性的结核病。
因此，在临床实践中，结核菌素试验通常需要结合其他临床检查和病史资料来进行综合判断。
总之，结核菌素试验是一种简便、安全、可靠的结核病诊断方法，其原理是基于人体对结核菌素的过敏反应。
通过观察注射后48-72小时内的皮肤反应大小，可以初步判断患者是否感染了结核分枝杆菌。
结核菌素试验在结核病的早期诊断和流行病学调查中具有重要的意义，但在临床实践中需要综合考虑患者的临床表现和其他检查结果来进行综合判断。
QuantiFERON-TB Gold试验诊断活动性肺结核的价值
近年来，结核病仍然是一个重要的公共卫生问题，它位居全球死亡原因第9位，是死亡人数最多的单一传染病，2016年，大约1040万人发病，其中56%发生在印度、印度尼西亚、中国、菲律宾和巴基斯坦[1]。
为有效防控结核病流行，早期诊治活动性肺结核病显得尤为重要。
目前虽然可以联合临床表现和影像学、病理学及微生物学检查诊断结核病，但在早期判断是否为活动性肺结核仍很困难。
痰培养和痰涂片方法检测结核杆菌的阳性率低，通过检测宿主对结核杆菌特异性免疫反应的技术已广泛应用于临床检验，包括结核菌素试验和γ-干扰素释放试验[2-3]。
接种过卡介苗或发生非结核分枝杆菌感染，均会降低结核菌素试验的特异性，而免疫功能不全则会降低结核菌素试验的敏感性，这均降低了结核菌素试验的诊断价值。
结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测(QuantiFERON-TB Gold)(以下简称QFT)属于γ-干扰素释放实验中的一种[4]。
2017年1-10月收治疑似结核患者163例，评估QFT 试验在活动性肺结核患者中的诊断价值。
资料与方法2017年1-10月收治疑似结核患者163例，男124例，女39例；平均年龄(32±14)岁。
以上患者HIV 抗体均为阴性，均未进行过抗结核治疗，未使用免疫抑制剂且无严重肝肾功能损害。
诊断标准及分组情况：根据肺结核诊断标准(WS 288-2008)对患者进行诊断：肺结核的诊断是以细菌学实验室检查为主，结合胸部影像学、流行病学和临床表现、必要的辅助检查及鉴别诊断，进行综合分析作出的。
其中若痰涂片找抗酸杆菌阳性，则为涂阳肺结核组；若痰涂片找抗酸杆菌阴性，则为涂阴肺结核组。
非肺结核组，经正规抗感染治疗2周复查胸部CT 病灶吸收者。
试验方法：163例患者均进行3次痰涂片找抗酸杆菌检查，QFT 检测，CT 检查。
QFT 检测方法：取患者静脉血6mL 至肝素抗凝管按QFT 检测试剂盒操作规范进行。
统计学方法：采用SPSS 17.0统计学软件分析数据。
结核分枝杆菌特异性细胞因子(IFN-γ、IL-2)联合检测在肺外结核诊断中的临床价值
结核分枝杆菌特异性细胞因子 (IFN-γ、IL-2)联合检测在肺外结核诊断中的临床价值【摘要】目的：分析结核分枝杆菌特异性细胞因子(IFN-γ、IL-2)联合检测（双因子检测）在肺外结核诊断中的临床应用价值。
方法：对本院2020年11月-2021年9月入院的63例临床诊断为肺外结核的患者以及52例非结核患者进行双因子联合检测、 -干扰素释放试验（T-spot检测）以及PPD检测，对结果进行分析。
结果：对入组的115例患者行双因子联合检测、T-spot检测及PPD检测，对检测结果进行分析得，双因子并联检测、串联检测、T-spot检测和PPD检测灵敏度分别为95.2%、84.1%、93.7%和95.2%；双因子并联检测、串联检测、T-spot检测和PPD检测特异性分别为94.2%、100.0%、98.1%和40.4%。
双因子并联检测灵敏度高于T-spot检测，串联检测特异性高于T-spot检测和PPD检测。
结论：在肺外结核的诊断中，双因子并联检测的灵敏度高于T-spot检测，使用双阳性为阳性指标的串联检测的特异性高于T=spot和PPD检测。
