芦丁与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱研究
四种黄酮类化合物与牛血清白蛋白相互作用的光谱分析
四种黄酮类化合物与牛血清白蛋白相互作用的光谱分析薛春霞;董社英【摘要】在人体生理pH条件下,利用紫外吸收光谱和荧光光谱研究了槲皮素(QUE)、大豆甙元(DAD、4 ',7-二甲氧基-3’-异黄酮磺酸钠(DISS)和3'-大豆甙元磺酸钠(DSS)四种黄酮类化合物与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用,结合反应机理对其进行了初步探讨;并计算了结合位点数和结合常数.紫外吸收光谱分析结果表明,在pH=7.4条件下,黄酮类化合物中疏水性的苯环与BSA疏水腔中的氨基酸残基发生作用,从而导致药物分子的吸收峰红移,用Scatchard拟合法可求得DAI及DSS与BSA的结合常数.荧光光谱分析结果表明,BSA对DAI、DISS和DSS均有明显的敏化增强效应,计算得到的增强速率常数分别为1.39×1011,7.72×1011和1.93×1012L·s-1 ·mol-1,并可求得结合位点数和结合常数.【期刊名称】《化学研究》【年(卷),期】2014(025)002【总页数】6页(P152-157)【关键词】BSA;QUE;DAI;DISS;DSS;相互作用;紫外吸收光谱;荧光光谱【作者】薛春霞;董社英【作者单位】华中农业大学楚天学院,湖北武汉 430205;西安建筑科技大学,陕西西安710055【正文语种】中文【中图分类】O657.3黄酮类化合物是广泛分布在植物中的一类化合物，具有多种生理功能和药用价值［1－3］.槲皮素（QUE）是一种天然黄酮类化合物，具有祛痰、平喘、降血压、减小毛细管脆性、降血脂、扩张冠状动脉等重要生理作用，是目前已知的较强抗癌剂之一［4－6］.大豆甙元（DAI）及其衍生物属于异黄酮类化合物，具有防治肿瘤发生，提高机体免疫能力，抗炎、降低胆固醇等功能 .对大豆甙元进行结构修饰及改性可以合成出新的强水溶性的4′，7－二甲氧基－3′－异黄酮磺酸钠（DISS）和3′－大豆甙元磺酸钠（DSS）［8］.本文研究的四种黄酮类化合物结构式如图1所示，黄酮类化合物能够与蛋白质或其他生物大分子发生特异性结合，进而调节它们的结构和功能并发挥其药理作用.采用紫外光谱（UV）和荧光光谱（FS）考察了QUE、DAI在不同pH下的存在状态；在此基础上，从药物小分子结构的角度探讨了在pH＝7.4条件下，QUE、DAI、DISS、DSS四种黄酮类化合物与BSA的相互作用，这对于阐明药物的运输过程及其在体内的作用机制具有一定的意义，为药物合成、临床用药提供了基础数据.960MC型荧光分光光度计（上海精密仪器有限公司）；Nicolet Evolution 300型紫外－可见分光光度计（英国Thermo公司）；IX－501A型pH计（北京大学化学系）；Z－SJ60－4电子分析天平（沈阳龙腾电子秤量仪器有限公司）. BSA（上海国药集团化学试剂有限公司），相对分子质量以67 000计.1.0×10－4 mol／L标准储备溶液：准确称取0.167 5g BSA，用0.1mol·L－1的NaCl水溶液溶解并定容至25mL，4℃下放入冰箱保存，用时适当稀释；QUE（陕西武功制药厂）、DAI（陕西武功制药厂）、DISS和DSS（均由陕西师范大学化学与材料科学学院合成）的2.0×10－3 mol／L标准储备溶液，用时适当稀释；0.02mol／L，pH＝7.4的NaH2PO4－Na2HPO4缓冲溶液；所用其他试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水.1.2.1 紫外光谱测定将一定量的黄酮类化合物与BSA溶液依次加入到10mL比色管中，以0.02mol·L －1，pH＝7.4的NaH2PO4－Na2HPO4缓冲溶液稀释至刻度，振荡均匀，放置15min.用相应的缓冲溶液体系作参比，在190～450nm波长范围内，分别测定黄酮类化合物及其与BSA混合溶液的紫外吸收光谱图.1.2.2 荧光光谱测定设定激发波长为365nm，扫描范围为400～600nm，激发狭缝宽为10nm，分别测定黄酮类化合物与一系列不同浓度的BSA混合溶液在0.02mol·L－1，pH＝7.4的NaH2PO4－Na2HPO4缓冲体系中的荧光发射光谱图.2.1.1 pH对QUE、DAI结构的影响图2为pH对QUE、DAI紫外吸收光谱的影响.黄酮类化合物的紫外光谱通常有两个吸收带，吸收带Ⅰ位于290～380nm，是分子中C环和B环上的羰基共轭体系的紫外吸收，位于240～280nm的吸收带Ⅱ是A环与C环上羰基共轭体系的紫外吸收 .QUE分子A环上7－位的酚羟基与C环上的羰基处于同一个共轭体系的对位，具有较强的酸性，在弱碱性缓冲溶液中易发生解离成为阴离子［10］.7－位羟基的解离使其所在共轭体系的紫外吸收光谱谱带发生明显红移.310nm处的吸收峰的强度随pH的增加逐渐增加，而379nm处吸收带的强度则逐渐减弱，说明310nm处吸收带的强度代表着分子的解离程度.在pH＝7.4时，310nm处的中等吸收带显示QUE是中性分子和离子型分子共存的混合物.对于DAI，同样由于7－位羟基的解离使吸收带Ⅰ、吸收带Ⅱ的强度都随pH的增加逐渐增强.335nm处的吸收带在pH＝7.4时才逐渐增大，代表着7－位的酚羟基分子的解离程度.结果表明，pH＝7.4时，335nm处的中等吸收带显示DAI是中性分子和离子型分子共存的混合物.2.1.2 QUE、DAI、DISS、DSS与BSA相互作用的紫外光谱图3为在pH＝7.4生理条件下，四种黄酮类化合物与BSA相互作用的紫外吸收光谱图.固定药物的浓度，加入一系列不同浓度的BSA，随着BSA加入量的增大，药物分子的吸收带Ⅰ几乎不随BSA浓度的改变而发生明显变化；而吸收带Ⅱ的吸收峰强度有规律地增强并且峰位略微红移，说明这四种黄酮类化合物与BSA之间发生了相互作用，同时也说明它们的相互作用使该共轭体系的能级发生了明显的变化.这是由于黄酮类化合物中苯环的疏水性使其与BSA疏水腔中的氨基酸残基发生作用［11］，从而导致药物分子的吸收峰红移.图4为不同浓度BSA对药物分子QUE、DAI、DISS、DSS中吸收带Ⅰ、吸收带Ⅱ的影响.从图中可以看出BSA对药物分子吸收带Ⅱ呈现明显的增色效应，而对吸收带Ⅰ的影响比较微弱.据此说明四种黄酮类化合物与BSA相互作用时，主要是C环和A环上的羰基共轭体系与BSA的氨基酸残基发生了相互作用.2.1.3 DAI、DSS与BSA相互作用的结合常数根据Scatchard模型方程［12］：式中ΔA表示加入BSA前后黄酮类化合物溶液吸光度的差值，cBSA、cL分别表示BSA和黄酮类化合物的浓度.根据式（1）的ΔA对ΔA／cBSA作图，由拟合直线的斜率可得结合常数K.除DISS明显不能满足Scatchard拟合外，其他拟合的线性程度很高，DAI的ΔA和ΔA／cBSA关系如图5所示.DAI与BSA作用可以用（1）式在较低浓度和较高浓度回归出两条曲线，其线性回归方程分别为y＝0.051 89＋0.678 4 x，r＝0.999和y＝0.176 5＋0.017 39 x，r均为0.999.据此求得较低浓度和较高浓度的结合常数分别为1.47×105和5.75×106 L·mol－1.同样方法求得DSS与BSA的结合常数为3.59×105 L·mol－1.图6为在激发波长为365nm下，不同浓度的蛋白质对DAI，DISS和DSS分子的荧光光谱的影响.BSA在400～600nm范围内没有荧光发射信号，对该荧光加强图没有干扰.