双水相萃取技术在提取牛血清白蛋白中的应用
牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基。
分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。
其在血液中的主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。
在动物细胞无血清培养中，可起到生理和机械保护作用和载体作用。
目前，石家庄鼎晨科技有限公司致力于研究牛血清白蛋白的溶液标准物质。
此外，纽邦生物科技有限公司也专业提供牛血清白蛋白。
双水相萃取技术主要技术特征是条件温和，两相间界面张力小，生物相容性高，萃取后目标产物的后处理简便，一般不存在有机溶剂残留问题，易于放大工艺，可获得较高收率和纯度，已经在生物化学、细胞生物学以及生物化工等领域得到了广泛的应用。
国内双水相萃取技术在提取牛血清白蛋白中的应用十分广泛。
邓凡政等建立了由亲水性离
子液体四氟硼酸1-甲基-3-丁基咪唑和KH
2PO
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形成的双水相体系萃取分离牛血清白蛋白(BSA)
的新方法，结果表明,磷酸二氢钾盐浓度为80g/L,离子液体浓度在160~240 mL/L,BSA的浓度为30~50 mg/L,溶液酸度在pH 4~8范围,离子液体双水相体系对BSA有较高的萃取率；林潇利用双水相技术萃取牛血清白蛋白回收率为96.90%。
结果表明，此方法回收率、重现性好，且适用于牛血清白蛋白和牛血红蛋白混合样品的检测，为蛋白质分离提取提供了一种新思路；田明玉考察了多种单羟基的短链醇/无机盐双水相体系对牛血清白蛋白的萃取能力。
结果表明，多种体系对牛血清白蛋白都有较好的萃取效果，在磷酸二氢钾18%（W/W）/乙醇18%（W/W）、碳酸钠13%（W/W）/乙醇18%（W/W）时，收率达到最大分别为94.0%、93.6%，此时其分配系数分别为11.52、11.24，这与传统的低分子量聚乙二醇/磷酸氢二钾体系萃取效果相似。
国外在双水相提取牛血清白蛋白中也取得了长足的发展。
LouwrerA用乙醇/磷酸氢二钾体系萃取分离牛血清白蛋白,酪蛋白，核糖核酸酶等蛋白质，实验结果表明：被萃取物在该体系能得到较好的分离，而且部分稳定性较高的蛋白的生物活性得到了很好的保持；E-Kiss等人采用硫酸铵/叔丁醇双水相体系对牛血清白蛋白进行分离提取，结果表明，牛血清白蛋白能保持较高活性沉淀到两相界面处；据外文文献记载，牛血清白蛋白在聚乙二醇/葡聚糖双水相体系中分配特性的研究实验中，结果表明：pH对其影响主要为任一NaCl浓度下，pH=5.0处均出现一波峰。
当pH>7并继续增大时，开始受电位差的影响。
由于BSA所带的负电荷不断增大，在电位差的影响下，聚阴离子不断向上相富集使得分配系数呈向上趋势。
目前，通过市场的调研和实践，证实了双水相萃取牛血清白蛋白的可行性。
石家庄鼎晨科技有限公司应用双水相萃取技术制备的牛血清白蛋白降低了其成本，扩大了生产规模，提高了纯化倍数和相的分离速度，系统经济，成本低且无毒，此技术的大规模应用为社会带来了广大的社会效益。
该公司充分利用双水相萃取技术的作用条件温和，可调节因素多，易于放大和操作的优点来分离提纯牛血清白蛋白，从而达到降低成本，提高产率的目的，这些也是传统工艺所没有的特点。
双水相萃取技术是一种新型液液萃取分离技术，其技术有点很多，譬如，条件温和，工艺易于放大，杂质少，纯度高等。
然而，相关研究和应用还不够深入，一些技术难题还有待解决。
双水相萃取技术的发展趋势为：解决易乳化，相分离时间长，成相聚合物的成本较高，水溶性高聚物粘度较大且不宜定量控制等问题。
开发新型优质的双水相体系，进一步拓宽应用领域，与其他技术结合的多元化利用。
今后，随着对双水相体系研究的深入，双水相萃取将成为一种优良的分离技术。
双水相萃取的原理及应用
中草药成分的提取
03
”
ATPE 的应用
双水相萃取分析 黄毒苷的免疫测定
双水相萃取的应用
双水相萃取的应用
01
ATPE 的应用
02
稀有金属/贵金属分离 克服溶剂萃取法的不足。 在聚乙二醇 2000/硫酸按/偶氮胂（shen四声） ( Ⅲ)双水相体系中 ,实现了 Ti ( Ⅳ)与 Zr（锆gao） ( Ⅳ)的分离
相图:相平衡时物系的组成, 温度与压力的关系
ATPE 的基本原理
系线反映的信息 杠杆规则：系线上各点均为分成组成相同，而体积不同 的两相。两相体积近似服从杠杆规则 性质差异：系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度, 系线越长,两相间的性质差别越大；反之则越小.
