牛血清白蛋白的提取与鉴定 自主设计实验
牛血清白蛋白实训报告
一、实验目的1. 熟悉牛血清白蛋白的基本性质和提取方法；2. 掌握牛血清白蛋白的鉴定技术；3. 提高实验室操作技能和实验数据分析能力。
二、实验原理牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）是牛血清中的一种球蛋白，具有分子量为66.446KDa，含有607个氨基酸残基，等电点为4.7。
BSA在生物化学、免疫学、细胞生物学等领域具有广泛的应用。
本实验通过提取和鉴定BSA，掌握其基本性质和应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜牛血清、硫酸铵、乙醇、磷酸盐缓冲溶液（PBS）、电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计等；2. 实验试剂：硫酸铵、无水乙醇、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、考马斯亮蓝G-250等。
四、实验方法1. 牛血清白蛋白的提取（1）将新鲜牛血清置于离心管中，加入硫酸铵至终浓度为50%，室温下搅拌30分钟；（2）4℃条件下离心30分钟，收集沉淀；（3）将沉淀用磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤三次，每次洗涤后离心；（4）将洗涤后的沉淀溶于适量PBS，即得BSA溶液。
2. 牛血清白蛋白的鉴定（1）紫外分光光度法：取适量BSA溶液，用紫外分光光度计测定其在280nm处的吸光度值，根据标准曲线计算BSA的浓度；（2）SDS-PAGE电泳：取适量BSA溶液，加入样品缓冲液，进行SDS-PAGE电泳，观察电泳图谱，鉴定BSA。
五、实验结果与分析1. 紫外分光光度法测定BSA浓度根据标准曲线计算，实验组BSA浓度为1.5mg/mL。
2. SDS-PAGE电泳鉴定BSA实验组电泳图谱显示，在分子量约66.4kDa处出现一条明显的蛋白质带，与BSA标准蛋白带位置一致，证明实验组中存在BSA。
六、实验结论1. 成功提取了牛血清白蛋白；2. 通过紫外分光光度法和SDS-PAGE电泳技术对BSA进行了鉴定；3. 本实验掌握了牛血清白蛋白的提取和鉴定方法，为后续实验奠定了基础。
七、实验注意事项1. 实验过程中应严格遵守无菌操作规程，防止污染；2. 在提取BSA时，硫酸铵浓度和搅拌时间应严格控制，以确保提取效率；3. 在鉴定BSA时，应选择合适的检测方法和标准蛋白，以确保鉴定结果的准确性。
牛血清蛋白的提取与鉴定
透析
用两支毛细管分别将标准液及测定液点在同一张醋酸纤维素 薄膜的无光泽面上（划好点样线并作好标记），标准液点一 次，测定液点三次。
点样
将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面向下，点 样端置于阴极，平衡5分钟，开电源160伏60分钟，关闭电源 后用镊子将膜条取出。
电泳
将膜条直接浸于盛有氨基黑10B（萘酚蓝黑）的染料中，染2 分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中 各漂洗5分钟，直至背景漂洗干净为止。
染色
附： PBS（磷酸盐缓冲液）：是磷酸二氢钠和磷酸 氢二钠组成，其中磷酸二氢钠酸性较强。 如果血液中的ph值过高的话，多余的碱就 会与酸磷酸二氢钠结合生成磷酸氢二钠， 反之，过酸时就会与磷酸氢二钠反应产生 磷酸二氢钠，这样ph值就会稳定在一定的 范围内。
实验试剂与器材： 牛血清、PBS缓冲液、饱和硫酸铵、离心机、 试管、小烧杯、离心管、天平、电泳所需 的物件等Fra bibliotek操作流程：
取小 牛血清0.5毫升、PBS液0.5毫升、饱和硫酸铵2.3毫升 充分混匀，静止20分钟，2500转/分离心10分钟。
盐析
取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用 线扎紧上口（注意要留有空隙），放入装有自来水的小烧杯 中透析，要不断振动，每隔2分钟换一次水，共换水15次。
