细胞转染
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧细胞转染是一种将外源DNA、RNA、蛋白质等分子导入到细胞内的实验技术。
这种技术可以用来研究基因功能、发现新的信号通路和治疗基因疾病等。
下面将介绍细胞转染的原理、操作步骤以及一些小技巧。
一、细胞转染的原理：细胞转染主要通过三种方法实现：物理法、化学法和生物学法。
1.物理法：通过高压、电穿孔、微射流等方式，使细胞膜发生瞬时破裂，从而使DNA、RNA等外源分子进入细胞。
常用的物理法有电穿孔法和基因枪法。
2.化学法：通过化学物质，如聚吡咯、脂质体等，使外源分子与细胞膜结合，从而实现转染。
常用的化学法有聚乙烯亚胺（PEI）法、磷酸钙共沉淀法等。
3.生物学法：通过利用病毒载体将外源基因导入目标细胞，实现基因的转移。
常用的生物学法有腺相关病毒（AAV）转染、逆转录病毒（RETRO）转染等。
二、细胞转染的操作步骤：1.细胞的预处理：根据细胞类型和实验要求，将细胞培养至合适的状态。
通常细胞应处于快速生长期，但还未达到接触抑制的阶段。
对于一些特定的细胞，如悬浮细胞，可能需要将其转接至适当的培养基中。
2.外源分子的准备：将外源DNA、RNA等转染载体制备好。
如将DNA克隆并纯化至高质量的质粒DNA，或将RNA合成或纯化。
根据实验要求选择合适的转染载体。
3.转染方法的选择：根据实验要求选择合适的转染方法，如物理法、化学法或生物学法。
一般情况下，物理法适用于悬浮细胞，化学法适用于贴壁细胞，而生物学法适用于大多数细胞类型。
4.细胞转染操作：a.物理法：i.电穿孔法：将细胞悬浮于含有外源分子的缓冲液中，然后通过电穿孔仪的电极或电穿孔板进行电穿孔。
ii. 基因枪法：使用基因枪将外源分子直接“枪”入目标细胞中。
b.化学法：i.PEI法：将PEI与外源DNA或RNA按一定比例混合，在适当条件下形成复合物，然后添加至目标细胞中。
ii. 磷酸钙共沉淀法：将外源DNA与磷酸钙按比例混合，并静置形成磷酸钙- DNA沉淀，然后加入至目标细胞中。
常规细胞转染过程和常见问题
实验过程（以24孔板为例）
1.提前一天细胞铺板
提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞密度在60％左右为宜。
2.转染过程
⑴将0.8μg的DNA用25μl无血清稀释液稀释，充分混匀，制成DNA稀释液。
注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。
⑵将2μl的Entranster TM试剂用25μl无血清稀释液体稀释，充分混匀，制成
Entranster TM试剂稀释液。
室温静置5分钟。
⑶将Entranster TM试剂稀释液分别加入到DNA稀释液中，充分混匀（可用振
荡器振荡或用加样器吹吸10次以上），室温静置15分钟。
转染复合物制备完成。
⑷将转染复合物加入到含细胞和完全培养基的培养容器上，轻柔混匀。
注意：①转染试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。
②完全培养基可加抗生素。
⑸培养4-6小时后更换培养基，继续培养24-48小时。
注意：①如细胞没有毒性等不良情况，转染后4-6小时可不必更换培养基。
注意：如用于同时共转染多种质粒，DNA的用量指每种质粒用量的总和，这时如需得到较高转染效率，建议将DNA的用量和转染试剂的用量同步提高1.5-2倍。
常见问题与解决方案。
细胞转染的技巧
细胞转染的技巧细胞转染是研究细胞分子生物学的关键技术之一，广泛应用于基因表达、基因敲除和功能分析等领域。
本文将详细介绍细胞转染的原理、方法和优化技巧。
细胞转染的原理主要基于外源DNA的纳入细胞内，并表达目的基因。