ATPE 的基本原理
双水相的特点
分相时间短，自然分相时间一般为5min～15 min。 界面张力小(10-7～ 10-4mN／m)，利于两相之间的质量传递。 不存在有机溶剂残留问题，高聚物不易挥发，对人体无害。
ATPE 的基本原理
双水相的特点 大量杂质可与固体物质一同除去。 易于工艺放大和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理。 操作条件温和，在常温常压下进行。 亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。
ATPE 的历史：
Beijerinck （？？-）
早在1896年,Beijerinck发现,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个混浊不透明的溶液，随之分为两相,上相富含明胶,下相富含琼脂(或淀粉), 这种现象被称为聚合物的不相溶性，从而产生了双水相体系(Aqueous two phase system,ATPS)。
双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。
双水相萃取实验
三. 选择正确的吸出上、下相操作方法：
1. 吸管小心插入下相，吸出下相
换吸管，吸出上相。
2. 吸管小心吸出上相
插入下相，吸出下相。
3. 吸管小心吸出上相 吸出下相。
将多余上相和少量下相弃去
换吸管，
11
生化物质分离纯化基础实验
四. 可调式移液器（枪）正确的操作方法（是非题）： 1. 要吸取0.4ml液体，可用1000 ~ 5000 μl 规格的枪。 2. 向顺时针方向旋，数值减小；逆时针方向旋，数值增
数g
ml
g
纯(NH4)2SO4 累计量 g
溶液累计 总量 g
PEG
%(g/g)
(NH4)2SO4
%(g/g)
1 0.5 2 0.3 3 0.3 4 0.3 5 0.5 6 0.5 7 0.5
5
生化物质分离纯化基础实验
两水相系统中蛋白质分配系数的测定
一. 实验原理
1. 糖化酶为生物大分子蛋白，在双水相系统中不同程度地分配，分配 系数 K = C上/ C下。 相比R = V上/ V下
2. 考马斯亮兰（Coomassie Brilliant Blue G-250） 比色法测定两相中 蛋白质浓度：考马斯亮兰G－250是一种染料，酸性溶液中呈棕红 色。与蛋白质通过范德华键结合成兰色复合物，595nm波长有最大 吸收值。 低浓度时，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。
6
生化物质分离纯化基础实验
1 0.1
g / ml
10
生化物质分离纯化基础实验
● 思考和讨论:
一. 加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇，直至固体全部溶解，原因 是什么？
二. 1. 2.
选择正确的离心操作顺序: 将装有相等体积的两只离心试管(水和样品液)对称放在离心机中。 将两只装有液体的离心试管放入套管中一起称重平衡 对称放在离心机中。
双水相萃取技术的研究现状与应用
基本内容
3、环保领域：双水相萃取技术在废水处理、重金属离子去除等方面具有潜在 应用价值。例如，通过双水相萃取技术成功实现了对含有重金属离子的废水的处 理，降低了废水中的重金属离子浓度。
基本内容
双水相萃取技术的研究方法双水相萃取技术的研究方法主要包括以下内容： 1、影响因素研究：双水相萃取技术的分离效果受到多种因素的影响，如双水 相体系的组成、目标物在双水相体系中的分配系数、实验温度和pH值等。通过对 这些影响因素的研究，可以优化双水相萃取工艺，提高目标物的分离效果。
基本内容
3、双水相萃取技术的设备研发和工艺优化将成为未来的研究重点，以进一步 降低操作成本，提高实际应用中的效率和稳定性。
基本内容
4、双水相萃取技术与其他新兴技术的结合，如微流控技术、纳滤技术等，将 成为未来的一个重要研究方向，以实现更高效、更便捷的分离和纯化过程。
基本内容
结论双水相萃取技术作为一种有效的分离和纯化技术，在食品、制药、环保 等领域已得到广泛应用。通过对该技术的研究和应用，不仅有利于促进相关领域 的技术进步，提高生产效率和产品质量，还有助于推动相关产业的绿色发展，为 实现可持续发展作出贡献。未来，随着科学技术的不断进步和创新，双水相萃取 技术将在更多领域展现其巨大潜力，为人类社会的进步和发展作出更大贡献。
基本内容
展望未来双水相萃取技术在多个领域显示出广泛的应用前景，但仍存在一定 的挑战和问题需要进一步探讨和研究。未来的发展趋势可能包括：
基本内容
1、双水相萃取技术的理论研究将更加深入，以进一步优化双水相体系的组成 和性质，提高目标物的分离效果。
基本内容
2、双水相萃取技术的应用领域将进一步拓展，特别是在新能源、新材料、生 物医药等领域的应用研究将更加活跃。