3、透析：穿过膜的选择性扩散过程。可用于 分离分子量大小不同的溶质，低于膜所截留 阈值分子量的物质可扩散穿过膜，高于膜截 留阈值分子量的物质则被保留在半透膜的另 一侧。 4、电泳：带电物质或细胞在电场中的泳动。 根据大分子或颗粒的电荷、大小和形状不同， 使其在通过电场中的凝胶或介质时发生分离 的方法。
设计性试验
牛血清蛋白的提取与鉴定
细胞培养级牛血清白蛋白标准液制作
细胞培养级牛血清白蛋白标准液制作细胞培养级牛血清白蛋白标准液的制作包括以下步骤：
1．称取0.025g结晶牛血清白蛋白，加入蒸馏水溶解后定容至刻度，配制成标准蛋自质溶液。
2．配制系列标准牛血清白蛋白溶液，按照试剂甲和试剂乙的比例混合后比色。
3．绘制标准曲线，按照吸光度为纵标，以牛血清自蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
4．样品测定，称取绿豆芽下胚轴1g，加蒸馏水2m1，匀浆后离心20min，取具塞试管2支，加入上清液lml，混合后比色并记录吸光度。
5．根据吸光度和标准曲线，计算出样品中牛血清白蛋白的含量。
通过以上步骤，就可以制作出细胞培养级牛血清白蛋白标准液。
需要注意的是，操作过程中要注意避免蛋白质变性，如尽量避免高温、强光等。
同时，为了保证标准液的质量和准确性，还需要进行质量检测
和验证，如通过高效液相色谱等技术进行蛋白质分离和纯化，以及通过质谱等技术进行蛋白质定性和定量分析。
牛血清实验报告
0.021
0.020
【实验结果】
取9、10、22、23号试管进行计算，得结果如下：
管号
U
9
10
22
23
蛋白质含量g
97
2.6
2.4
4.2
4
【实验思考与讨论】
本次试验犯的错误真是让人无语，吸光度测出来竟然有负值。原因是什么呢？竟然是做对照实验的比色杯没有擦干净，甚至能看到指纹，导致后来测出的一系列数据的不准。通过此次实验，我明白，做实验一定不能慌，不能急，哪怕别人都走了，我也要坚持做好自己要做的。做实验年一定要细心，注意细节。
DEAE-纤维素是一种应用广泛的阴离子交换剂，它本身带有正电荷，能不同程度地吸附溶液中的阴离子。层析时使用不同强度或不同PH值的缓冲溶液进行分段洗脱，含负电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，含负电荷多的蛋白质后被洗脱下来，于是不同蛋白质被分开。
【实验器材】
1.主要仪器 离心机、透析袋、磁力搅拌器、自动核酸蛋白质分离层析系统、分光光度计、水浴锅。
4.用微量加样器加样时，勿刺破胶面。
【实验结果】
97．4KD
66．2KD
42．7KD
31KD
14．4KD
从左到右加的样品依次是：mark试剂，，9号样品，10号样品，22号样品，23号样品，粗蛋白样品，小牛血清白蛋白样品。由图看，本实验做的还不错，杂质不是很多。
【实验思考与讨论】
1.本次实验没出现操作问题，就是在前期配分离胶和浓缩胶的时候，操作不熟练。
2.第二个做的不好的地方是，上课不认真听老师讲课，听了也不上心。在电脑作图时，中间应该关掉重启软件一次，将前面的杂质峰和后面的白蛋白峰分开。通过此次年实验，我们深刻的意识到，上课一定要认真听老师讲课，因为老师不会讲废话，既然讲了，就一定是实验要注意的重点和细节。所以，以此为鉴，下次认真听讲吧。
牛血清白蛋白的提取与鉴定
第八次实验：牛血清白蛋白的提取与鉴定一、实验名称牛血清白蛋白的提取与鉴定二、实验目的1、掌握盐析法提取牛血清白蛋白2、掌握血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定牛血清白蛋白3、了解用溴甲酚绿鉴定血清蛋白三、实验原理1，蛋白质是水化作用较强的高分子物质，向其加入碱土金属的中性盐类可是蛋白质胶粒脱水并失去电荷，从溶液中沉淀出来。
球蛋白在半饱和的硫酸铵溶液中可析出，而清蛋白则需在饱和的硫酸铵溶液中可析出。
可将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，即可提取白蛋白。