目前常用的转染方法包括化学法、电穿孔法、病毒介导法和基因枪法等。
一、化学法化学法是最常用的细胞转染方法之一，其基本原理是通过化学试剂破坏细胞膜屏障，使外源DNA能够进入细胞内。
常用的转染试剂包括聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）、脂质体和阳离子聚合物等。
在化学转染过程中，需要注意以下几个关键环节：1. 细胞密度：化学转染对细胞密度有一定的要求，通常细胞密度应保持在80%~90%的对数生长期，以保证转染效果。
2. 转染试剂的浓度和比例：不同的转染试剂适用于不同的细胞系，需要根据实验需求进行优化。
一般情况下，转染试剂的浓度和DNA的比例为1:3~6。
3. 转染时间和转染条件：化学转染的时间和条件也需要进行优化。
过短的转染时间会导致转染效率低，而过长的转染时间可能会对细胞造成毒性影响。
二、电穿孔法电穿孔法通过电场脉冲的作用使细胞膜发生短暂的孔洞形成，从而实现外源DNA的转染。
电穿孔法具有转染效率高、转染速度快等优点，但对细胞需求较高，且操作较为繁琐。
在电穿孔转染过程中，需要注意以下几个环节：1. 电脉冲的参数：电脉冲参数包括电压、脉冲宽度和脉冲数等，需要根据细胞类型和实验需求进行优化。
2. 转染缓冲液的配方：转染缓冲液通常包含含有机磷盐的缓冲液或无机盐溶液，可用于增加细胞的导电性和缓解电穿孔过程中对细胞的损伤。
3. 转染后的细胞培养：电穿孔转染后，应及时将细胞转移到无血清培养基中，以减少电穿孔对细胞的影响。
三、病毒介导法病毒介导法是一种高效、稳定的转染方法，常用于长期表达和基因敲除实验。
病毒载体（如腺病毒、逆转录病毒等）可携带外源DNA进入细胞并整合到基因组中，从而实现目的基因的表达。
细胞转染操作方法
细胞转染操作方法一、细胞转染简介细胞转染是指将外源性DNA、RNA、蛋白质等分子通过物理或化学手段导入到细胞内，从而改变细胞的基因表达或功能。
常见的细胞转染方法包括病毒载体介导转染、电穿孔法、钙磷共沉淀法和化学转染法等。
其中，化学转染法是最为常用的方法之一，因为它具有操作简便、成本低廉和适用于多种类型的细胞等优点。
二、实验前准备1. 细胞培养：选择适当的培养基和培养条件，使得细胞处于生长状态。
2. 转染试剂：选择合适的化学转染试剂，如Lipofectamine 2000、PolyJet等。
3. 质粒DNA：准备所需的质粒DNA，并进行纯化和测定浓度。
4. 培养皿：准备适当大小和形状的培养皿，以满足实验需要。
5. 显微镜：准备显微镜以观察细胞转染效果。
三、实验步骤1. 细胞接种：将需要转染的细胞接种到培养皿中，使其达到适当的生长状态。
2. 质粒DNA和化学转染试剂混合：根据试剂说明书的建议，将质粒DNA和化学转染试剂混合，形成转染复合物。
3. 转染复合物与细胞接触：将转染复合物滴加到培养皿中，让其与细胞接触。
4. 培养：将培养皿放入恰当的培养箱中，并按照所选细胞类型的要求进行培养。
5. 观察效果：经过适当时间后，使用显微镜观察细胞转染效果。
若需要，可以通过Western blot、PCR等方法进行进一步验证。
四、注意事项1. 选择适当的化学转染试剂，并按照说明书建议操作。
2. 转染前需要保证质粒DNA纯度和浓度足够，并进行必要的测定。
3. 细胞密度和培养时间应根据所选细胞类型进行调整。
4. 转染复合物与细胞接触时间不宜过长或过短，一般在4-6小时左右。
5. 培养过程中需要注意细胞状态的变化，并根据需要进行适当的处理。
五、实验结果解读通过细胞转染操作，可以实现外源性DNA、RNA、蛋白质等分子的导入，从而改变细胞的基因表达或功能。
实验结果可以通过Western blot、PCR等方法进行进一步验证。
质粒转化、细胞转染步骤
质粒转化、细胞转染步骤