双水相萃取
介绍你所知道的新型分离技术。
双水相萃取：双水相萃取是两种水溶性不同的聚合物或者一种聚合物和无机盐的混合溶液,在一的浓度下, 体系就会自然分成互不相容的两相。
被分离物质进入双水相体系后由于表面性质电荷间作用和各种作用力(如憎水键、氢键和离子键)等因素的影响, 在两相间的分配系数K 同, 导致其在上下相的浓度不同, 达到分离目的。
现在双水相萃取已被广泛用于蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器等生物产品的分离和纯化，并逐步向工业化生产迈进，展现了在食品工业、生物学研究和生物工程方面的巨大应用前景，将有力推动生物技术的发展。
利用聚乙二醇( PEG ) /磷酸盐双水相体系提取天然发酵物中的碱性木聚糖酶, 确定最佳体系是22% PEG6000, 10% K2HPO4和12% NaCl活性酶的产率可达98% 。
除此以外,在近几年的报道中双水相萃取已用于多种蛋白质和生物酶的分离, 如牛血清蛋白( BSA )、牛酪蛋白、β- 乳球蛋白、血清蛋白; α- 淀粉酶和蛋白酶、胆固醇氧化酶、脂肪酶、磷酸甘油酸激酶( PGK )和磷酸甘油醛脱氢酶( GAPDH )、葡糖淀粉酶、L- 天门冬酰胺酶等都在双水相体系中得到较好的分离。
β- 内酰胺类包括青霉素和头孢菌素, 是应用广泛的抗生素药物; 大环内酯类抗生素如:红霉素和乙酰螺旋霉素都利用ATPE 技术得到了较好的收率; 在多肽类抗生素中,用双水相体系对万古霉素的提取也得到了满意的结果。
双水相萃取技术的特点ATPE 作为一种新型的分离技术, 对生物物质、天然产物、抗生素等的提取、纯化表现出以下优势:(1)含水量高( 70% -90% ), 在接近生理环境的体系中进行萃取, 不会引起生物活性物质失活或变性;(2)可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质, 还能不经过破碎直接提取细胞内酶, 省略了破碎或过滤等步骤;(3)分相时间短, 自然分相时间一般为5 m in -15 m in;(4) 界面张力小( 10- 7 -10- 4mN /m) , 有助于两相之间的质量传递, 界面与试管壁形成的接触角几乎是直角;(5)不存在有机溶剂残留问题, 高聚物一般是不挥发物质, 对人体无害;(6)大量杂质可与固体物质一同除去;(7)易于工艺放大和连续操作,与后续提纯工序可直接相连接,无需进行特殊理;(8)操作条件温和, 整个操作过程在常温常压下进行;(9)亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。
新型绿色分离体系_离子液体双水相及其在生物分离中的应用
新型绿色分离体系———离子液体双水相及其在生物分离中的应用巴晓革, 林锦兴, 邱召法(山东药品食品职业学院,山东威海264210)摘 要:近几年来,离子液体双水相作为一种新型绿色分离体系越来越受到关注。
离子液体双水相具有粘度低、分相快、不易乳化以及对生物物质萃取率高等优点。
介绍了离子液体双水相的机理以及它在生物分离中的一些应用。
关键词:双水相;离子液体;生物分离中图分类号:O 645 文献标识码:A 文章编号:036726358(2007)042240203Aqueous T w o 2phase System Based or I onic Liquids and TheirApplications in BioseparationBA X iao 2ge , LI N Jin 2xing , QI U Zhao 2fa(Shandong Drug and Food Vocational College ,Shandong Weihai 264210,China )Abstract :In recent years ,aqueous tw o 2phase system based ionic liquids are gaining wide recognition as novel ‘greener ’separation systems.Aqueous tw o 2phase system based ionic liquids have s ome unique advantages ,such as lower viscosity ,very quickly phase separation ,not easily emulsification ,as well as g ood extractability for bioproducts.This review presents as accound of s ome of the recent reports on aqueous tw o 2phase system based ionic liquids and Their applications in extraction and separation of bioproducts.K ey w ords :aqueous tw o 2phase ;ionic liquids ;bioseparation收稿日期:2006212213;修回日期:2007202228作者简介:巴晓革,女,副教授,长期从事物理化学教学及科研工作。
