牛的牛血清白蛋白残留检测酶联免疫分析(ELISA)
ELISA法检测疫苗中残余牛血清蛋白含量的方法学验证
ELISA法检测疫苗中残余牛血清蛋白含量的方法学验证董小曼;田博;杨冰;潘殊男;栗妍;沈淑琴;王晋【期刊名称】《现代仪器与医疗》【年(卷),期】2006(012)006【摘要】为验证ELISA法检测病毒性疫苗中残余牛血清蛋白方法的可靠性,由2个部门对12个样品进行4人连续3天的验证.结果表明:4人连续3天的12次检测结果均满足牛血清白蛋白ELISA法(BSP-ELISA法)标准曲线成立的条件,建立合格标准曲线的成功率为100%;对5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL浓度的牛血清白蛋白(BSP)标准品,不同实验人员间测定结果的变异系数在2.87%～6.33%之间,精密度较好;回收率在92.9%～103.1%之间,说明不同人的测定结果准确度高.分别采用该方法与已上市的牛血清白蛋白试剂盒对7种疫苗中100个样品的残余BSP含量进行检测,二者的检测结果合格符合率为100%,用该方法对已上市的检测BSA试剂盒中的4个标准品进行检测,回收率在90.0%～117.1%,检测灵敏度为2.5ng/mL,表明BSP-ELISA法可以敏感、准确地定量检测BSA,可用于目前我公司疫苗制品中残余牛血清白蛋白的质量控制.【总页数】5页(P21-25)【作者】董小曼;田博;杨冰;潘殊男;栗妍;沈淑琴;王晋【作者单位】北京天坛生物制品股份公司,北京,100024;北京天坛生物制品股份公司,北京,100024;北京天坛生物制品股份公司,北京,100024;北京天坛生物制品股份公司,北京,100024;北京天坛生物制品股份公司,北京,100024;北京天坛生物制品股份公司,北京,100024;北京天坛生物制品股份公司,北京,100024【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.ELISA法检测干细胞溶液中残留牛血清白蛋白含量 [J], 宛莹;聂德志;贲亮;黄若洋2.ELISA法检测组织工程产品中残留牛血清蛋白含量 [J], 方玉;冯晓明;奚廷斐;杜晓丹;陈震3.三种检测猪瘟疫苗中牛血清蛋白含量的ELISA试剂盒的性能对比 [J], 曹玉美;方茜;陆江;孙如水;孙龙4.应用ELISA竞争法检测疫苗制品中残余的牛血清白蛋白 [J], 李长贵;周铁群;王剑锋;邱平5.检测疫苗残余牛血清ELISA试剂的质量控制 [J], 潘殊男;刘保奎因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
品检中的兽药残留检验方法
品检中的兽药残留检验方法兽药残留是指兽药在兽体内或畜禽产品中残留的化学物质。
合理使用兽药可以预防和治疗动物疾病，提高畜禽养殖效益。
然而，如果兽药残留超过安全标准，可能对消费者健康造成潜在风险。
因此，兽药残留的检验方法在品检中显得尤为重要。
兽药残留检验方法是确定畜产品中兽药残留水平的关键步骤。
本文将介绍一些常用的兽药残留检验方法，并讨论其原理和应用。
高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）是目前应用广泛的兽药残留检验方法之一。
该方法基于高效液相色谱（HPLC）和质谱联用仪（MS），通过对样品进行分离和定性分析，可以快速、准确地检测多种兽药残留物。
HPLC-MS方法具有高选择性、高灵敏度和高分辨率的特点，适用于不同类型的兽药残留物检测。
酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种基于免疫学原理的兽药残留检测方法。
该方法利用特异性抗体与兽药残留物结合，形成特异性抗原-抗体复合物，并通过酶作用产生颜色反应，从而定量检测兽药残留物的含量。
ELISA方法具有简单、快速、便捷的特点，适用于大规模的兽药残留检测。
气相色谱-质谱联用法（GC-MS）也是常用的兽药残留检验方法之一。
该方法利用气相色谱和质谱联用仪对样品进行分离和定性分析，可以检测挥发性兽药残留物和半挥发性兽药残留物。
GC-MS方法具有高分辨率、高灵敏度和高准确性的特点，适用于多种兽药残留物的分析。
快速液相色谱法（UPLC）也是兽药残留分析中常用的检测方法之一。
与传统的液相色谱相比，UPLC具有更高的分离效率、更短的分析时间和更低的溶剂消耗量。
因此，UPLC是一种高效、准确和经济的兽药残留检验方法。
综上所述，兽药残留检验方法在品检中起着重要的作用。
通过合理选择和应用适当的检验方法，可以快速、准确地检测畜产品中的兽药残留物。
这有助于确保畜产品的质量安全，保护消费者的健康。
未来，随着科技的进步，兽药残留检验方法还会不断发展和完善，以应对不断变化的兽药种类和畜产品需求。
ELISA法检测疫苗中牛血清残留量的适用性研究