转化是指将外源DNA（常以质粒作为载体）导入受体细
胞（如大肠杆菌），从而使其获得新的遗传特性。
具体步骤如下：首先将12ul的质粒DNA加入50ul感受态cell中，轻柔混合后进行冰浴30min。
接着向管中加入培养基，混匀后使细菌
恢复正常生长状态。
然后在42℃下热激90s，迅速冰浴2min，最后在37℃下震荡培养（﹤225rpm）1h，使细菌获得新的遗
传特性。
转染（n）是将含有目的基因的载体转移到真核细胞内的
过程。
在进行质粒转染时，需要先将6-well-plate中的每个孔
培养至60-70%的状态。
然后在接种时每个孔加入2.5×105个
/ml的细胞。
接下来，将2.5ug质粒DNA和200ul的opti-
MEM混合，再加入6ul的转染液进行混匀，并在室温下静置
15min。
待转染细胞换成1.3ml的opti-MEM培养基后，将转
染复合物（200ul）轻轻均匀滴入细胞培养基中，并十字形摇
晃6-well-plate以混匀转染复合物。
最后将6-well-plate放入37℃、CO2培养箱中进行培养。
细胞转染
• •
•
尽管转染效率因细胞类型的不同而异，在104个转染 细胞中只有大约一个细胞可以稳定整合DNA (不论使用 的是线性还是环状DNA)。 没有一种方法可以适用于所有细胞和所有实验。必须 根据您的细胞类型和实验要求选择理想的方法，必须具 有高转染效率、低血细胞毒性、对正常生理学的影响最 小，且使用简单、可重复。
选择转染策略？
定因素是实验的时间范围和最终目标。
瞬时转染细胞一般在转染后24–96小时收集，常用于研 究基因或基因产物的短期表达效应，执行RNA干扰(RNAi)介可以更快速地提供结果；因为mRNA在胞浆中表达，无需 转移到细胞核，无需转录，转染数分钟后即可在部分系统 中表达转染mRNA。
• 使用选择性培养基培养时，未转染的细胞或瞬时转染 细胞都将会死亡，而表达一定水平的抗生素抗性基因 或可以补偿必需基因缺陷的细胞则可以存活。选择标 记物可保护生物体不受选择性试剂影响，这些选择性 试剂通常会杀死生物体或干扰其生长。 • 亦可利用报告基因来筛选成功转染的细胞。用于转染 子筛选的报告基因则可以轻松鉴别出包含报告基因的 细胞。
相比之下，当需要长期基因表达或转染细胞需要在多个 实验中使用时，则更多地选择稳定转染。由于将DNA载体整 合至染色体中的概率较低，因此细胞的稳定转染更麻烦、 更具挑战性，需要选择性筛选和克隆分离。因此，稳定转 染通常用于大规模的蛋白质生产、长期药理学研究、基因 治疗或长期基因调控机制研究。
三、转染的技术
2.转染的应用 • 基因表达
转染最常通过使用质粒载体在培养细胞(或动物 模型)中表达目的蛋白。另外，将带有可检测的标 记物及其他修饰的蛋白质导入细胞，可用于启动子 和增强子序列或蛋白间相互作用的研究。
• 基因抑制
转染的另一个常用用途是通过RNA干扰(RNAi)抑 制特定蛋白质的表达。
细胞转染的原理
细胞转染的原理一、细胞转染的基本概念细胞转染是指将外源性DNA或RNA等物质导入到细胞内，以达到改变细胞基因表达或功能的目的。
它是生物学研究中常用的技术手段之一，广泛应用于基因治疗、药物筛选和基因功能研究等领域。
二、细胞转染的方法1. 化学法：通过化学试剂（如聚乙烯醇、离子脂质体等）将DNA或RNA导入到细胞内。
这种方法简单易行，但毒性较大且效率不高。
2. 物理法：通过机械冲击（如电穿孔）、高压注射、微注射等方式将DNA或RNA直接注入到细胞内。
这种方法效率较高，但操作复杂且对细胞有一定伤害。
3. 病毒载体法：利用病毒作为载体将DNA或RNA导入到细胞内。
这种方法效率高，但存在安全隐患和限制性较大。
三、化学法转染原理1. 离子脂质体介导转染离子脂质体是由阳离子表面活性剂和阴离子脂质组成的复合物，具有良好的生物相容性和可生物降解性。