双水相萃取技术在提取牛血清白蛋白中的应用
浅谈“双水相技术”在提取牛血清白蛋白中的应用牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。
白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。
白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。
血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。
在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。
目前，石家庄鼎晨科技有限公司致力于研究牛血清白蛋白的溶液标准物质。
此外，深圳纽邦生物科技有限公司也专业提供牛血清白蛋白。
双水相萃取技术的特征：双水相萃取技术条件温和，萃取后目标产物的后处理简便，已经在生物化学、细胞生物学以及生物化工等领域得到了广泛的应用。
双水相萃取技术具有许多其他分离技术没有的优势，是一种具有良好发展前景的生化分离技术。
目前，对于该技术大规模用于生物活性物质的萃取分离还有很多问题需要解决--开发廉价、性能好且无毒的成相聚合物；与其他分离提纯技术有效结合；开展双水相体系基本性质的研究；对双水相体系分离过程进行深入研究[1].(技术简介？？？）双水相萃取技术在国内的研究应用状况:双水相萃取技术最新应用的领域是生物产品的分离，目前已应用于蛋白质，生物酶，菌体细胞以及氨基酸，抗生素等生物小分子物质的分离纯化[2]。
其中双水相萃取技术在提取牛血清白蛋白中的应用十分广泛。
邓凡政等[3]建立了由亲水性离子液体四氟硼酸1-甲基-3-丁基咪唑([Bmim]BF4)和KH2PO4形成的双水相体系萃取分离牛血清白蛋白(BSA)的新方法，结果表明,磷酸二氢钾盐浓度为80 g/L,离子液体浓度在160~240 mL/L,BSA的浓度为30~50 mg/L,溶液酸度在pH 4~8范围,离子液体双水相体系对BSA有较高的萃取率；林潇[4]双水相萃取牛血清白蛋白、牛血红蛋白和溶菌酶的回收率分别为96.90%（RSD=2.8%）97.83%（RSD=2.9%）和97.14%（RSD=2.4%）。
双水相萃取技术在生物活性物质分离中的应用
双水相萃取技术在生物活性物质分离中的应用(华东理工大学化学与分子工程学院,上海200237)摘要：双水相萃取技术作为一种不破坏生物活性的分离手段，一直受到广泛的关注。
本文中，综述了近年来抗生素、酶、蛋白质等生物活性物质的的的双水相萃取方法。
关键词：双水相萃取，生物活性物质The Application of Aqueous Two-Phase Extraction in the Segregation of Bioactive Substance（School of Chemistry and Molecular Engineering, East China University of Scienceand Technology, Shanghai 200237）Abstract:As the separation method does not destroy the biological activity of aqueous two-phaseextraction technology has been subject to widespread concern. This article reviews therecent years, antibiotics, enzymes, proteins and other bioactive substances in theaqueous two-phase extraction method.Keywords: aqueous two-phase extraction, bioactive substance1引言某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统（Aqueous Two-Phase System,ATPS）。
利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质，在1956年, 瑞典的Albertsson首次开发了双水相萃取法（Aqueous Two-Phase Extraction）来提取生物物质，自此对于双水相体系的研究和应用逐步展开, 并取得了一系列研究成果。