随着BSA浓度的逐渐增加，DAI、DISS和DSS的荧光发射峰强度有规律的增强，但是荧光发射峰的峰位几乎没有发生明显变化，表明BSA均能够与DAI、DISS、DSS发生相互作用进而敏化增强药物分子的内源荧光［13］.2.2.1 荧光敏化加强过程速率常数根据荧光动态猝灭理论的Stern－Volmer方程［14］，修改后作为荧光敏化加强理论公式：其中IF0和IF分别表示加和未加增强剂时体系的荧光强度，Kq为双分子增强过程速率常数，Ks为动态速率常数，τ0为增强剂不存在时荧光分子平均寿命，cBSA为BSA的浓度.根据实验数据，对于DAI－BSA，DISS－BSA，DSS－BSA体系，IF0／IF与cBSA均呈现良好的线性关系（见图7），由直线斜率可得DAI、DISS、DSS的增强速率常数Kq分别为1.39×1011，7.72×1011和1.93×1012L·s－1·mol－1.2.2.2 结合位点数及结合常数的求解根据静态猝灭过程理论公式［15－16］，修改后得：式中IF0和IF分别表示加和未加增强剂时体系的荧光强度.固定药物的总浓度，改变蛋白质的浓度cBSA，以lg［（IF－IF0）／IF］对lgcBSA作图可得一条直线.实验发现DAI－BSA，DISS－BSA，DSS－BSA体系中，lg［（IFIF0）／IF］对lgcBSA作图均呈现良好的线性关系（见图8），由各直线的斜率和截距可以分别计算得到DAI、DISS、DSS与BSA相互作用的结合位点数n和结合常数K（见表1）.从表1中可以看出K值呈现增加趋势，结合位点数也呈现递增趋势，表明三种药物分子与BSA之间存在相互作用，能被BSA所贮运.以黄酮类化合物为基体，利用紫外吸收光谱和荧光光谱比较详尽地研究了BSA对QUE、DAI、DISS和DSS四种体系的影响，从药物小分子结构的角度探讨了药物－蛋白质作用.紫外吸收光谱测试结果表明，BSA对QUE、DAI、DISS和DSS均有明显的增色效应，且药物分子进入蛋白质分子中的疏水性氨基酸残基之间通过疏水作用聚集在一起构成疏水腔，药物小分子中苯环的疏水性使其与疏水腔中的氨基酸残基发生作用；荧光光谱测试结果表明，BSA对DAI、DISS和DSS均有明显的敏化增强效应，计算得到增强速率常数Kq分别为1.39×1011，7.72×1011和1.93×1012 L·s－1·mol－1.【相关文献】［1］孙庆雷，王晓，刘建华，等.黄酮类化合物抗氧化反应性的构效关系［J］.食品科学，2005，26（4）：69－73.［2］范攀越，王江，黄远，等.一种黄酮类衍生物的合成及其体外抗癌活性［J］.化学研究，2013，24（1）：68－70.［3］王秋亚，王烨娟，高锦红.白杨素衍生物的合成及生理活性研究进展［J］.化学研究，2011，22（1）：96－110.［4］康敬万，卓琳，卢小泉，等.槲皮素与DNA的电化学作用研究［J］.西北师范大学学报：自然科学版，2003，39（4）：57－61.［5］程玲玲，孙希孟，郭九吉，等.多元分辨－交替最小二乘法研究Cu2＋与槲皮素的相互作用［J］.河南大学学报：自然科学版，2011，41（6）：588－591.［6］渠文涛，朱玮，翟广玉，等.槲皮素衍生物的合成及生物活性研究进展［J］.化学研究，2012，23（4）：101－110.［7］董社英，郑建斌，高鸿.3′－大豆甙元磺酸钠的电化学行为及应用研究［J］.化学学报，2003，61（4）：487－494.［8］郑建斌，董社英，延绥宏，等.4′，7－二甲氧基－3′－异黄酮磺酸钠的电化学行为研究［J］.化学学报，2004，62（11）：1071－1074.［9］黄量，于德泉.紫外光谱在有机化学中的应用（下册）［M］.北京：科学出版社，2000：281. ［10］张红雨.黄酮类抗氧化剂结构－活性关系的理论解释［J］.中国科学（B辑），1999，29（1）：91－96.［11］谢孟峡，徐晓云，王英典，等.4′，5，7－三羟基二氢黄酮与人血清白蛋白相互作用光谱学研究［J］.化学学报，2005，63（22）：2055－2062.［12］何梅，夏之宁，阴永光，等.紫外光谱研究中药大黄有效成分与牛血清白蛋白的相互作用［J］.中国现代应用药学杂志，2004，21（6）：429－432.［13］杨曼曼，席小莉，杨频.用荧光猝灭和荧光加强两种理论研究喹诺酮新药与白蛋白的作用［J］.高等学校化学学报，2006，27（4）：687－691.［14］SILVA D，CORTEZ C M，LOURO S R.Chlorpromazine interactions to sera albumins.A study by the quenching of fluorescence［J］.Spectrochim Acta A：Mol Biomol Spectrosc，2004，60（5）：1215－1223.［15］BI Shuyun，SONG Daqian，TIAN Yuan，et al.Molecular spectroscopic study on the interaction of tetracyclines with serum albumins［J］.Spectrochim Acta A：Mol Biomol Spectrosc，2005，61（4）：629－636.［16］李桂芝，刘永明，虢新运，等.荧光法研究盐酸拓扑替康、盐酸依利替康喜树碱类药物和牛血清白蛋白的相互作用［J］.化学学报，2006，64（7）：679－685.。
荧光法研究曲克芦丁和
目的：研究曲克芦丁(Troxerutin)与人血清白蛋白 (HSA)的相互结合作用。 方法：以HSA为荧光剂,Trox-erutin为荧光猝灭剂,在 激发波长为220 nm,发射波长为345 nm下测定两者结 合后的荧光强度,推测其猝灭机理;分别测定相同浓度的 HSA的荧光发射光谱图和紫外可见吸收光谱图,来推断 两者结合的作用力类型。 结果：Troxerutin与HSA的相互作用为静态猝灭过程, 平衡常数K0(25℃)=6· 18×105L/mol、K0(37℃)= 3· 76×105L/mol,供体(HSA)与受体(Troxerutin)间的 作用距离r=4· 66 nm。Troxerutin和HSA的作用力类 型为疏水作用力。 结论：通过两种分析方法清楚的研究了曲克芦丁与血 清白蛋白的相互作用。
曲克芦丁(Troxerutin)是一种重要的黄酮类化合 物,它是羟基芦丁中最重要的有效成分,医药上用 于治疗静脉障碍血栓症及脑血管疾病。最近几 年国外把曲克芦丁应用于防治长途飞行引起的 微血管病，使曲克芦丁临床研究拓展到新的领 域。药物进入体内一般都需要通过血浆的储存 和运输来到达受体部位,发生药理作用。血清白 蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白,可与许多 内源及外源性化合物结合。因此,研究药物与白 蛋白的相互作用,具有重要的理论和现实意义。
讨论
随着我国社会经济的发展,人们的生活水平和营养知识 水平逐步提高,天然食品、绿色食品、无公害食品、营 养饮食等已成为人们日益关心的问题。但是,目前大学 生的营养知识还是相当贫乏,营养知识的宣传工作开展 得较少,有待加强。本次调查结果,某医学院学生营养知 识较缺乏,营养调查总分女生高于男生;营养知识评分不 及格率临床医学专业学生高于护理专业学生,护理和临 床医学专业学生的营养态度得分和饮食行为得分基本相 同;营养知识来源主要是报刊和书籍,这与有关报道相似。 护理专业学生的营养调查总评分与营养知识得分高于临 床医学专业学生,可能是护理专业学生毕业后主要从事 护理工作,接触和护理病人时将向病人宣传营养知识及 营养与疾病、营养与治疗疗效等,因此特别注意学习营 养知识。医学院校应加强营养教育,开设营养学或临床 营养学课程,为医学生毕业后在工作中向病人宣传、指 导营养知识及对病人进行营养治疗打下基础。