双因子检测在传统 -干扰素释放试验基础上增加了对IL-2的检测，实现了对肺外结核感染的特异性检出，在肺外结核的诊断上有非常重要的临床价值。
【关键词】肺外结核，IFN-γ，IL-2，双因子结核病是全世界十大死亡原因之一，根据2020年WHO发布的全球结核病报告显示，中国作为全球的30个结核病高负担国家之一，2019年结核病发病率为58/10万人，且新发患者数达到83.3万1,2, 其中很大一部分是肺外结核的患者，相比于肺内结核这一部分患者极易被忽略，是不可忽视的结核病传染源。
目前临床上有关肺外结核的诊断方式大多具有一定的局限性。
主要诊断方式包括患者患处组织以及穿刺物的抗酸染色以及结核分枝杆菌培养，结核菌素试验，针对结核分枝杆菌的抗体检测法，荧光定量PCR法，和γ干扰素释放试验等3-7。
结核杆菌特异性细胞免疫反应检测项目
检验时间：
每周一至周四抽血，周五中午之前出结果，周五不要抽血送检
开立方法：
结核杆菌特异性细胞免疫反应检测”拼音码JHGJXBMY，收费800/次。
临床意义及检验原理：
机体感染结核杆菌后，血液中的记忆性淋巴细胞会在再次接触结核杆菌特异性抗原时，产生T -干扰素。
应用基因工程技术将相应蛋白修饰后表达为结核杆菌特异性抗原，刺激全血，血液中会产生特异性T -干扰素，采用酶联免疫法检测丫-T扰素，可据此判断机体是否存在针对结核杆菌特异性的细胞免疫反应。
标本采集要求及注意事项：
1. 无菌采集新鲜肝素（绿管）抗凝静脉血至少3mL。
2. 溶血或乳糜血通常不会影响实验结果。
3. 黄疸样本不能用丁测定。
4. 不要使用微生物污染的样本。
5. 大环内酯类免疫抑制剂FK506患者的样本不适合用此试剂盒检测。
6. 采血后要及时送检。
分离的血浆样本可存丁2-8 C放置，在2周内使用。
结果判读：
N （阴性对照）、P （阳性对照）、T （检测）
当NR 0.5IU时，（T-N）/ （P-N）>0.60时判为阳性，否则为阴性；当
N >0.5IU时，（T-N） / （P-N）>0.85时判为阳性，否则为阴性；
方法的限制因素：
此方法不适用丁区分潜伏性感染和活动性活动性结核，不适用丁判断结核病
的严重程度或疾病进展情况。
结核感染T细胞检测
T-SPOT.TB高灵敏度
种类
活动性结核/ 灵敏度
内容摘要
将T-SPOT.TB的检测结果与最后通过涂片和培养确诊的结 果进行比较。包括牛型结核杆菌和非洲型结核杆菌感染的 患者。T-SPOT.TB的灵敏度为97.2%。（CI 90.3-99.7%）
在经培养确诊的活动性结核患者中，T-SPOT.TB的灵敏度 为94%。
87
Lee et al.
ERJ 2006; 28:24–30
30
Clark et al. Clin. Exp.
Imm.
2007; 150(2):238-44
140
Kang et al Chest.
2007 Sep;132(3):959-65
抗原刺激后分泌γ 干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。 检测外周血中受结核特异抗原刺激释放γ 干扰素的T淋巴
细胞，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统 对斑点进行计数，1个斑点代表一个分泌细胞，计算出抗 原特异性细胞的频率。
空白对照孔内斑点数小于10且阳性对照孔内斑点数 大于20时视为试验有效
Immunol 2008; 15;168-
71
T-SPOT.TB高特异性 检测所用的ESAT-6＆CFP 10抗原均来自结核
分枝杆菌基因组RD1区域，RD1区基因仅存在于结 核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）。 卡介苗和大多数环境分枝杆菌缺失RD1区基因 因此 T-SPOT.TB不会受卡介苗或者非结核分枝杆 菌影响。
32
Kim et al. Arch Intern
Med.