在转染过程中，DNA或RNA与离子脂质体形成复合物，通过静电作用与细胞膜结合并进入细胞内。
此外，离子脂质体还能促进细胞内吞作用和溶酶体逃逸，提高转染效率。
2. 聚乙烯醇介导转染聚乙烯醇（PEI）是一种阳离子聚合物，在水中能形成稳定的颗粒。
在转染过程中，PEI与DNA或RNA形成复合物，通过静电作用与细胞膜结合并进入细胞内。
PEI不仅能促进细胞内吞作用和溶酶体逃逸，还能与核糖体结合并促进基因表达。
四、化学法转染优缺点1. 优点：简单易行、操作方便、不需要专门设备。
2. 缺点：毒性较大、效率低、对不同类型的细胞有一定限制。
五、物理法转染原理1. 电穿孔法电穿孔法利用电场作用使细胞膜通透，形成微小孔道，从而将DNA或RNA导入到细胞内。
电穿孔法的优点是操作简单、效率高，但缺点是对细胞有一定伤害。
2. 高压注射法高压注射法是通过高压气流将DNA或RNA直接注入到细胞内。
这种方法效率高，但对细胞有较大的伤害。
3. 微注射法微注射法是在显微镜下使用微针将DNA或RNA直接注入到单个细胞内。
细胞转染修订版
细胞转染准备：1．无抗生素培养基2．Opti－MEM ⅠReduced Serum Medium3．全培养基1、转染前细胞的处理（以35mm 培养皿为例）：贴壁细胞：在转染前一天，在35mm 培养皿中加入2 ml 无抗生素培养基培养一天，到转染时使细胞达到80％～90％的汇合率。
悬浮细胞:在制备混合物前，将4—8×105细胞用无抗生素培养基培养铺35mm 培养皿2、转染方法（以质粒DNA转染为例）2.1、制备质粒脂质体混合物，OPTI-MEM！1．将质粒溶于50 ul opti-mem 中，混匀室温静置5分钟；2．将脂质体溶于50 ul opti-mem 中，混匀室温静置5分钟；3．将两者混匀，室温静置5分钟（可能出现雾状沉淀，复合物在室温下六小时内稳定）。
2.2、加入培养皿中，温柔混匀；可在6小时后更换全培养基。
2.5、培养18－48个小时后，测量转染效率。
注：如有必要，转染前可用无抗生素无血清培养基。
细胞转染1、转染前细胞的处理（以35mm 培养皿为例）：贴壁细胞：在转染前一天，在35mm 培养皿中加入2 ml 无抗生素培养基培养一天，到转染时使细胞达到80％～90％的汇合率。
悬浮细胞:在制备混合物前，将4—8×105细胞用无抗生素培养基培养铺35mm 培养皿2、转染方法（以质粒DNA转染为例）A. 转染贴壁细胞（35 mm培养皿或6孔培养板）1. 对于每一个转染样本，按如下比例配制转染混合液：2.5 μg 质粒DNA7.5 μL GeneTranx μL 无血清DMEM（或其他无血清培养基, PBS,PBS）总体积100 μL2.用枪头吹打混匀，放置于室温20-40min。
3. 将混合液加入细胞培养皿中，晃动培养皿混匀培养液。
放入CO2培养箱。
注：血清浓度对于转染效果无影响，经测试高达20%的胎牛血清浓度也不会对转染效果产生影响。
4. 在转染后的18-48小时之间，对细胞进行换液。
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2.转染的应用 • 基因表达
转染最常通过使用质粒载体在培养细胞(或动物 模型)中表达目的蛋白。另外，将带有可检测的标 记物及其他修饰的蛋白质导入细胞，可用于启动子 和增强子序列或蛋白间相互作用的研究。
• 基因抑制
转染的另一个常用用途是通过RNA干扰(RNAi)抑 制特定蛋白质的表达。
二、转染的分类
细胞膜是由磷脂双分子层和镶嵌蛋白组成的，带有净负电 荷。因此，它是大分子无法通过的障碍。为了让核酸通过细胞 膜：