反白藜芦醇与牛血清白蛋白相互作用的多光谱法研究
反白藜芦醇与牛血清白蛋白相互作用的多光谱法研究任凤莲;谭小艳;杨春生;瞿白露;王丽苹【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2008(27)6【摘要】利用荧光技术研究了抗癌药物反白藜芦醇与牛血清白蛋白的相互作用,结果证实,反白藜芦醇对牛血清白蛋白有很强的荧光猝灭作用,猝灭类型为静态猝灭.计算了反白藜芦醇与牛血清白蛋白在300、310和320 K时的结合常数、结合位点、结合距离和热力学常数等参数.由热力学参数推断两者结合过程中,起主导作用的是范德华力或氢键.同步荧光光谱和红外光谱同时说明两者结合前后蛋白质的结构发生了变化.研究还表明,金属离子Fe3+、Cu2+和Zn2+的加入使反白藜芦醇与牛血清白蛋白之间的结合常数和结合位点减小.【总页数】5页(P630-634)【作者】任凤莲;谭小艳;杨春生;瞿白露;王丽苹【作者单位】中南大学,化学化工学院,湖南,长沙,410083;中南大学,化学化工学院,湖南,长沙,410083;盐城工学院,化学与生物工程学院,江苏,盐城,224003;中南大学,化学化工学院,湖南,长沙,410083;中南大学,化学化工学院,湖南,长沙,410083【正文语种】中文【中图分类】Q512.1;O641.3【相关文献】1.白藜芦醇与牛血清白蛋白相互作用的研究 [J], 杨媛媛;王东跃;郗国宏;刘伟华;李超;王志2.纳米粒子共存下白藜芦醇与牛血清白蛋白相互作用的光谱研究 [J], 陈代武3.多光谱法和分子对接模拟法研究美满霉素与牛血清白蛋白的相互作用 [J], 王晓霞; 聂智华; 马力通; 崔金龙; 赛华征; 赵文渊4.光谱法与计算机模拟法研究六溴环十二烷与牛血清白蛋白的相互作用 [J], 庹浔;宋继敏;付豪;吕小兰5.多光谱法和分子对接模拟法研究黄腐植酸和牛血清白蛋白的相互作用 [J], 王晓霞;吴昊;聂智华;马力通;崔金龙;赛华征;成建国因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
芦丁与牛血清白蛋白相互作用的光电化学研究
芦丁与牛血清白蛋白相互作用的光电化学研究朱庆仁;陈彩莲;孙登明【摘要】采用紫外可见、荧光光谱法和循环伏安法,研究牛血清白蛋白(BSA)与芦丁(rutin)的相互作用.用荧光法和循环伏安法测得芦丁与BSA的结合常数K分别为3.2×106L/mol和5.3×106L/mol,结合位点数均接近1.5.芦丁在低浓度时对牛血清白蛋白是静态猝灭,高浓度时是静态和动态的结合猝灭.BSA荧光强度的降低与芦丁浓度在一定范围内呈线性关系,其线性范围为8.00×10-8 ～1.00×10-5 mol/L,检出限为7.00×10-8 mol/L.芦丁氧化峰电流的下降与BSA浓度在一定范围内呈线性关系,其线性范围为7.00×10-9～1.00×10-6 mol/L,检出限为5.00×10-9mol/L.用于合成样品中芦丁和BSA的测定,结果满意.【期刊名称】《淮北师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(034)003【总页数】5页(P23-27)【关键词】芦丁;牛血清白蛋白;相互作用;光电化学【作者】朱庆仁;陈彩莲;孙登明【作者单位】淮北师范大学化学与材料科学学院,安徽淮北235000;淮北师范大学化学与材料科学学院,安徽淮北235000;淮北师范大学化学与材料科学学院,安徽淮北235000【正文语种】中文【中图分类】O657.32蛋白质是生物体内具有重要生理功能大分子，是药物发挥药效的重要载体和靶分子，研究具有药理活性的小分子与蛋白质相互作用，对于了解药物发挥药效的作用机制，揭示药物药效的实质内涵具有重要意义.芦丁(rutin)又名芸香苷、紫槲皮苷，是一类来源较广的黄酮类化合物，也是很多中草药的有效成分，具有广泛的药理活性，具有抗氧化、保护心血管等药理作用，临床上用于防治脑出血、高血压、视网膜出血、紫癜、急性出血性肾炎、慢性支气管炎、镇痛等，同时还用于预防和治疗糖尿病及合并高血脂症.芦丁作为一种具有广阔开发前景的药用植物活性成分，国内学者近年来对它的研究主要集中在提取工艺的改善、药理作用及药效学研究等方面[1－2].由于药物进入体内后，要通过血浆的贮存和运输，达到受体部位后才发生药理作用，而多数药物在血浆中都或多或少地与血浆蛋白(主要是白蛋白)结合.小分子和BSA的相互作用的研究已有报道[3－7]，但芦丁与BSA的相互作用的研究很少，且只有光谱法研究[8]，对芦丁和BSA的光电化学研究及测定还未见报道.本文用光电化学方法研究芦丁与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，测定结合常数、结合位点数，并对芦丁和BSA进行测定.1 实验部分1.1 仪器与试剂UV－3600紫外可见近红外分光光度计(日本岛津公司);FP－8300荧光光谱仪(日本岛津公司);BAS100/W电化学分析系统(美国BAS公司);PHS－3C型精密酸度计(上海康仪仪器有限公司).电化学实验用三电极体系:玻碳工作电极(GCE)，Ag/AgCl 参比电极，铂丝辅助电极.BSA(国药集团化学试剂有限公司)储备液:1.00×10－4mol/L，按常规配制，在4°C左右保存，使用时再稀释至所需浓度;芦丁(国药集团化学试剂有限公司)储备液:4.00×10－5mol/L，使用时再稀释至所需浓度;B－R缓冲溶液;磷酸盐缓冲溶液(PBS);1.00 mol/L KCl溶液.其他试剂均为分析纯，水为二次石英亚沸蒸馏水.1.2 实验方法1.2.1 荧光光谱法在10 mL比色管中加入2.0 mL pH 2.5的B－R缓冲液，1.0 mL的1.0 mol/L KCl(aq)，固定BSA溶液的浓度，加入不同浓度的芦丁溶液，以水定容，摇匀，静置30 min.在荧光光度计上记录在298 K条件下，290～450 nm范围内的荧光发射光谱(λex=278 nm，λem=342 nm，激发和发射狭缝宽度均为5 nm).1.2.2 吸收光谱的测定在一系列 10 mL 比色管中，依次加入 1.0 mL 的 0.1 mol/L PBS pH 7.4 缓冲溶液，1.0 mL 的1.00 mol/L的KCl溶液，分别加入一定体积的芦丁或一定体积的BSA或芦丁与BSA的混合物，定容，混匀，静置30 min，以水作参比，在298 K条件下，测定波长200～400 nm的吸收光谱.1.2.3 电化学法在 10 mL 比色管中，依次加入 2.0 mL pH2.5的 B －R 缓冲液，1.0 mL 的 1.0 mol/L KCl溶液，1.0 mL的1.0×10－4mol/L的BSA溶液，一定量的rutin溶液，以水定容，摇匀，静置30 min.在298 K条件下，测量rutin溶液、rutin和BSA混合溶液的线性扫描伏安图.2 结果与讨论2.1 BSA与芦丁相互作用的光电化学图谱BSA和芦丁相互作用的荧光光谱图(见图1)，由图1可以看出，BSA在278 nm处有荧光最大发射峰，当固定BSA浓度不变时，随着芦丁浓度的增加，BSA的内源荧光强度逐渐降低，表明芦丁能猝灭BSA的内源荧光，两者之间发生相互作用. 图1 荧光发射光谱Fig.1 Emission spectraCBSA=1.00 × 10－5mol/L，Crutin=2.00 ×10－4mol/L(1→9):0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5mL图2 线性扫描伏安图1.