T-SPOT与结核菌素实验对结核病患者的临床诊断价值分析
T-SPOT与结核菌素实验对结核病患者的临床诊断价值分析李磊;孙超;曲德鑫;刘福奎;马彦【摘要】目的分析T-SPOT与结核菌素实验对结核病患者的临床价值.方法选取2015年12月～2017年12月疑似结核病患者202例,经过实验组织学检验100例患者确诊为结核病患者,进行外周血T-SPOT检测和结核菌素实验,比较两组患者诊断结果.结果以最终实验组织学检验为金标准,T-SPOT阳性检出率明显优于结核菌素检出率,差异具有统计学意义(P＜0.05),T-SPOT监测灵敏度、特异度、准确度均优于结核菌素实验,差异具有统计学意义(P＜0.05),T-SPOT检测Kappa值为0.985,说明一致性良好,结核菌素实验检测Kappa值为0.512,说明两者一致性中等.结论利用T-SPOT诊断结核病患者,敏感度高且特异性明显,对结核和肺外结核都有很好的应用价值,值得推广应用.【期刊名称】《口岸卫生控制》【年(卷),期】2019(024)001【总页数】3页(P14-15,19)【关键词】结核菌素实验;外周血T-SPOT检测;诊断【作者】李磊;孙超;曲德鑫;刘福奎;马彦【作者单位】烟台国际旅行卫生保健中心山东,烟台,264000;烟台国际旅行卫生保健中心山东,烟台,264000;烟台国际旅行卫生保健中心山东,烟台,264000;烟台国际旅行卫生保健中心山东,烟台,264000;中国人民解放军第一○七医院山东,烟台,264000【正文语种】中文【中图分类】R52世界卫生组织公布危害人类健康的传染病之一是结核病，是危害身体健康的潜在危险因素［1］。
目前，随着空气污染日益严重，结核病患者人数也逐年递增，如何快速准确的诊断结核病一直是医学领域关注的问题。
传统的结核菌素皮肤实验，受到卡介苗接种的局限作用，诊断敏感度、特异性不高，不能广泛应用。
目前，以T 细胞为免疫基础的体外干扰素释放实验在检测结核杆菌的过程中，具有良好的特异性和灵敏度，诊断正确率较高。
结核分枝杆菌特异性细胞因子（INF-γ、IL-2）联合检测在结核病诊断中及预后的应用价值分析
结核分枝杆菌特异性细胞因子（INF-γ、IL-2）联合检测在结核病诊断中及预后的应用价值分析【摘要】目的：分析结核分枝杆菌特异性细胞因子（INF-γ、IL-2）联合检测在结核病诊断中及预后结核患者的诊断价值。
方法：连续收集广州市胸科医院2021年6月-2021年12月共151例，其中103例结核患者，48例非结核患者，统计分析两组患者检测双因子的结果。
结果：对151例患者进行双因子检测，并联检测、串联检测的灵敏度分别为92.2%和81.6%；并联检测、串联检测的特异度分别为91.7%和100%；并联检测、串联检测的临床符合率分别为92.1%和84.8%；30例结核患者在停药3个月后IFN-γ和IL-2的平均表达水平有明显下降趋势。
结论：双因子联合检测具有极高的灵敏度、特异度和临床符合率，在结核病的诊断上有非常重要的临床价值；IFN-γ和IL-2的表达水平在预后结核患者的监测上有着很好的应用价值。
【关键词】结核分枝杆菌；IFN-γ；IL-2；双因子结核病是一种由结核分枝杆菌感染引起的传染性疾病。
中国是结核病高负担国家，2020年结核病发病率为59/10万，新发患者数目达84.2万[1]。
目前临床上对于预后患者的诊断方式具有一定的局限性，主要诊断方式为患者痰样本的抗酸染色以及结核分枝杆菌培养，因此一种方便快速，准确高效地判断预后患者的康复情况的方法是目前临床上十分迫切的。
近年来γ干扰素释放试验在各临床中心开展应用，其作为新型免疫学诊断方法，已被用于结核病的辅助诊断中[2]。
本研究将使用该试剂盒，研究结核特异性IFN-γ、IL-2联合检测对结核病诊断以及监测预后结核患者的应用价值。
1材料与方法1.1研究对象选择2021年6月至2021年12月广州市胸科医院收治的151例患者为研究对象，根据诊断结果将患者分为结核组和非结核组。
其中结核组103例，平均年龄36.7年；非结核组48例，平均年龄53.6岁。
1.2研究方法采集患者外周静脉血（每份不少于4mL）加入等体积RPMI-1640混匀后，以2：1加入到淋巴细胞分离液上层，室温梯度离心后吸取单个核细胞（PBMCs），计数后，将结核特异性融合蛋白与PBMC细胞37℃共培养16-20小时。
关于开展结核特异性细胞因子IFN-γ和IL-2联合检测的可行性报告