萃取在生产生活中的应用
4、膜萃取
1、膜萃取技术简介
膜萃取，又称固定膜界面萃取，是基于非孔膜技术发展起来的一 种样品前处理方法，是膜过程和液液萃取过程相结合的新的分离技术， 其萃取过程与常规萃取过程中的传质、反萃取过程十分相似。因此又 称为微孔膜液液萃取，但与通常的液液萃取过程不同，其传质过程是 分离料液相和溶剂相的微孔膜表面进行的，即在有机溶剂和水溶液相 接触的固定界面层上完成的，故又被称为固定界面层膜萃取，简称膜
传统的提取方法使部分不稳定的 香气成分受热变质，但在超临界条件 下，可以将整个分离过程在常温下进 行，萃取物的主要成分—精油和特征
的呈味成分同时被抽出，并且CO2 无
毒、无残留现象。从洗涤用品、化妆 品中的添加剂到香水，使得植物芳香 成分在精细日用化工中是不可或缺的 一部分。
4.2 食品方面的应用 伴随着人类社会的进步，饮食文化的内 涵不断丰富，人们对食品提出了营养性、方 便性功能性等更多的要求，同时还越来越强 调其安全性。我国食品工业应用超临界萃取 技术已逐步由实验室研究走向产业化，集中 用在脱咖啡因、啤酒花有效成分萃取、植物 油脂的萃取、色素的分离等方面。
了目前最先进的方法。
2、原理
超临界CO2流体萃取（SFE）分离过程的 原理是利用超临界流体的溶解能力与其密度 的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶 解能力的影响而进行的。在超临界状态下， 将超临界流体与待分离的物质接触，使其有 选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大
小的成分依次萃取出来。当然，对应各压力
4.3 超临界萃取技术在医药领域的应用 超临界CO2萃取技术用于中草药有效成分的提取分离是目前医药领域最广 泛的应用之一。目前已有直接利用纯SC-CO2萃取中草药中的活性成分, 涉及的中
草药或天然植物在百种以上。与传统方法相比, 超临界CO2萃取仅需调整很少的
基于PEG和不同盐的双水相体系萃取牛血清白蛋白研究
基于PEG和不同盐的双水相体系萃取牛血清白蛋白研究唐媛;时羽杰;龙晓明;余海萍;邬晓勇【摘要】建立了PEG 4000/NaH2PO4和PEG4000(NH4)2SO4两种双水相体系,比较了两种双水相体系对牛血清白蛋白萃取行为的影响.考察了无机盐种类和浓度、PEG质量分数、牛血清白蛋白浓度等因素对双水相形成以及对牛血清白蛋白分配行为的影响.结果表明PEG 4000/NaH2PO4双水相系统的最佳萃取条件为:PEG4000=11.50％,NaH2PO4=20％,此时K值最小为0.45,达最大回收率.PEG4000/(NH4)2SO4双水相系统最佳萃取条件为:PEC4000=12％,(NH4)2SO4=17.50％,此时K值最小为0.42,达最大回收率.【期刊名称】《成都大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(038)001【总页数】4页(P24-27)【关键词】双水相;萃取;牛血清白蛋白【作者】唐媛;时羽杰;龙晓明;余海萍;邬晓勇【作者单位】成都大学农业农村部杂粮加工重点实验室,四川成都610106;成都大学农业农村部杂粮加工重点实验室,四川成都610106;成都大学药学与生物工程学院,四川成都610106;成都大学药学与生物工程学院,四川成都610106;成都大学农业农村部杂粮加工重点实验室,四川成都610106【正文语种】中文【中图分类】TQ936.21+1;O658.20 引言双水相，即聚合物的不相容性.目前，双水相萃取技术因具有条件温和、容易放大及可连续操作等特点，已在生物物质的分离纯化中得到广泛应用[1-2].研究表明，影响双水相分配系数的因素有很多，包括成相聚合物的相对分子质量、聚合物的浓度、盐的种类与盐的浓度等[3].对此，科研人员对其进行了大量研究，并取得了一系列成果[4-6]，但对不同双水相体系的萃取能力的研究比较少.因此，本实验构建了两种无机盐与PEG4000的双水相体系，通过对牛血清白蛋白的萃取过程的分析得到所建立萃取体系的最佳质量分数，并分析了其最佳萃取条件.1 材料与方法1.1 材料与仪器1.1.1 材料.实验所用材料包括：PEG4000(批号，20160422)、NaH2PO4(批号，20150511)、(NH4)2SO4(批号，2018010501)、考马斯亮蓝G-250(批号，20170522)、0.1 mg/mL牛血清白蛋白(批号，20161206)，均购自成都市科隆化学品有限公司.1.1.2 仪器.