收稿日期:2006-01-23;修回日期:2006-04-06作者简介:潘殊男(1974-),男,硕士,助理研究员,主要从事检测方法研究。
E L I S A 法检测疫苗中牛血清残留量的适用性研究潘殊男,杨冰,刘保奎,董小曼(北京天坛生物制品股份有限公司,北京100024)摘 要:为了验证E L I S A 法对病毒性疫苗中残余牛血清蛋白检测的适用性,用牛血清蛋白E L I S A 测定法与牛血清白蛋白E L I S A 测定法、牛血清I g G -E L I S A 测定法对麻疹疫苗、风疹疫苗、腮腺炎疫苗洗涤前病毒培养液、洗涤后病毒收获液以及多种成品疫苗中的残余牛血清蛋白含量进行了测定。
结果显示,麻疹疫苗、风疹疫苗、腮腺炎疫苗洗涤前病毒培养液中牛血清白蛋白含量依次为I g G 含量的70.5倍、65倍、84.3倍,洗涤后病毒收获液中两者比值分别为4.2、1.8和8.1;牛血清白蛋白E L I S A 法和牛血清蛋白E L I S A 法均能检测出疫苗中牛血清白蛋白,但前者测不出牛血清I g G ,而后者可准确检测牛血清I g G 。
牛血清蛋白E L I S A 测定法可同时检测牛血清白蛋白和牛血清I g G ,更适用于疫苗残余牛血清蛋白含量的测定。
关键词:牛血清;E L I S A ;适用性中图分类号:R 446.61文献标识码:A文章编号:1005-5673(2006)03-0023-04I n v e s t i g a t i o no na p p l i c a b i l i t y o f E L I S Ai nd e t e c t i o no f r e s i d u a l b o v i n e s e r u m c o n t e n t s i nv i r a l v a c c i n e s P A NS h u -n a n ,Y A N GB i n g ,L I UB a o -k u i ,e t a l .(B e i j i n gT i a n T a nB i o l o g i c a l P r o d u c t s C o .,L T D ,100024,C h i n a )A b s t r a c t :T o v a l i d a t e t h e a p p l i c a b i l i t y o f E L I S Ai nd e t e c t i o n o f r e s i d u a l b o v i n e s e r u mc o n t e n t s i n s o m e v i r u s v a c c i n e s ,b y w h i c hi n c l u d e d m e a s u r e m e n t o f r e s i d u a l p r o t e i n s f r o m b o v i n e s e r u m i nc u l t u r e s b e f o r e w a s h i n g a n dh a r v e s t e d c u l t u r e s a f t e r w a s h i n g i n p r e p a r a t i o no f v a c c i n e s f o r m e a s l e s ,m u m p s a n d r u b e l l a .T h r e e k i n d s o f E L I S Am e t h o d s c o u l d b e u s e d i nd e t e c -t i o no f b o v i n e s e r u mp r o t e i n s ,b o v i n e s e r u ma l b u m i n a n d b o v i n e I g Gr e s p e c t i v e l y .T h e r e s i d u a l c o n t e n t s o f b o v i n e s e r u ma l -b u m i n a r e 70.5、65a n d 84.3f o l d s a s t h o s eo f b o v i n e I g Gi n v i r u s c u l t u r e s b e f o r ew a s h i n gi nm e a s l e s ,m u m p s a n dr u b e l l a v a c c i n e s ,w h e r e a s a f t e r w a s h i n g i nh a r v e s t e d c u l t u r e s t h e r a t i o s o f b o t ho f t h e ma r e r e d u c e d t o 4.2,1.8a n d 8.1f o l d s r e -s