关于开展“结核特异性细胞因子IFN-γ和IL-2联合检测”项目可行性报告××医院×年×月×日目录一、项目背景介绍 (3)（一）结核病的现状 (3)（二）我国结核病临床诊断的痛点、难点 (3)（三）现有结核病诊断技术的优缺点 (5)二、项目的国内外研究进展 (6)（一）细胞因子IFN-γ、IL-2可作为“结核病辅助诊断”标志物 (6)（二）IL-2的联合检测，有助于弥补IGRA技术的不足 (6)三、项目开展的临床价值 (8)四、双因子试剂盒简介 (11)五、同类产品比较分析 (13)六、项目开展的效益分析 (15)七、项目开展的实验室设备要求 (16)八、迪澳生物简介 (17)九、参考文献 (18)一、项目背景介绍（一）结核病的现状结核病是一种严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病，其病原体是结核分枝杆菌，是人类所知的最古老的一种传染病。
当结核病患者将细菌排入空气时，结核分枝杆菌就会传播，例如通过咳嗽等。
该疾病通常累及肺部（肺结核），但也可累及其他部位（肺外结核病）。
近10年来，由于高感染人群和高危人群的流动、结核杆菌耐药菌株的出现、卡介苗免疫效果偏低以及人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的蔓延等原因，结核病以极其迅猛的势头再次肆虐全球。
据世界卫生组织（WHO）《2020年全球结核病报告》显示，全球结核潜伏感染人群接近20亿。
2019年，全球新发结核病患者约996万，约有121万人死于结核病。
而我国结核病的流行形势亦非常严峻，我国是全球30个结核病高负担国家之一，位居全球第3位，每年新报告肺结核患者约83.3万例，位居甲乙类传染病第2位。
结核病的传染主要是发生在病人未被发现并进行治疗之前，1名结核病患者平均可传染15人，而目前全球普遍存在结核病诊断不足以及病例低报等现象。
为进一步遏制结核病流行，推进健康中国建设，2019年5月国家卫生健康委、国家发展改革委、教育部、科技部、民政部、财政部、国务院扶贫办和国家医保局联合制定了《遏制结核病行动计划（2019—2022 年）》，并指出：结核病的早期快速诊断是预防和控制结核病蔓延的关键。
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2021/1/12
4
全球现有的三个IGRA产品
T.SPOT-TB ✓ 细胞IGRA；
QuantiFERON TB Gold (in tube)：简称 QFT-IT ✓ 全血IGRA； ✓ 尚未获得中国SFDA批准进入中国；
A.TB：国内第一家 ✓ 全血IGRA；
2021/1/12
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结核杆菌特异性细胞免疫反应检测
2011年7月6日，获中华人民共和国食品药品监督管理局（SFDA）批准上市
生 产 企 业： 海口维瑅瑷生物研究院
注 册 号： 国食药监械（准）字2011第3400801；
产品标准编号： YZB/国 2442-2011，
项 目 类 别： 体外三类诊断试剂
2021/1/12
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原理与技术背景
• γ-干扰素释放实验（IGRA） （IGRA，interferon- gamma release assay）
2021/1/12
2
结核病诊断和辅助诊断方法现状
影像学方法：特异性较差，与医师的经验有关，主观性强。 培养：结核病诊断金标准，敏感性为30-50%且耗时2-8周； 抗酸染色法（俗称涂片）：敏感性为30-40%； 血清结核抗体定性检测：敏感性在0-100%，特异性约为47-100%； 分子诊断方法（如PCR）：重复性较差，需要痰标本； 结核菌素试验（TST）：受卡介苗干扰，特异性差，在肺结核病人中存在1025%的假阴性。
备注：T 值体现的是机体内T淋巴细胞对结核杆菌特异性抗原刺激的反应 患者样本经结核分枝杆菌RD1区编码的全抗原刺激后，特异性释放的γ-干扰素水平
为 2.34 IU/ml；非特异释放的γ-干扰素水平为 9.86 IU/ml；两者的比值为： 0.24 ；
是否为活动性结核，请结合临床进行判断。
2021/1/12
• 酶联免疫技术（ELISA） （ELISA，Enzyme-Linked ImmunoAssay）