实验所用仪器包括：CPA22-D型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，UV-2600A型紫外—可见分光光度计(龙尼柯(上海)仪器有限公司)、IKA VORTEX GENIUS 3型漩涡振荡器(艾卡(广州)仪器设备有限公司).1.2 方法1.2.1 牛血清白蛋白标准曲线.利用文献[7]中的方法制备标准曲线.取6支刻度试管分别加入0.1 mg/mL牛血清白蛋白0.00 、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，用蒸馏水全部稀释至1.0 mL，然后分别加入5.00 mL考马斯亮蓝G-250，立即于595 nm波长处测定吸光度.以标准蛋白浓度为横坐标，相应的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线.1.2.2 PEG4000/NaH2PO4和PEG4000/(NH4)2SO4双水相体系的相图.参考文献[8]中的相关方法制备相图，采用浊点法进行，稍加改动.先配制质量分数为30%的NaH2PO4溶液和(NH4)2SO4溶液并分别测定其密度.精密称取0.2 g PEG4000于大试管中，按文献[8]中的方法依次操作，制作出2条双曲线的相图.为便于计算，每次加水量固定为0.3 mL.之后，以PEG4000的质量分数为纵坐标，分别以NaH2PO4和(NH4)2SO4的质量分数为横坐标作图，制得到2条相图.1.2.3 确定PEG4000/ NaH2PO4与PEG4000/(NH4)2SO4最佳体系.1)确定PEG4000质量分数.根据上述相图，准备14支刻度试管，7支为一组，共2组.一组加入一定量的NaH2PO4，另一组加入(NH4)2SO4，之后分别加入PEG4000，双蒸水定容至10 mL.然后每组分别加入1 mL牛血清白蛋白，摇匀，并静置至分层，分别取各刻度试管上相、下相溶液测蛋白含量.计算出各组的分配系数K，取最小值作为最适PEG4000的质量分数.2)确定NaH2PO4和(NH4)2SO4的质量分数.同上操作，每支试管按照上述确定的PEG4000质量分数，分两组分别梯度加入NaH2PO4和(NH4)2SO4，之后定容至10 mL.每组分别加入1 mL牛血清白蛋白，摇匀，并静置至分层.分别取各刻度试管上相、下相溶液测蛋白含量.计算出各组的分配系数K，取最小值作为最适的两种无机盐的质量分数.1.2.4 蛋白起始浓度对两种双水相系统萃取的影响.设置蛋白浓度最大为3 mg/mL，然后经过稀释，获得6个浓度分别为0.05mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL的系列蛋白溶液.根据上述确定的最佳的PEG4000/NaH2PO4和PEG4000/(NH4)2SO4组合，分别构建6个双水相体系并编号，各刻度试管依序加入各浓度蛋白溶液1 mL，摇匀，并静置至分层，分别取各刻度试管上相、下相溶液测定蛋白含量.同时观察记录上下相体积等，通过计算得到各组的分配系数K和回收率Y上、Y下.1.2.5 双水相体系蛋白质的相关计算公式.1)分配系数.K=C1/C22)相比.R=V1/V23)回收率.Y上=C1V1/(C1V1+C2V2)；Y下=C2V2/(C1V1+C2V2)式中，C1、C2分别为上相、下相中蛋白的总浓度，mol/L；V1、V2分别为上相、下相的体积，mL；Y上、Y下分别为上相、下相的回收率，%.2 结果与分析2.1 牛血清白蛋白标准曲线根据“1.2.1”项下方法所得到的牛血清白蛋白的标准曲线为，Y=0.341 8X-0.013 1，R2=0.995 2.结果表明，蛋白浓度与吸光度间线性关系良好，可以用于后续蛋白含量的测定.2.2 双水相体系的相图根据“1.2.2”项下方法得到PEG4000/NaH2PO4和PEG4000/(NH4)2SO4两种双水相体系的相图如图1所示.图1 两种双水相体系相图从图1可以看出，同样条件下PEG4000/NaH2PO4体系的成相所需浓度要比PEG4000/(NH4)2SO4体系的成相浓度更低.2.3 最佳萃取体系的确定2.3.1 确定PEG4000/NaH2PO4的最佳萃取体系.按照“1.2.3”项下“1)”中的方法，待每支试管萃取平衡后，先读取上、下相的体积，之后分别取上、下相溶液检测蛋白含量，按照公式计算分配系数K，结果见表1.表1 PEG4000/NaH2PO4最佳萃取体系的确定NaH2PO4/%PEG4000/%V1/mLV2/mLKPEG4000/%NaH2PO4/%V1/mLV2/m LK9.502.980.52173.37.60.461037.90.4917.503.27.70.6110.503.27.70.46183.1 7.80.517113.37.60.511.5018.502.980.4911.503.47.50.44192.88.10.47123.57.4 0.4919.502.78.20.4612.503.67.30.49202.68.30.45由表1可知，分配系数K值最小时PEG4000/NaH2PO4体系的最佳PEG4000质量分数11.50%，此时分配系数K值最小为0.44；而最佳NaH2PO4的质量分数20%，此时分配系数K值最小为0.45.