芦丁 2.芦丁和BSAFig.2 Linear sweep voltammograms1.rutin;2.rutin －BSA;Crutin=4.00 × 10－5mol/L;CBSA=5.00 × 10－7mol/L;t=8 s;v=0.18 V/s芦丁和rutin－BSA体系的线性扫描伏安曲线如图2所示，在pH 2.5 B－R缓冲溶液中，在0.05～0.95 V的扫描范围内，芦丁在玻碳电极上产生一个灵敏的氧化峰，加入BSA后芦丁的峰电流明显降低，峰电位向右移动，表明两者之间发生相互作用[9].紫外－可见光谱法是检测复合物形成与否的一种有效的方法.为了确证芦丁与BSA之间发生了作用，测定芦丁和BSA及混合体系的吸收光谱(如图3所示).由图3可见，芦丁的吸收峰在265 nm处，BSA的吸收峰在279 nm处，两者混合后吸收峰位置发生改变，吸收峰出现在275 nm，且吸光度不呈加和性，说明芦丁与BSA发生了相互作用，生成新的复合物[10]，同时也验证上述荧光和电化学谱图现象.2.2 芦丁与BSA相互作用的光电化学机理2.2.1 荧光猝灭机理荧光猝灭过程分为静态猝灭和动态猝灭[11].静态猝灭是猝灭剂和荧光物质的基态分子之间的相互作用;动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用，其猝灭过程遵循Stern－Volmer方程:上式中 Fo是未加入猝灭剂时的荧光强度;F是加入猝灭剂后的荧光强度;Kq是双分子猝灭过程速率常数，Ksv是Stern－Volmer动态猝灭常数.而[Q]则是猝灭剂的浓度，τo是猝灭剂不存在的条件下生物大分子的平均寿命，通常生物大分子的荧光寿命大约为10－8s.图3 紫外光谱1.芦丁和 BSA 2.BSA 3.芦丁Fig.3 The UV spectra1.rutin －BSA;;2.BSA;3.rutin;Crutin=4.00 ×10－6mol/L;CBSA=4.00 × 10－6mol/L图4 芦丁对牛白蛋白荧光淬灭Stern－Volmer方程曲线Fig.4 The Stern －Volmer plots of BSA with rutin由图4中曲线1可以看出，两者之间的作用不是一条直线，而是一条向上弯曲的曲线.但由图4中曲线2可看出，芦丁浓度从2.00×10－5mol/L到6.00×10－5mol/L的区间内，两者之间的Stern－Volmer方程曲线是一条直线.它们都显示良好的线性关系，则对应的斜率为Stern－Volmer方程曲线的猝灭常数 Ksv.由Ksv=Kqτo可得 Kq=Ksv/τo，从而可以求得猝灭过程速率常数 Kq.Ksv=7.19×104L/mol，Kq=7.19 ×1012 L/(mol·s)，可知 Kq值远远大于各类淬灭剂对生物大分子的最大扩散常数2.00×1010L/(mol·s)，因此芦丁对牛白蛋白的荧光淬灭以静态猝灭为主.当芦丁浓度较高时(＞6.00×10－5mol/L)，此时Stern－Volmer图表现为向 Y轴弯曲，且无明显的拐点，这就说明随着猝灭剂浓度增大，动态猝灭逐渐表现，因此当芦丁浓度较高时，猝灭机理为动态和静态联合猝灭[12].因为芦丁浓度较低时是静态猝灭过程，所以可用对数方程来计算芦丁较低浓度(＜6.00×10－5mol/L)时二者的结合常数 K和结合位点数 n[13]:式中，F0和 F分别是不存在和存在猝灭剂时的荧光强度，K为蛋白质和猝灭剂的结合常数，n为结合位点数，[Q]是猝灭剂的浓度.以lg[(F0－F)/F]对lg[Q]作图(如图5).图5 lg[(F0－ F)/F]～lg[rutin]的线性关系Fig.5 The linear diagram of lg[(F0－F)/F]and lg[rutin]图6 log[ΔI/(ΔImax－ΔI)]和 log[rutin]的线性关系Fig.6 The linear diagram of log[ΔI/(ΔImax－ΔI)]and log[rutin]如图5所示，求得芦丁与BSA相互作用的结合常数 K和结合位点数 n，其线性方程为:则K=3.21 ×106L/mol，n=1.41.2.2.2 电化学机理芦丁，改变扫描速率进行测定，结果表明，在20～600 mV/s范围内，随着扫描速率的增加，Epa向正移，Epc向负移，芦丁的氧化峰和还原峰电流的对数与扫描速率的对数成线性关系，其线性关系分别为:lgIpa=1.053+0.585 lgv， R=0.999 3;lgIpc=0.813+0.656 lgv， R=0.981 4，说明芦丁在裸玻碳电极表面的反应是吸附和扩散的混合控制，以扩散控制为主[14].在芦丁溶液中加入BSA后，峰电流降低，但rutin－BSA的lgIp'～lgv'也呈线性关系，其线性回归方程为:lgIpa'=0.864+0.698 lgv，R=0.996 4;lgIpc'=0.743+0.831 lgv，R=0.999 7，但斜率有所增大，说明随着BSA浓度的增加，芦丁的电极反应表面过程逐渐由扩散控制为主，转为以吸附控制为主.假定芦丁与BSA只形成一种简单的化合物BSA－mrutin，则结合常数(β)和结合数(m)可根据下式[15]求得:式中ΔImax表示加入BSA前后Rutin峰电流的最大差值.作log[ΔI/(ΔImax－ΔI)]～log[rutin]的关系图.如图6所示其线性方程为:求得结合位点数 m=1.47，结合常数β=5.36×106L/mol，与荧光法基本一致.2.3 测定的最佳条件分别采用荧光光谱法对芦丁、电化学方法对BSA进行测定，实验结果表明，荧光法测定芦丁的最佳条件为:PBS的缓冲溶液的酸度为 pH 7.4，用量为1.0 mL;激发波长:278 nm，发射波长:342 nm，放置时间30 min，1.00 mol/L KCl(aq)1.0 mL;线性扫描伏安法测定BSA的最佳条件为:B－R缓冲溶液的酸度为pH 2.5，用量为:2.0 mL，扫描电位范围为:0.05 ～ 1.0 V，扫描速率为 0.18 V/s，静置时间为8 s.在最佳条件下，分别用荧光法(固定BSA浓度为1.00×10－5mol/L)对芦丁、线性扫描伏安法(固定芦丁浓度为4.00×10－5mol/L)对BSA进行测定，测定结果的线性范围、检测限见表1.表1 工作曲线Table 1 Working curve n=5测定物质线性范围/(mol/L)回归方程R 检测限/(mol/L)rutin 8.00 × 10－8～1.00 × 10－5 ΔF=329.79+113.51 c 0.993 1 7.0 ×10－8 7.00 ×10－9～1.00 ×10－7 ΔIp= －0.086+2.77 ×107c 0.997 9 1.00 × 10－7～1.00 × 10－6 ΔIp=2.60+4.72 ×105c 0.996 4 BSA 5.0 ×10－92.4 干扰离子允许误差在+5%以内，荧光法实验进行干扰测定，金属离子Cu2+、Co2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+和Mn2+都对芦丁与牛血清白蛋白的结合有增强作用，其中Co2+和Mn2+的影响相对较大.采用循环伏安法测定其他离子对芦丁与牛血清白蛋白结合的影响，共存物质的允许量(mg):Na+、K+、Zn2+(1)，Ca2+(10)，Cu2+(0.1)，半胱氨酸(0.1)，色氨酸(0.1)，抗坏血酸(0.1).2.5 样品分析配制不同浓度溶液的合成样品并对样品进行分析，结果如表2.