• 结核杆菌特异抗原 早期抗原靶6（ESAT-6） early secreted antigenic target 6 培养滤液蛋白10（CFP 10） （culture filtrate protein 10果解释
2021/1/12
2
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A.TB临床性能指标
国内临床数据——1085 例样本
● 试验组 472 例：
菌阳结核 菌阴结核
● 对照组 613 例：
健康志愿者 非结核其它肺部疾病
2021/1/12
10
临床诊断性能
诊断性能指标 敏感性 特异性 准确度
阳性预测值 阴性预测值 阳性似然比 阴性似然比
结果（95%CI） 83.3%[79.9%-86.7%] 85.6%[82.8%-88.4%] 84.6%[82.5%-86.7%] 81.7%[78.2%-85.2%] 86.9%[84.2%-89.6%]
2021/1/12
3
-干扰素释放分析技术 （Interferon-gamma Release Assay,简称IGRA）
应用现状： IGRA技术是国际最新的用于结核杆菌感染的体外免疫诊断方法； 在北美、欧洲和日本已被广泛应用于结核杆菌感染的检测，包括
➢结核病辅助诊断； ➢高危人群筛查； ➢公共卫生突发事件； ➢健康人群体检等； 美国和日本已经将该技术写入该国用于结核防治的指导原则中。
5.8[4.8-7.1] 0.2[0.16-0.24]
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11
A.TB临床诊断数据-2
疾病类型
艾滋病感染者合并活动性结核 糖尿病合并活动性结核 类风湿合并活动性结核
结核性胸膜炎同时服用免疫抑制剂 合计
例数
8 13 5 9 35
A.TB
阳性
阴性
8(100%)
0(0%)
12(92.3%) 4(80%)
Proteosome 蛋白酶体
exocytosis
抗原呈递细胞
结核杆菌特异 性T细胞
-干扰素
2021/1/12
8
产品特点
高灵敏度
○ 结核感染引起的细胞免疫反应早于细菌学及影像学表现； ○ 无需带菌标本，适用于“菌阴肺结核”及“肺外结核” 的鉴别 ○ 受个体免疫功能低下影响小；
高特异性 不受卡介苗与绝大多数环境非结核分枝杆菌影响 安全快速 只需患者提供 3ml 静脉全血，次日可出报告
1(7.7%) 1(20%)
7(77.8%) 31(88.6%)
2(22.2%) 4(11.4%)
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样本要求
1. 新鲜采集的肝素钠抗凝全血 2. 每份样本不得少于3 ml 3. 样本常温（15-25℃）保存，不得冷冻或冷藏 4. 样本采集后 16 小时内进行前处理（抗原刺激）
2021/1/12
13
A.TBTM 操作过程
第一步：样本的刺激
16小时内运输 常温
样本采集：3ml新鲜全 血，肝素钠抗凝
NP T
37 ℃
阴性 阳性 A.TB 刺激剂 刺激剂 刺激剂
样本的刺激和孵育
37 ℃ 22-24小时
第二步：ELISA定量IFN-γ
约3小时
0.5小时
NPT
血浆收获
标准曲线制备、 样品检测
450nm读数
2021/1/12
7
γ-干扰素释放实验（IGRA）
基本原理1
机体感染结核杆菌后产生的T淋巴细胞在体外受到特异性抗 原刺激时会释放γ-干扰素，通过对 γ-干扰素的定量分析可判 断是否具有结核杆菌的特异性T细胞反应。
LFnESAT6 / LFnCFP10
脱毒的炭疽毒素致死因子片段LFn，可以起到分子 注射器的作用
结核杆菌特异性细胞免疫反应监测
结核病疫情
感染人数：全球人口的1/3，中国的感染率为44.5%；感染者 一生中会有约10%的风险发展成为结核病； 年新发病例数：
✓全球每年报告新病例约800-1000 万； ✓中国每年报告新病例约150万； 死亡人数：全球每年死亡病例约300万；其中中国约13万； 中国是全球22个结核病高负担国家之一。
2021/1/12
14
A.TBTM 报告单
姓名
年龄
性别
ID号
科别
诊断
样本
样本号
检测项目
测定结果 单位
混合淋巴细胞培养 + 干扰素（P） 9.86 混合淋巴细胞培养 + 干扰素（T） 2.34
IU/ml IU/ml
计算公式 参考范围 提示 T/P
0.24 ＜ 0.6 阴性（-）
N值体现的是机体的本底干扰素水平 P 值体现的是整体的机体免疫水平是否正常