1、化学方法：使用载体分子中和或将阳性电荷传递 至带负电的核酸上；阳离子脂质体介导的输送、磷酸 钙共沉淀 2、生物学方法：采用已经过遗传学改造的病毒转移 非病毒基因至细胞内(又称为转导)；病毒输送 3、物理方法：将核酸直接导入细胞质或细胞核内。 显微注射、激光介导的转染
稳定转染子的选择
• 成功完成稳定转染需要高效DNA输送和筛选获得DNA的细胞的 方法。
• 筛选稳定表达转染DNA的细胞的最可靠方法之一是在用于转 染的DNA重组体或共转染至细胞的独立载体中加入选择标记 物，然后经过短暂的恢复期后，在细胞中应用适当的选择压 力。当共转染载体上表达选择标记物时，携带目的基因的载 体与携带选择标记物的载体的摩尔比应在5:1至10:1范围内， 以确保包含选择标记物的细胞也含有目的基因。 • 常用的选择标记物是可传递对各种筛选药物抗性的基因或可 以补偿转染细胞系中缺陷必需基因的基因。
阳离子脂质体介导的输送
• 特殊设计的阳离子脂质体(如LipofectamineR转染试剂)可促进 DNA和siRNA进入细胞。基本结构包括带正电荷的头基和一个或 两个碳氢链。 • 采用阳离子脂质体试剂时，带负电荷的DNA与带正电荷的脂质 体自发结合，形成DNA-阳离子脂质体试剂复合物。一般认为， 转染复合物通过内吞作用进入细胞。 • 高转染效率，适用于各种真核细胞。操作简单，可确保始终获 得可重复的结果。此外，采用阳离子脂质体试剂可以转染其他 方法无法转染的多种细胞系。
选择转染策略？
定因素是实验的时间范围和最终目标。
瞬时转染细胞一般在转染后24–96小时收集，常用于研 究基因或基因产物的短期表达效应，执行RNA干扰(RNAi)介 导的基因沉默，或者快速生成小量重组蛋白。mRNA瞬时转 染可以更快速地提供结果；因为mRNA在胞浆中表达，无需 转移到细胞核，无需转录，转染数分钟后即可在部分系统 中表达转染mRNA。
相比之下，当需要长期基因表达或转染细胞需要在多个 实验中使用时，则更多地选择稳定转染。由于将DNA载体整 合至染色体中的概率较低，因此细胞的稳定转染更麻烦、 更具挑战性，需要选择性筛选和克隆分离。因此，稳定转 染通常用于大规模的蛋白质生产、长期药理学研究、基因 治疗或长期基因调控机制研究。
三、转染的技术
病毒介导的基因转移
•
病毒载体可根据其特定的应用量身定制，但必须遵循 下列主要特性： 安全性：病毒载体有时来源于病原性病毒，应对其进行适 当的修饰，使病毒操作的风险最小化。通常需要敲除对病 毒复制至关重要的部分病毒基因组，使病毒高效感染细胞 并导入病毒载体， 低毒性：病毒载体应尽量不对其感染的细胞的生理学造 成影响。 稳定性：一些病毒具有遗传不稳定性，会迅速重排基因 组。这会对使用病毒载体的操作的可预测性和可重复性产 生不利影响。 选择性：病毒载体应包含选择标记物，如特定的抗生素抗 性，从而可以分离出摄取了病毒载体的细胞。
3、培养基
• 根据细胞类型和转染方法选择最适合的培养基（合适培 养基的信息通常可通过发表的文献以及提供细胞的机构 或者细胞库获得）。 • 必须使用新鲜培养基，尤其是当其中有些组分不稳定时。
4、血清 • 一般而言，培养基中加入血清可以提高DNA转染 效率。但是，在进行阳离子脂质体介导的转染时， 必须在没有血清存在的情况下形成DNA-脂质体复 合物，因为一些血清蛋白会干扰复合物的形成。 因此当使用含有血清的转染培养基时，应对转染 条件进行优化。 • 转染RNA至细胞时，最好在无血清存在的情况下 进行转染操作，以避免出现RNA酶污染。 5、抗生素 如果使用不含血清的培养基，则应减少抗生素 的用量，以保持细胞健康。
四、报告基因的分析