表2 芦丁和BSA合成样品分析Table 2 Assay results of artificial sample of rutin and BSAn=5合成样品样品测定物质测定值/(10－7mol/L)RSD/% 加入量/(10－7mol/L)回收率/%rutin 33 4.6 35 99.2 BSA 7.0 3.7 7.0 100.23 结论采用紫外光谱、荧光光谱和电化学多种方法对芦丁与牛血清白蛋白的相互作用进行研究.结果表明，芦丁与BSA之间有较强的结合作用，通过静态猝灭导致BSA内源荧光减弱，同时运用电化学方法，BSA的加入导致芦丁氧化峰电流降低，峰电位基本不变，峰电流的下降值同所加入的BSA浓度在一定范围内呈线性关系及研究了其结合常数、结合位点数和线性范围等.该研究对于阐明芦丁在体内的运输过程和药用机理及设计合成新药具有一定的指导意义.参考文献:[1]张付利，敬永升，宋丽.曲克芦丁对牛血清白蛋白溶液二级结构影响的研究[J].药物分析杂志，2011，31(1):75－78.[2]俞天智，杨汝栋.芦丁与血清白蛋白的作用研究[J].光谱学与光谱分析，2003，23(4):763－765.[3]栾尼娜，吴锦绣，宋玉民.芦丁与血清白蛋白结合作用的热力学研究(I)[J].光谱学与光谱分析，2008，28(4):856－859.[4]于竹青，董社英，黄廷林.不同pH条件下槲皮素与牛血清白蛋白相互作用的电化学研究[J].化学世界，2010(3):135－139.[5]孙伟，焦奎，刘晓云.电化学法研究蛋白质和茜素红S的相互作用[J].分析化学，2002，30(3):312－314.[6]王玲，屈凌波，杨冉.槲皮素和芦丁与牛血清白蛋白相互作用研究[J].分析科学学报，2006，22(6):719－722.[7]李晓霞，赵文琴，苗力孝.甲氧氯普胺的测定及与牛血清白蛋白相互作用的研究[J].分析测试学报，2010，29(11):1 126－1 131.[8]李丽萍，杨雪滢，单香丽.芦丁与牛血清蛋白在不同条件下的相互作用研究[J].云南大学学报:自然科学版，2012，34(1):72－76.[9]邬春华，吕元琦，袁倬斌.大黄酸与牛血清白蛋白相互作用的电化学研究[J].分析测试学报，2004，23(3):73－75.[10]ZHANG G W，WANG A P，JIANG T，et al.Interaction of the irisflorentin with bovine serum albumin:A fluorescence quenchingstudy[J].Journal of Molecular Structure，2008，891:93 － 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光谱法研究辛伐他汀与牛血清白蛋白的相互作用
光谱法研究辛伐他汀与牛血清白蛋白的相互作用张红颖;陈宁生;张文龙【摘要】采用荧光光谱、圆二、傅立叶变换红外光谱及三维荧光光谱等分子光谱法研究了在生理条件下,辛伐他汀(Sim)与牛血清白蛋白(BSA)的结合作用.结果表明,Sim对BSA的猝灭方式为静态猝灭.根据F(o)rster非辐射能量转移理论,计算了Sim与BSA结合部位与色氨酸残基的距离r=1.8 nm.利用标记药物进行了结合位点的定位,确定了Sim结合位置是BSA的site Ⅰ.由圆二、红外及三维光谱可知,Sim对BSA二级结构的改变主要在β-折叠区,在与Sim结合反应过程中,BSA的微环境与构象都发生了变化;同步荧光表明,Sim与BSA的作用部位主要在色氨酸(Trp)残基周围.【期刊名称】《安徽工程大学学报》【年(卷),期】2014(029)001【总页数】4页(P9-12)【关键词】牛血清白蛋白;辛伐他汀;光谱法【作者】张红颖;陈宁生;张文龙【作者单位】安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000;安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000;安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000【正文语种】中文【中图分类】O657.39辛伐他汀（Simvastatin，Sim）是由美国默沙东公司（Merck ＆Co.）研制的一种HMG－CoA还原酶抑制剂，通过抑制HMG－CoA还原酶的活性控制人体内源性胆固醇的合成，调节血液中胆固醇的含量，可有效降低心血管疾病的发病率和死亡率，并具有抗氧化、抗血栓和抗炎等功能［1］，其结构式如图1所示.图1 Sim结构式血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质，对内源和外源性物质都有特异性的结合，因而在体内起着重要的运输作用.牛血清白蛋白（BSA）与人血清白蛋白（HSA）有着相似的结构与序列，是一种应用广泛的血清白蛋白［2］.以BSA作为血清白蛋白的模型，研究Sim与BSA在模拟生理条件下的相互作用.不仅从机理上透彻分析，而且研究了Sim在与BSA结合过程中BSA构象及微环境的变化，对控制Sim在生物体内的运输、代谢，阐明其药代机理、指导合理有效地用药有着重要意义.1 实验部分1.1 仪器与试剂BSA（1.0×10－5 mol/L，Sigma）；乙醇（安徽安特生物化学有限公司）；辛伐他汀（5.0×10－4 mol/L，河南天方药业）；氟灭酸、保泰松（Alfa）；Tris－HCl（0.1mol/L Tris和0.1mol/L HCl溶液配成pH＝7.4的缓冲溶液，Sigma）；NaCl（0.1mol/L，用以维持离子强度）；其他试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水.F－4500荧光分光光度计（日本日立公司）；TU－1901双光束紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；Jasco－20c圆二色谱仪（日本岛津）；FC －104电子天平（上海精科天平厂）；JK－400CDB型高功率数控超声波清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）；SC－15数控超级恒温槽（上海天平仪器厂）.1.2 实验方法在10mL比色管中，依次加入1.0mL BSA 溶液、1.0mL Tris－HCl缓冲溶液（pH ＝7.4）、1.0mL NaCl溶液，用二次蒸馏水定容，摇匀；取出3mL混合液于石英比色皿中，用微量进样器往该溶液中加入一定量的Sim，静置10min后测定荧光光谱.荧光光谱测定条件：激发狭缝和发射狭缝均为10nm、光电管负高压400V、响应速度2.0s、波长扫描速度1 200nm/min，激发波长为280nm，置于1cm比色血中扫描300～500nm范围内发射波长的荧光强度.设置发射波长与激发波长的Δλ＝15nm、60nm，记录265～400nm、250～400nm的同步荧光.圆二色谱测定：使用2mm的石英池，扫描在200～250nm范围内的圆二色谱. 三维荧光光谱测定：设置激发波长200～400nm 增量为5nm 其余设置同荧光光谱测定方法，扫描300～500nm内的荧光强度.紫外－可见吸收光谱测定：将溶液置于1cm比色皿中，用紫外可见分光光度计测定200～800nm范围内的紫外可见光谱.2 结果与讨论2.1 Sim对BSA的荧光猝灭及机理Sim对BSA的荧光猝灭光谱图如图2所示.