2，利用电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的黏稠度等有关，可对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。
3，血清中的白蛋白与溴甲酚绿在ph=4.2的条件下结合生成绿色化合物，溶液由黄色变为绿色，而球蛋白基本不与之反应，缩短反应时间可去除干扰，其颜色的深浅与白蛋白浓度成正比，可用于鉴定牛血清白蛋白。
四、实验步骤（一）盐析取离心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS磷酸盐缓冲生理盐水稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，充分混匀，然后静止放臵10分钟，再离心（4000r/min）10min，将上清液倾入试管中。
（二）透析取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。
更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化，直至袋内盐分透析完毕。
将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。
（三）BCG法鉴定白蛋白+溴甲酚绿ph=4.2 绿色复合物或（三）电泳鉴定（1）点样取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面距一端1.5㎝处作点样线，将牛血清样品与待测的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位臵点样。
牛血清白蛋白的提取与鉴定实验讨论
一、概述1.1 背景介绍1.2 研究意义1.3 实验目的二、牛血清白蛋白提取实验2.1 实验材料与方法2.1.1 实验材料清单2.1.2 实验步骤2.2 实验结果2.3 实验讨论2.3.1 实验中可能出现的问题 2.3.2 实验结果的解释三、牛血清白蛋白鉴定3.1 实验材料与方法3.1.1 实验材料清单3.1.2 实验步骤3.2 实验结果3.3 实验讨论3.3.1 实验中可能出现的问题 3.3.2 实验结果的解释四、实验结果比较与分析4.1 提取实验和鉴定实验结果的比较4.2 实验结果的可能影响因素4.3 结果分析与讨论五、结论和展望5.1 实验总结5.2 结论5.3 下一步研究方向六、参考文献---在牛血清白蛋白的提取与鉴定实验中，我们希望探讨牛血清白蛋白的提取方法以及鉴定过程中的实验结果和可能的影响因素。
通过该实验，我们可以更好地了解牛血清白蛋白的特性和应用，为进一步研究提供参考和指导。
1.概述1.1背景介绍牛血清白蛋白是一种重要的蛋白质，在生物医学和生物工程领域有着广泛的应用。
其提取和鉴定方法对于研究人员来说至关重要。
1.2研究意义通过对牛血清白蛋白的提取和鉴定实验，可以为相关领域的研究提供重要数据支持，为医学和工程应用提供可靠依据。
1.3实验目的本次实验的主要目的是通过提取和鉴定牛血清白蛋白，验证提取方法的有效性，并探讨鉴定结果的可能影响因素。
2.牛血清白蛋白提取实验2.1实验材料与方法2.1.1实验材料清单- 牛血清样品- 离心管- 超声波破碎机- 离心机2.1.2实验步骤- 将牛血清样品放入离心管中- 使用超声波破碎机进行细胞破碎- 离心离心管，收集上清液作为提取的牛血清白蛋白2.2实验结果实验结果显示，通过超声波破碎和离心的方法，成功提取到了牛血清白蛋白。
2.3实验讨论2.3.1实验中可能出现的问题在超声波破碎过程中，可能会对蛋白质产生热性变性，影响提取效果。
2.3.2实验结果的解释通过超声波破碎和离心的方法，成功提取到了牛血清白蛋白，但可能存在蛋白质的变性情况，需要进一步鉴定确认。
双水相萃取技术在提取牛血清白蛋白中的应用
牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基。
分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。
其在血液中的主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。