• 报告基因是其产物可用于转染后分析的基因，通常是一 种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，其表达产物非常 容易被鉴定。将其编码序列与目的基因相融合，在调控 序列下进行表达，从而利用它的表达产物标定目的基因 的表达调控。 • 理想的报告基因应是研究使用的细胞中不存在的基因， 或可以与该基因的天然形式轻松区分，检测方便，且具 有较广的线性检测范围。另外，报告基因的存在不应影 响转染细胞的正常生理学和可鉴别特性的常用报告基因通常包含荧光和化学发光蛋白。 • 表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞可在紫外光照射下发出绿色荧光。 需要采用专门的显微镜观察单个细胞。此外还有黄色和红色荧光 蛋白可供选择，一次可以检测多个基因。 • 荧光素酶用作实验试剂时通常是指北美萤火虫荧光素酶。荧光素 酶可以催化其底物(一般为荧光素)，根据荧光素酶基因的不同， 产生黄绿色或蓝色荧光。由于荧光素酶的生物发光无需激发光， 因此几乎不会出现自发荧光，可以实现无本底荧光。 • GUS分析(使用β-葡萄糖苷酸酶)是一种极佳的单细胞检测方法， 无需复杂设备可将细胞染成蓝色。其缺点是细胞会在此过程中死 亡。 • 蓝-白斑菌落筛选可用于细菌和真核细胞。细菌lacZ基因编码β半乳糖苷酶。加入含有特定半乳糖苷(如X-gal)的培养基后，表 达基因的细胞将X-gal转变为蓝色，通过裸眼即可观察。
• 使用选择性培养基培养时，未转染的细胞或瞬时转染 细胞都将会死亡，而表达一定水平的抗生素抗性基因 或可以补偿必需基因缺陷的细胞则可以存活。选择标 记物可保护生物体不受选择性试剂影响，这些选择性 试剂通常会杀死生物体或干扰其生长。 • 亦可利用报告基因来筛选成功转染的细胞。用于转染 子筛选的报告基因则可以轻松鉴别出包含报告基因的 细胞。
• •
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尽管转染效率因细胞类型的不同而异，在104个转染 细胞中只有大约一个细胞可以稳定整合DNA (不论使用 的是线性还是环状DNA)。 没有一种方法可以适用于所有细胞和所有实验。必须 根据您的细胞类型和实验要求选择理想的方法，必须具 有高转染效率、低血细胞毒性、对正常生理学的影响最 小，且使用简单、可重复。
1 、瞬时转染
导入核酸只在细胞中存在一段时间，且未整合至基 因组。因此，在细胞分裂过程中，瞬时转染的遗传物质 不会传递至下一代，其会在环境因素影响下丢失或在细 胞分裂过程中被冲淡。使用超螺旋质粒DNA进行瞬时转 染的效率最高， 因为它能被细胞更高效地摄取。
2 、稳定转染
外源性DNA被整合至细胞基因组中，并可以长期存在 于转染细胞。即使导入基因在多代细胞中永久性地表达， 适用于重组蛋白生产和外源性DNA表达的下游或长期效 应分析。但是，通常只有单个或几个拷贝的外源性DNA 被整合至稳定转染细胞的基因组中。正因如此，稳定转 染基因的表达水平一般低于瞬时转染基因的表达水平。
五、影响转染效率的因素
1、细胞类型 转染实验中细胞类型的选择是常被忽略的关键因素。各细胞 类型对特定转染试剂或方法的反应各异，因此需要选择合适的 细胞类型。
2、细胞健康与活性
• 一般而言，转染之前，应至少有90%的细胞为活细胞，且 传代复苏时间应足够，而且用复苏后传代次数低于30次 的细胞。 • 在转染前至少24h传代细胞，以确保细胞能够恢复，并在 转染时处于最佳生理学状态。 • 避免污染。
细胞转染
目录
1、转染的简介 2、转染的分类 3、转染的技术 4、报告基因分析 5、影响转染效率的因素
一、转染的简介
1.什么是转染 从广义上讲，转染是采用除病毒感染外的其他方 法将核酸(DNA或RNA)人工导入细胞的过程。采用各 种化学、生物学或物理方法导入外源性核酸会改变 细胞的特性，从而实现细胞基因功能和蛋白质表达 研究。 转染后，导入的核酸可以瞬时性地存在于细胞内， 只表达一段时间且不会复制，也可以稳定地整合至 受体基因组内，随着宿主基因组的复制而复制。