由图2可知，扫描不同体系的荧光光谱发现，280nm波长激发下，Sim在300～500nm扫描范围内几乎无荧光发射；BSA具有较强的内源荧光，图2显示，向BSA中逐渐加入Sim后，BSA内源性荧光出现有规律的猝灭，且发射峰波长由350nm蓝移至348nm处，说明Sim改变了BSA内部氨基酸残基的微环境，疏水性增强，Sim与BSA可能发生相互作用［3］.为了研究此猝灭过程是由体系中激发态分子的扩散和碰撞产生的动态猝灭，还是由基态分子之间形成了非荧光性物质的静态猝灭，先假设Sim对BSA猝灭为动态猝灭过程，则其作用过程应遵循Stern－Volmer方程［3］：F0/F＝1＋Kqτ0［Q］＝1＋Ksv［Q］.式中，F0 为BSA溶液的荧光强度；F为加入Sim后BSA溶液的荧光强度；Kq为双分子猝灭过程的速率常数；τ0为BSA分子的平均寿命（τ0约10－8 s）［4］；Ksv为Stern－Volmer的动态猝灭常数，［Q］为Sim的游离浓度.图2 Sim对BSA的荧光猝灭光谱图图3 Sim对BSA的荧光猝灭Stern－Volmer图用不同温度下的F0/F对［Q］作图（见图3），得到Ksv和Kq，如表1所示.由表1可知，Ksv随温度的升高而降低，不同温度下的Kq都大于最大扩散碰撞猝灭速率常数2.0×1010 L/mol/s［5］，说明Sim与BSA形成了非荧光性的基态复合物，Sim以静态猝灭方式猝灭了BSA的内源性荧光.表1 不同温度下Sim与BSA间的猝灭反应参数T（K） Ksv（104）L·mol－1 Kq （1012）L·mol－1·s－1 R KA（105）L·mol－1n R 298 3.455 3.455 0.996 0 9.425 1.3 0.999 6 301 3.028 3.028 0.992 0 7.398 1.3 0.999 2 307 2.560 2.560 0.992 6 0.531 1.1 0.994 6据Förster型偶极－偶极非辐射能量转移理论［6］，将 Sim（2.5×10－6 mol/L）吸收光谱与 BSA（1.0×10－6 mol/L）荧光光谱重叠部分积分，得到积分值J＝3.307×10－15 cm3/L/mol，由此计算出E＝0.17、R0＝1.4nm、r＝1.8nm.Sim 与BSA氨基酸残基的结合部位距离为1.8nm，远小于8nm［7］，说明Sim与BSA的结合伴随着非辐射能量转移.图4 BSA－Sim的lg［（F0－F）/F］对lg［Q］图2.2 结合常数、结合位置及位点数、作用力根据静态猝灭公式：式中KA为Sim与BSA的结合常数，n为结合位点数.作lg［（F0－F）/F］～lg［Q］关系图并线性拟合（见图4），由直线斜率和截距可求出Sim与BSA的结合常数KA及结合位点数n.其结果如表1所示.由表1可知，Sim与BSA的结合常数KA的数量级达到为105，说明Sim对BSA有较强的结合作用可形成较稳定的复合物［7］，Sim的脂溶性较好，与BSA结合距离较近的结论相符；随着温度的升高，结合常数有所减小，温度升高不利于复合物的稳定；在不同温度下的平均结合位点数约为1，说明Sim对BSA只有一个结合位点，两者生成了1：1的复合物［7－8］.由范德霍夫等温方程式和热力学函数关系［9］，可得到此结合反应热力学焓变ΔHθ＜0，熵变ΔSθ＜0，ΔGθ＜0，由此可推测：Sim与BSA间主要作用力为氢键或范德华力，Sim与BSA生成复合物的过程为自发过程.大多数药物与BSA的结合部位在siteⅠ S ub－domainⅡA 和siteⅡ Sub－domainⅢA[10].常用保泰松和氟灭酸作为判断siteⅠ和siteⅡ位的标记性药物，如果Sim与标记性药物具有相同的结合部位，那么两者就会发生竞争作用，标记性药物置换出已和BSA结合的Sim.用同浓度的保泰松和氟灭酸对BSASim进行实验，结果如表2所示，保泰松对BSA－Sim体系的影响较大，而氟灭酸对BSA－Sim体系的影响较小.说明Sim与保泰松竞争同一结合部位，使结合常数明显降低，因此Sim与BSA的结合部位在siteⅠ.表2 标记药物存在下对BSA－Sim的结合常数的影响positioning agent KA （105 L·mol－1）n R无9.425 1.3 0.999 6保泰松 0.0202 0.8 0.998 1氟灭酸1.175 1.2 0.995 22.3 同步荧光光谱同步荧光法常用于蛋白质构象的分析［11］.Δλ＝15nm、60nm时，分别显示Tyr和Trp的荧光特性［12］，其同步荧光光谱图如图5所示.由图5可知，BSA中Trp和Tyr都具有荧光，但是其内源荧光主要由Trp残基贡献，且随着Sim的加入，同步荧光强度都相应的减小，峰形基本不变，但Trp的最大发射峰发生微弱蓝移，Tyr的最大发射峰并未移动，Sim与BSA的作用部位主要在Trp周围.Trp残基分别位于BSA分子中第134和212位，分属于ⅠB和ⅡA亚结构域，其中第212位残基位于BSA的疏水腔内表面，说明Sim与BSA的相互作用，主要改变第212位残基Trp所处的微环境，使其疏水性增强.2.4 圆二色谱为了进一步考察Sim与BSA的相互作用及BSA内部二级结构的变化情况，扫描了加入Sim前后的圆二色谱如图6所示.由图6可知，BSA在208nm处有明显的负cotton效应，加入Sim后负峰强度增大，BSA中α－螺旋结构的含量发生了变化［13］.用计算机自带软件计算结果如表3所示，由表3中可知，加入Sim后，BSA的各种二级结构都发生了不同变化，其α－螺旋含量由29.9%下降到27.6%，β－折叠由19.7%上升到34.8%，α－螺旋、β－转角、无规卷曲都不同幅度的转变为β－折叠.可能是因为Sim通过氢键和范德华力与BSA分子的氨基酸残基相互作用，导致BSA分子中各种二级结构含量的改变.图5 BSA－Sim的同步荧光光谱图6 BSA、BSA－Sim的圆二色谱表3 BSA、BSA－Sim的二级结构含量Structure α－heliSim（%）β－sheet （%）β－turn（%） Random coil（%）BSA 29.9 19.7 18.1 32.3 BSA－Sim 27.6 34.8 12.1 25.62.5 三维荧光光谱图7 BSA（A）与BSA－Sim（B）体系的三维荧光光谱实验条件下分别测BSA、BSA－Sim的三维荧光光谱图如图7所示.由图7可知，峰a为瑞利散射峰，加入Sim后峰a荧光强度加强，可能是Sim与BSA生成复合物后使溶液中溶质的粒径增加，散射效应增强.BSA的两个荧光峰的峰顶坐标（F，λex/λem）分别为 peak1（187.5，280/345），peak2（217.8，225/345）.Peak1主要是色氨酸和酪氨酸的光谱特征峰，是研究荧光猝灭的主荧光峰.Peak2反应了多肽主链的荧光性质，其荧光强度与蛋白质的二级结构密切相关.加入Sim后两个荧光峰的峰顶坐标分别为peak1（176.9，280/345），peak2（204.1，230/345）.从峰强分析可知，Sim 的加入使峰1和峰2都发生明显的降低，峰的荧光强度发生了猝灭，蛋白质的二级结构也发生相应的变化.从峰位分析可知，Sim的加入使峰2红移了5nm，结合圆二及红外光谱表明Sim与BSA的结合部位可能位于氨基酸残基所处的疏水腔内，Sim的加入使疏水腔内的极性增加，进而导致BSA构象的变化.3 结论Sim静态猝灭了BSA的内源性荧光，其作用力类型为氢键和范德华力，结合部位主要在siteⅠ.金属离子的加入对Sim与BSA体系产生影响.圆二色谱显示，Sim 对BSA的β－折叠区有较大影响.这对研究Sim在生物体内的代谢及指导合理用药有着重要意义.参考文献：［1］陈实，李承红，叶胜兰.