在动物细胞无血清培养中，可起到生理和机械保护作用和载体作用。
目前，石家庄鼎晨科技有限公司致力于研究牛血清白蛋白的溶液标准物质。
此外，纽邦生物科技有限公司也专业提供牛血清白蛋白。
双水相萃取技术主要技术特征是条件温和，两相间界面张力小，生物相容性高，萃取后目标产物的后处理简便，一般不存在有机溶剂残留问题，易于放大工艺，可获得较高收率和纯度，已经在生物化学、细胞生物学以及生物化工等领域得到了广泛的应用。
国内双水相萃取技术在提取牛血清白蛋白中的应用十分广泛。
邓凡政等建立了由亲水性离子液体四氟硼酸1-甲基-3-丁基咪唑和KH2PO4形成的双水相体系萃取分离牛血清白蛋白(BSA)的新方法，结果表明,磷酸二氢钾盐浓度为80g/L,离子液体浓度在160~240 mL/L,BSA的浓度为30~50 mg/L,溶液酸度在pH 4~8范围,离子液体双水相体系对BSA有较高的萃取率；林潇利用双水相技术萃取牛血清白蛋白回收率为96.90%。
结果表明，此方法回收率、重现性好，且适用于牛血清白蛋白和牛血红蛋白混合样品的检测，为蛋白质分离提取提供了一种新思路；田明玉考察了多种单羟基的短链醇/无机盐双水相体系对牛血清白蛋白的萃取能力。
结果表明，多种体系对牛血清白蛋白都有较好的萃取效果，在磷酸二氢钾18%（W/W）/乙醇18%（W/W）、碳酸钠13%（W/W）/乙醇18%（W/W）时，收率达到最大分别为94.0%、93.6%，此时其分配系数分别为11.52、11.24，这与传统的低分子量聚乙二醇/磷酸氢二钾体系萃取效果相似。
国外在双水相提取牛血清白蛋白中也取得了长足的发展。
LouwrerA用乙醇/磷酸氢二钾体系萃取分离牛血清白蛋白,酪蛋白，核糖核酸酶等蛋白质，实验结果表明：被萃取物在该体系能得到较好的分离，而且部分稳定性较高的蛋白的生物活性得到了很好的保持；E-Kiss等人采用硫酸铵/叔丁醇双水相体系对牛血清白蛋白进行分离提取，结果表明，牛血清白蛋白能保持较高活性沉淀到两相界面处；据外文文献记载，牛血清白蛋白在聚乙二醇/葡聚糖双水相体系中分配特性的研究实验中，结果表明：pH对其影响主要为任一NaCl浓度下，pH=5.0处均出现一波峰。
双水相萃取牛血清蛋白
双水相萃取牛血清蛋白实验日期：2013年1月8日一、实验目的1、了解双水相系统的成相原理和方法；2、了解制作双水相系统相图的方法，加深对相图的认识；3、掌握双水相溶液配制与双水相萃取的操作；4、掌握分配系数和萃取收率的计算方法。
二、实验原理双水相系统是由两种互不相容的聚合物（如聚乙二醇（PEG）与葡聚糖（DX）或者互不相溶的聚合物溶液和盐溶液（如PEG与（NH4）2SO4）组成）。
双水相系统的制备一般是将两种溶质分别配制成一定浓度的水溶液，然后将两种溶液按照不同的比例混合，静置一段时间，当两中溶质的浓度超过某一浓度范围时，就会产生两相。
相图是研究双水相萃取的基础，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。
双水相萃取与有机溶剂萃取原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配原则。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水性、氢键、离子键等）的存在，使得待分离的物质在上、下相中的浓度不同。
对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化的目的。
本实验选择PEG-硫酸铵双水相系统萃取牛血清蛋白。
利用双缩脲反应进行蛋白质的定量测定。
双缩脲反应是指蛋白质在碱性溶液中与二价铜离子结合生成紫色络合物的反应。
含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应，蛋白质含有多个肽键，因此有双缩脲反应，反应生成物颜色的深浅与蛋白质含量成正比。