因此，PEG4000/NaH2PO4最佳萃取体系为11.5% PEG4000/20% NaH2PO4.2.3.2 确定PEG4000/(NH4)2SO4的最佳萃取体系.同上，待每支试管萃取平衡后，先读取上、下相的体积，之后分别取上、下相溶液检测蛋白含量，按照公式计算分配系数K，结果见表2.表2 PEG4000/(NH4)2SO4最佳萃取体系的确定(NH4)2SO4/%PEG4000/%V1/mLV2/mLKPEG4000/%(NH4)2SO4/%V1/mLV2 /mLK9.502.58.40.64172.980.43102.68.30.617.502.980.4210.502.78.20.55182.88.10.4317112.980.641218.502.78.20.4411.502.980.65192.68.30.441237.90. 5419.502.58.40.4412.503.17.80.63202.48.50.48由表2可知，分配系数K值最小时PEG4000/(NH4)2SO4体系的最佳PEG4000质量分数为12%，此时分配系数K值最小为0.54；而最佳(NH4)2SO4的质量分数17.5%，此时分配系数K值最小为0.42.因此，PEG4000/(NH4)2SO4最佳萃取体系为12%PEG4000/17.5%(NH4)2SO4.2.4 不同浓度牛血清白蛋白在双水相体系中的萃取2.4.1 PEG4000/NaH2PO4体系中牛血清白蛋白的萃取行为.按照“1.2.4”项下的方法，将梯度浓度的蛋白溶液加入到优化后的11.5%PEG4000/20% NaH2PO4体系中，待萃取平衡后，进行测定，结果见表3.表3 不同起始蛋白浓度在11.5% PEG4000/20% NaH2PO4体系中的萃取行为牛血清白蛋白浓度/(mg/mL)V1/mLV2/mLC1/(μg/mL)C2/(μg/mL)KRY上/%Y下/%0.052.68.339.597.30.410.31311.388.70.12.68.346.5103.50.450.31312.387.70.52.68.343.7101.30.430.31311.988.112.68.340.6104.20.390.31310.989.122.68.352.5139.20.380.31310.689.432.68.385.1156.20.540.31314.685.4由表3可得，当牛血清白蛋白浓度为2 mg/mL时，分配系数K值为0.38最小，而下相回收率Y下为89.4%，达到最大.2.4.2 PEG4000/(NH4)2SO4体系中牛血清白蛋白的萃取行为.同上操作，结果见表4.表4 不同起始蛋白浓度在12% PEG4000/17.5% (NH4)2SO4体系中的萃取行为牛血清白蛋白浓度/(mg/mL)V1/mLV2/mLC1/(μg/mL)C2/(μg/mL)KRY上/%Y 下/%0.052.9832.559.50.550.36316.583.50.12.9828.668.60.420.36313.186.90.52 .9838.778.90.490.36315.184.912.9853.395.60.560.36316.883.222.9839.3135.70.290.3639.591.532.9851.2147.10.350.36311.288.8由表4可知，当牛血清白蛋白浓度为2 mg/mL时分配系数K值为0.29最小，而下相回收率Y下=91.5%，达到最大.3 讨论从相图结果可以看出，同样条件下PEG4000/NaH2PO4双水相体系成相所需的PEG4000质量分数和盐的质量分数都比较少，产生这一现象的原因可能是由于两种体系的盐的种类不同，使得两种盐的无机离子在两相中分配系数不同，从而导致两种体系成相的差异[9].萃取蛋白时，上相是PEG4000，蛋白在PEG4000中不易分离；下相是无机盐溶液，萃取蛋白后容易分离纯化，而分配系数K是体现蛋白在上下两相中分配情况的关键，所以取K值最小时，下相中分配蛋白最多，更利于蛋白后续的分离纯化[10].在不同的牛血清白蛋白起始浓度实验中，两种体系相比，可以得出PEG4000/(NH4)2SO4双水相体系的分配系数K更小且回收率Y更高.其原因可能是因为磷酸盐体系中的无机盐NaH2PO4电离出氢离子使得体系的pH值更接近牛血清白蛋白的等电点4.7，从而使得蛋白的带电更少，导致磷酸盐体系的分配系数更大，回收率更小[11].而当两种体系的牛血清白蛋白起始浓度由2 mg/mL升至3 mg/mL后，两种体系的分配系数K值都增大，且回收率变小.