辛伐他汀治疗慢性阻塞性肺疾病合并代谢综合征患者的临床观察［J］.江汉大学学报，2013，4（1）：83－87.［2］ RAWEL H M，MEIDTNER K，KROLL J.Binding of Selected Phenolic Compounds to Proteins［J］.J.Agric Food Chem.，2005，53（10）：4 228. ［3］ WANG Y Q，ZHANG H M，ZHANG G C，et al.Spectroscopic Studies on the Interaction Between Silicotungstic Acid and Bovine Serum Albumin ［J］.J.Pharmaceut.Biomed，2007，43（1）：1 869－1 875.［4］ ZHANG G，ZHAO N，WANG L.Fluorescence spectrometric studies on the binding of puerarin to human serum albumin using warfarin，ibuprofen and digito Simin as site markers with the aid of chemometrics ［J］.Journal of Luminescence，2011，131（12）：2 716－2 724.［5］ WARE W R.Oxygen quenching of fluorescence in solution.An experimental study of the diffusion process［J］.J Phys Chem.，1962，66（3）：455－458.［6］Förs terT.Intermolecular energy transference and fluorescence ［J］.Ann Phys，1948，2：55－75.［7］张秋兰，倪永年.沙丁胺醇和特布他林与牛血清白蛋白作用机理研究［J］.化学研究与应用，2011，23（6）：673－678.［8］余燕敏，冯金朝，刘颖.Fe3＋存在下磺胺甲恶唑与牛血清白蛋白相互作用的光谱学研究［J］.化学学报，2011，69（2）：190－198.［9］陈昌云，李小华，许飞，等.普利沙星与牛血清白蛋白相互作用的光谱学研究［J］.南京师大学报，2006，1（29）：62－65.［10］汪双双，倪永年.光谱法研究11－羟基喜树碱与牛血清白蛋白的相互作用［J］.分析实验室，2010，1（29）：10－13.［11］梁彦秋，臧树良，赵雪.头孢他啶与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用［J］.光谱实验室，2009，6（26）：1 638－1 642.［12］ HU Y J，LIU Y，ZHAO R M，et al.Spectroscopic Studies on the Interaction Between Methylene Blue and Bovine Serum Albumin［J］.J.Photochem Photobiol A：Chemistry，2006，179：324－329. ［13］张静，向迅，方婷，等.吲哚美辛与牛血清白蛋白相互作用的光谱研究［J］.化学研究与应用，2011，7（23）：834－839.。
芦丁与人血清白蛋白相互作用的紫外可见光谱特性研究_黄汉昌
收稿日期： 2009-09-09
接受日期： 2010-01-21
基金项目： 北京联合大学应用文理学院科学研究发展基金，北京市
教育委员会科技计划项目资助（ KM201011417002） 。
* 通讯作者 Tel： 86-10-62004534； E-mail： hanchang@ ygi． edu． cn
HSA 荧 光 激 发 光 谱： 配 制 系 列 合 适 浓 度 HSA PBS 溶液，以 320 ～ 190 nm 波长作为激发光源，测定 345 nm 的发射荧光强度。固定 HSA 的含量（ 5． 0 ×
10-8 M） ，制备芦丁与 HSA 不同配比的样品溶液，测 定 320 ～ 190 nm 波长范围的 345 nm 的荧光强度。 比较以上荧光强度的变化。仪器条件： 10 mm 石英 比色池，狭缝宽度 4 nm，100 nm / min 扫描速度，1 s 响应值，扫描 3 次取平均值。
类物质的理化性质及生理活性［7-11］。人血清白蛋白 （ Human Serum Albumin，HSA） 是血浆中含量最丰富 的载体蛋白，是生物活性物质发挥生物效应的重要 载体和靶向分子。本文就芦丁与 HSA 相互作用的 光谱特性进行了研究。
1 实验材料与实验方法
1． 1 仪器与材料 圆二色光谱仪（ JASCO 810，日本分光公司） ； 紫
荧光法研究芦丁-Zn 2+-牛血清白蛋白的相互作用
表 明 ， 芦 丁对 Ｂ Ａ 有 荧光 静 态猝 灭 作 用 ；Ｚ 计 存 在 时 ，不 改 变 芦 丁 对 Ｂ Ａ 内源 荧光 的猝 灭 类 型 ，但使 芦 丁 与 Ｂ Ａ 的 Ｓ ｎ Ｓ Ｓ
表 观 结 合 常 数 ＫＬ增 大 ； 由热 力 学数 据 可 知 芦 丁 和 Ｂ Ａ 分 子 间 以 疏 水 作 用 为 主 ，Ｚ 。 参 与 不 改 变 Ｂ Ａ＿ 丁 分 子 间 Ｂ Ｓ ｎ 的 Ｓ 芦
血清 白蛋 白是血浆 中含 量最 丰富 的重要 载体蛋 白 ，它能 与许 多内源性 和外 源性物 质广 泛结合 ，在 生 命 体 内 起 着 重 要 的 储 存 和 运 输 作 用． 芦 丁
谢 、消化系统 和皮 肤 的正常功 能有 密切关 系 ，它也
是 人体所 含微 量元 素 中除铁 以外含量 最高 的 ，在 一 切组 织器 官 中均存在 ［］ 因此笔 者在 药物一 白质一 ３． 蛋
ｓ ａ ｉ ｕｅ ｈｉ ｇ Ｔｈｅ ｒ ｓ ｎｃ ｏ Ｚｎ ｔ ｔｃ ｑ ｎｃ ｎ ． ｐ ｅ ｅ ｅ ｆ ｄ ｓ ｔ ｈａ ｇｅ ｕｅ ｈｉ ｇ ｙ ｏｅ ｎ’ ｃ ｎ ｑ ｎｃ ｎ ｔ ｐｅ， ｂｕｔ ｈ ａ ａ ｅ ｔ ｓ ｏｃａ ｉ ｎ ｔ ｅ ｐｐ ｒ ｎ ａ ｓ ｉ ｔｏ
ｐ ｒ ｍｅ ｅ ｓ，ｔ ｅ ｍ ａｎ ｂｉ ｄｉ ｏｒ ｅ ｏ ｔｎ ａ Ａ ｓ ｉ ｅ ｔｇ ｔ ｄ ａ ｙｄ ｏ ａ ａ ｔｒ ｈ ｉ ｎ ｎｇ ｆ ｃ ｆＲｕ ｉ ｎｄ ＢＳ ｉ ｎｖ ｓ ｉ ａ ｅ ｓ ｈ ｒ ｐｈｏ ｉ ｎｔ ｒ ｃ ｉ ｎ，ａ ｄ ｔ ｂ ｃ ｉ ｅ ａ ｔｏ ｎ ｈｅ ｐ ｅ ｅ ｃ ｆＺｎ ａ ｓ ｏｅ ｎ’ ｃ ｎｇ ｏ ｃ ｙ ｅ ｒ ｓ ｎ ｅ ｏ ｌｏ ｄ ｓ ｔ ｈａ ｅ ｆ ｒ ｅ ｔ ｐ ． Ｋｅ ｒ ： Ｒｕ ｉ ｂｏ ｉ ｅ ｓ ｒ ｍ ｌ ｍｉ ｙ ｗｏ ｄｓ ｔｎ； ｖ ｎ ｅ ｕ ａ ｂｕ ｎ； Ｚｎ抖 ； ｆｕ ｅ ｃ ｎ ｅ ｓ ｅ ｔ ｏ ｅ ｒ ｌ ｏｒ ｓ ｅ ｃ ｐ ｃ ｒ ｍ ｔ ｙ； ｕ ｔａ ｉ ｌ ｔｓ ｅ ｔ ｏ ｔ ｙ ｌｒ ｒｏ ｅ ｐ ｃ ｒ ｍｅ ｒ
同步荧光光谱法研究叶酸与牛血清白蛋白的相互作用
合Ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ — Ｖｏ ｌ ｍｅ ｒ 方程和热力学方程求 出了热力学参数 、 结合常数及 结合位点数。此外 ， 研 究了常见金属
离子 对 二 者 结 合 有 较 为 显著 的影 响作 用 关键词 ： 荧 光 光谱 ； 紫外 光 谱 ； 叶酸 ； 牛 血 清 白蛋 白