三、实验试剂及仪器试剂：50%的PEG2000溶液（w/v），40%的硫酸铵溶液（w/v），牛血清蛋白（10mg/ml），双缩脲试剂仪器：紫外可见分光光度计，电子天平，台式高速离心机，漩涡混合仪，滴定管，大试管，离心试管（20ml）6只，移液管（1ml，5ml），试管（10ml），注射器（10ml）四、实验内容1、PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的测定（1）取50%的PEG2000溶液（w/v）10ml于大试管中。
（2）用40%的硫酸铵溶液（w/v）装入滴定管中，向大试管滴加，并不断在旋涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内液体出现混浊混浊为止，记录硫酸铵消耗的体积。
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自主实验设计
牛血清中白蛋白的提取与鉴定
小组成员：
【目的】
1.通过牛血清白蛋白的提取与鉴定，掌握盐析、离心、电泳、及呈
色反应的原理及应用。
2.通过实验掌握实验的基本操作、原理及为以后的学习打下坚实的
基础。
【原理】
本实验用盐析、离心、透析、电泳及呈色反应来分离、纯化及鉴定牛血清白蛋白。
首先用盐析初步分离，在半饱和硫酸铵溶液中，血清球蛋白沉淀下来，经离心后上清液中含白蛋白。
第二步用玻璃纸利用透析原理通过不断改变膜内外的浓度差让膜内的盐离子不断溢出达到纯化的目的，得到较纯的白蛋白。
第三步利用电泳将蛋白彻底分离。
最后，将其与标准膜一起染色，漂洗，进行对比即可达到鉴定的目的。
【操作】
1盐析
取小牛血清0.5ml+PBS液0.5ml+饱和硫酸铵2.3ml，充分混合均匀，静置20min，2500r/min 离心10min。
2、透析
取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），放入有自来水的小烧杯中透析，要不断震动，每隔2min换一次水，换15次。
放入试管待用。
3、准备与电泳
1）取两条2.5cm x 8.0cm 的膜条，将膜条无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中冲锋浸透。
2）将充分浸透的两条膜条取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以醋纤膜的光泽面距一端1.5cm处作为点样线，并用铅笔在上面编好号①②。
3）用两个点样器分别在标准液和测定液中櫵一下，点样器下端粘上薄层标准液和样液，然后将点样器竖直，进行点样。
4）电泳将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时点样面向下（无光泽面），点样端置于阴极，膜条与滤纸贴紧，待平衡5min后，即可通电。
调节电泳仪，使两极间距的电压为15v/cm，电流0.4~0.6Ma/cm 膜条，通电50分钟关闭电源。
5)通电完毕后，用镊子取出膜条，直接浸于盛有氨基黑10B的染色
液中，染2min取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液中各漂洗5min，直至背景漂净为止。
用干滤纸吸干薄膜。
6）观察两张薄膜的颜色。
【实验材料】
1.器材
电泳仪：包括直流电源整流器和电泳槽两个部分，电泳槽内有两个电极（用铂丝制成）。
培养皿、试管、醋酸纤维素薄膜2张、玻璃纸1张、烧杯、离心机
2.试剂
①PBS（磷酸盐缓冲生理盐水，phosphate buffer saline）用
0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH=7.2）配制撑的0.9%NaCl溶液。
②PH=7.2饱和硫酸铵溶液用浓氨水将饱和硫酸铵溶液调到pH7.2。
③氨基黑10B的染色液：
④巴比妥缓冲液，pH8.6，离子强度0.6：
⑤漂洗液：
⑥牛血清及标准白蛋白样液。
【参考书目】
*《生物化学实验》——上海交通大学出版社，2005版
*《生物化学实验》——中国医药科技出版社，2007版
*《生物化学实验教程》——军事医学科学出版社，2004版
*《生物化学与分子生物学实验教程》——第四拘役大学出版社，2010版。