这可能是由于蛋白浓度增大使得两相黏度尤其是下相的黏度增加，并且可能会不同程度地扰乱成相系统，使得上下相体积比降低，从而影响蛋白质回收率[12].本研究认为，在PEG4000和NaH2PO4及(NH4)2SO4组成的双水相体系中，两种体系均对牛血清白蛋白有较好的萃取率.本实验结果可为后续利用双水相萃取技术分离纯化活性蛋白提供相关数据.参考文献：【相关文献】[1]田瑞华.生物分离工程[M].北京：科学出版社,2008.[2]辜鹏，谢放华，黄海艳，等.双水相萃取技术的研究现状与应用[J].化工技术与开发,2007,36(11):29-33.[3]谢海.双水相萃取技术研究现状[J].化学工业与工程,2006,23(5):463-466 .[4]郑楠,刘杰.双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究[J].化学与生物工程,2006,23(10):7-9.[5]孙晨,刘广宇,王永亮. 双水相萃取茶叶中茶多酚[J].食品研究与开发,2012,33(8):69-71.[6]刘杨,王雪青，宠广昌，等.双水相萃取法富集分离螺旋藻藻蓝蛋白的研究[J].海洋科学,2008,32(7):30-32，37.[7]苟小军,徐文俊.生物化学实验教程[M].成都：四川科学技术出版社,2009.[8]刘叶青.生物分离工程实验[M].北京：高等教育出版社,2007.[9]谢云飞,常雅宁,谢志镭,等.用双水相体系分离血红蛋白(HB)[J].华东理工大学学报(自然科学版),2010,36(5):685-689.[10]赵新颖,屈锋,董敏,等.双水相萃取结合液相色谱法分离蛋白质[J].分析化学,2012,40(1):38-42.[11]路秀玲,赵东旭,金业涛，等.膨胀床吸附高效纯化牛血红蛋白[J].化工学报,2003,54(9):1257-1263.[12]丁士勇,张家年.牛肉肌红蛋白和血红蛋白稳定性研究[J].食品科学,2006,27(7):93-94.。
分离技术实验
实验一: 双水相萃取牛血清蛋白一.实验目的1.了解双水相系统的成相原理和方法；2.了解制作双水相系统相图的方法，加深对相图的认识；3.掌握双水相溶液配制与双水相萃取的操作；4.掌握分配系数和萃取收率的计算方法。
二. 实验原理双水相系统是由两种互不相溶的聚合物（如聚乙二醇（PEG）与葡聚糖（DX））或者互不相溶的聚合物溶液和盐溶液（如PEG与（NH4）2SO4）组成。
双水相系统的制备一般是将两种溶质分别配制成一定浓度的水溶液，然后将两种溶液按照不同的比例混合，静止一段时间，当两种溶质的浓度超过某一浓度范围时，就会产生两相。
相图是研究双水相萃取的基础，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。
图1是典型的高聚物-高聚物双水相体系的直角坐标相图，两种聚合物A、B 以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成的两相，上相组成用T点表示，下相组成用B点表示，由图1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。
曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。
结线上方是两相区，下方为单相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。
组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。
即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。
又由于两相密度相差很小，故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。
图1 A-B双水相体系相图双水相萃取与有机溶剂萃取原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配原则。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水性、氢键、离子键等）的存在，使得待分离的物质在上、下相中的浓度不同。
对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化的目的。
本实验选择PEG-硫酸铵双水相系统萃取牛血清蛋白。
双缩脲反应是指蛋白质在碱性溶液中与二价铜离子结合生成紫色络合物的反应。
含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应，蛋白质含有多个肽键，因此有双缩脲反应，反应生成物颜色的深浅与蛋白质含量成正比，因此可以利用双缩脲反应进行蛋白质的定量测定。