中图 分 类 号 ： Ｏ ６ ５ ７ ． ３ ２ 文献 标 识 码 ： Ａ 文章编 号： １ ０ ０ ８ － ０ ５ ｌ １ （ ２ ０ １ ５ ） ０ １ － ０ ０ １ ４ － ０ ４
的盐酸 溶液 ， 加入 适量 的氯 化钠 溶液 ， 用 盐酸 和氢
氧化 钠 调 节 混 合 溶 液 ｐ Ｈ至 ７ ． ４ ０（ 用 酸 度 计 检
１ 实 验 部 分
１ ． １ 试 剂 与 仪 器
测） ， 最 后用 蒸馏 水 加 至 刻度 处 ， 于 冰箱 ４℃保 存
备用。
１ ． ２． ２ 溶 液 的 配 制
王 珊， 高奕 红 ， 高 丰 琴
（ 咸阳师范学院 化学与化工学院 ， ７ １ ２ ０ ０ ０ ）
摘 要 ： 采 用 紫 外 光谱 法 和 同步 荧 光 光 谱 法 分 析 研 究 了叶 酸 与 牛 血 清 白蛋 白 的相 互 作 用 ， 由 实验 结 果表 明： 叶酸（ Ｆ Ａ） 与 牛 血 清 白蛋 白 （ Ｂ Ｓ Ａ） 之 间具有较 强的结 合作 用而导致 荧光猝 灭； 利 用 实验 数 据 结
科 研 开 发
Ｓ Ｃ Ｉ Ｅ Ｎ Ｃ Ｅ ＆ Ｔ Ｅ Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｌ Ｏ Ｇ Ｙ 化 Ｉ Ｎ 工 Ｃ 科 Ｈ 技 Ｅ ， Ｍ ２ ０ Ｉ Ｃ １ ５ Ａ ， Ｌ ２ ３ Ｉ （ Ｎ １ Ｄ ） Ｕ ： １ Ｓ ４ Ｔ ～ Ｒ １ Ｙ ７
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１ ． ４ 分子荧光光谱测定
第 一 步 ：准 备 ７个 ５ ０ ｍＬ的容 量 瓶并 贴 上 标 签， 先在 每个 容量 瓶里 加入 ５ ｍＬ的 ２ ． Ｏ ｘ ｌ Ｏ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ的 Ｂ Ｓ Ａ溶 液 ， 再加 １ ０ ｍＬ的 ｐ Ｈ ＝ ７ ． ４的缓 冲溶 液 ， 并依
次加 ０ ｍＬ 、 ０ ． ５ ｍ Ｌ 、 １ ｍ Ｌ、 ２ ｍＬ 、 ３ ｍＬ 、 ４ ｍＬ 、 ５ ｍ Ｌ的 ５ ． ０ ｘ
２ ． ２ 不同时间下 Ｂ Ｓ Ａ和芦丁的荧光光谱分析
从表 １看 出 ． 随着 芦 丁 的 浓 度增 加 （ 由０ ｍ Ｌ ～ ５ ｍ Ｌ ） ， Ｂ Ｓ Ａ 的荧 光强 度 由初 始 的 ２ ２ ７ ６ ａ ． Ｕ ．降至最 终 的３ ６ ８ ａ ． Ｕ ． 由此 表 明 ， 芦 丁对 Ｂ Ｓ Ａ有猝 灭 效应 并 随
２ 结果 与 分 析
２ ． １ 不 同浓度的芦丁和 Ｂ Ｓ Ａ的荧光光谱研究
图 ２是 在室温 （ １ ９。 Ｃ） 和 ｐ Ｈ＝ ７ ． ４时得 到 的 Ｂ Ｓ Ａ
在不 同浓 度 芦 丁体 系下 的相互 作 用 的荧 光光 谱 图 ． 从 图 ２可 知 ， 芦丁对 Ｂ Ｓ Ａ的 内源荧 光有 较强 的猝 灭
发． 扫描 不 同浓度 芦丁存 在下 的荧 光光谱．
第二步： 在５ ０ ｍ Ｌ的容量 瓶里 加入 ５ ｍ Ｌ的 ２ ． ０ ｘ
１ ０ ｍｏ ｌ ／ Ｌ的 Ｂ Ｓ Ａ溶 液 ，再 加入 １ ０ ｍ Ｌ的 ｐ Ｈ＝ ７ ． ４的
缓 冲溶液 和 ｌ ｍ Ｌ的 ５ ． ０ ｘ １ ０ － ４ ｍｏ ｌ ／ Ｌ的芦 丁溶 液 ， 最后 用 蒸馏 水 稀 释至 刻度 ， 混合 均 匀后 ， 再以Ｅ ＝ ２ ２ ５ ｎ ｍ 激发 ， 扫描 ０ ｍｉ ｎ、 ５ ｍｉ ｎ、 １ ０ ｍｉ ｎ 、 １ ５ ｍｉ ｎ 、 ２ ０ ｍｉ ｎ 、 ２ ５ ｍ ｉ ｎ 、
ｏ ｔ ｏ １ ． 如 果 是 动 态猝 灭 过 程 ， 那 么由 Ｋ ＝ Ｋ Ｘ ｑ ＂ 。 计 算
可得 Ｋ ＝ ７ ． ４ ９ ４ ｘ １ ０ Ｌ・ ｍ ｏ ｌ ・ Ｓ ～， 而 Ｋ （ ＭＡ Ｘ） ＝ ２ ． ０ ｘ １ ０ Ｌ ／ ｍｏ １ ．由此 证 明 ． 在 １ ９。 Ｃ和 ｐ Ｈ＝ ７ ． ４下 ， 动 态
可读取 数值 ， 如果 数值不 合适 ， 适 当地用磷 酸 氢二钠
或磷 酸二 氢钠调 至 ７ ． ４ ．
图 ２ 不 同 浓 度 的 芦 丁 和 ＢＳ Ａ 相 互 作 用 的 荧 光 光 谱 图
全部 配置 的溶液 均放 于 ｌ ～ ４。 Ｃ的冰 箱 中保 存．
荧 光猝灭 效应 有两种 ，分 别是静 态猝灭 效应 和 动态 猝灭 效应 ． 但 不管 静 态猝 灭效 应还 是 动态 猝 灭
６
由表 ２看 出 ，随着时间的延长 ， Ｂ Ｓ Ａ的荧光强度 从初 始 的 １ ５ ７ ７ ａ ． ｕ ．降 到 最 终 的 ５ ９ ４ ａ ． ｕ ． （ ｔ ＝ ０ ｍ ｉ ｎ ～ ３ ０ ｍｉ ｎ ） ， 由此表 明 ， 芦 丁与 Ｂ Ｓ Ａ结合 的时 间越 长 ， 其
０ ． １ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ的溶液 以备用 ．
着 芦 丁的浓 度增加 而增强 ．
（ ４ ） 用Ｐ Ｂ 一 １ Ｏ赛 多利 斯 ｐ Ｈ精 密 酸 度计 测 量 缓
冲溶 液 的 ｐ Ｈ ． ｐ Ｈ 精 密酸 度 计使 用 前必 须 用标 准 缓
冲溶液 进行 校 准 ，校准完 后 进行 缓 冲溶 液 ｐ Ｈ 的测 量． 在 测 量过 程 中等 待数 值达 到稳 定 出现 “ Ｓ ” 时， 即
猝灭效 应不是芦丁对 Ｂ Ｓ Ａ 的 主要 荧 光猝 灭 方 式 ，
那 么静 态 猝 灭 效应 就是 其 主要 的 ， 根据文献报道 ，
Ｂ Ｓ Ａ荧 光 虽 发 生 了 猝 灭效 应 。但 并 没 有 引 起 Ｂ Ｓ Ａ
的 构象 发生 明显改 变ｌ ．
３ ０ ｍｉ ｎ的荧光 光谱 ．
效应 ． 由此 说 明芦 丁和 Ｂ Ｓ Ａ之 问发 生 了较强 的相 互 作用．
表 ｌ 不 同浓 度 的 芦 丁和 Ｂ Ｓ Ａ的 荧 光 强 度值
图３ １ ９ 。 Ｃ ｐ Ｈ ＝ ７ ． ４条 件下 芦 丁 对 Ｂ Ｓ Ａ荧 光 猝 灭 的
Ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ — Ｖ ｏ ｌ ｍｅ ｒ曲线
第２ １ 卷第 ９期 （ ２ ０ １ ６ ）
党金 宁等 ： 芦丁与牛血清白蛋 白相互作用的荧光光谱研 究
０ ． １ ３ ２ ０ ｇ ，然后 用蒸馏 水溶 解 并在 １ ０ ０ ｍＬ容量 瓶 中 配 制成 ２ ． ０ 平 上分 别 精确 称 取磷 酸 氢 二 钠３ ５ ． ８ ０ ０ ｇ和磷 酸二 氢钠 ３ ． ９ ０ ０ ０ ｇ ， 然 后 用蒸 馏 水 溶 解 并在 １ ０ ０ ０ ｍ Ｌ和 ２ ５ ０ ｍＬ 的 容 量 瓶 中 配 制 成
１ ０ － ４ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ的芦 丁溶 液 ，最 后 用蒸 馏 水稀 释 至刻 度 ， 混 合均 匀并在 室温 下恒温 ５ ０ ａｉ ｒ ｎ ， 再以Ｅ ＝ ２ ２ ５ ｎ ｍ 激
Ｂ Ｓ Ａ荧光猝灭的 Ｓ ｔ ｅ ｍ— Ｖ ｏ ｌ ｍ ｅ ｒ的 曲线 （ 如 图 ３所
示） ．并 由 曲 线 的斜 率 求 得 芦 丁 对 Ｂ Ｓ Ａ在 ｌ ９。 Ｃ 时的 Ｓ ｔ ｅ ｍ— Ｖ ｏ ｌ ｍ ｅ ｒ的 猝 灭 常 数 Ｋ ＝ ７ ． ４ ９ ４ × １ ０ ４ Ｌ ／
效应 ， 其过程 都遵循 Ｓ ｔ ｅ ｍ— Ｖ ｏ ｌ ｍｅ ｒ 方程ｔ ’ ２ １ ， 即：
Ｉ ｄ Ｉ ＝ ｌ ＋ Ｋ Ｃ Ｄ
对 图２中在 ３ ４ ４ ａ ｍ 处 的 各 曲 线 荧 光 强 度 根
据 Ｓ ｔ ｅ ｍ— Ｖ ｏ ｌ ｍ ｅ ｒ 方 程 进 行 处 理 ，绘 制 出 了 芦 丁 对