p e c t i v e l y .B o v i n e s e r u mp r o t e i n s -E L I S Ac a nb e u s e di nd e t e c t i o no f B S Aa n db o v i n eI g G i nah i g h l y s e n s i t i v ew a y ,b u t B S A -E L I S A i s o n l y c o n d u c t e d o n d e t e r m i n a t i o n o f B S A .T h e f o r m e r i s m o s t a p p l i c a b l e t h a n t h e o t h e r t w o o n d e t e c t i n g r e s i d -u a l b o v i n e s e r u m a l l e r g e n si nv i r u s v a c c i n e s ,b e c a u s eB S A a n db o v i n eI g G a r eb o t hp r i m a r yr e s i d u a l a l l e r g e n si nt h e s e p r e p a r a t i o n s .K e yw o r d s :B o v i n e s e r u m ;E L I S A ;A p p l i c a b i l i t y 《中国生物制品规程》2000年版规定,疫苗中残余的牛血清蛋白残留量不得超过50n g /m l 〔1〕。
ELISA法检测组织工程产品中残留牛血清蛋白含量
论著 ・
Ｅ ＩＡ ＬＳ 法检测 组织工程产 品 中 残 留牛 血 清 蛋 白含 量
方玉 冯晓 明 奚廷 斐 陈震 杜 晓丹
【 要 】 目的 摘
探 讨 定 量 检 测 牛 血清 白蛋 白 （ ｕ ｅｕ ｌｕ ｎ Ｂ Ａ） Ｂ ｌｓｒｍ ａ ｍｉ，Ｓ 酶联 免 疫 试 剂 盒 用 于 组 织 工 程 医疗 产 品 （ ｄｃｌ ｌ ｂ Ｍｅｉ ａ
明 显减 少 。 论 （ ） 试 剂 盒 适 用 于 组织 工程 医疗 产 品 中 Ｂ Ａ残 留量 的 检测 。 ２ 对 于 组织 工 程 医疗 产 品 而 言 ， 同的 结 １该 Ｓ （） 不 清洗 程 序 对 Ｂ Ａ 的残 留量 有 非 常 明 显 的影 响 。生 产 商 应 根 据其 预期 用 途 制 定 有 效 的 清 洗 程序 ， 在 说 明 书 中给 予 足 够 Ｓ 并
牛弹性蛋白酶(Elastase)酶联免疫分析
牛弹性蛋白酶（Elastase）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定牛血清，血浆及相关液体样本中弹性蛋白酶（Elastase）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛弹性蛋白酶（Elastase）水平。
用纯化的牛弹性蛋白酶（Elastase）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入弹性蛋白酶（Elastase），再与HRP标记的弹性蛋白酶（Elastase）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的弹性蛋白酶（Elastase）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中牛弹性蛋白酶（Elastase）浓度。
样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
酶联免疫吸附试验(ELISA)基本原理
SOP_13-1 酶联免疫吸附试验（ELISA）基本原理与注意事项一、基本原理1、包被1.1、固相载体的要求（1）、结合抗体或抗原的容量大（2）、抗体或抗原牢固地固定在其表面（3）、不影响免疫反应性（4）、利于反应充分进行（5）、固相方法简便易行，快速经济1.2、固相载体的材料：聚笨乙烯1.3、包被coating将抗原或抗体结合于固相载体。
1.4、封闭blocking用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附。
2、反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体。
标记酶的要求：(1)、活性高(2)、性质稳定(3)、专一性强(4)、酶催化底物的显色信号易于判断和测量(5)、方法敏感，重复性好，简单易行(6)、酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉常用酶辣根过氧化物酶HRP（ELISA中应用最为广泛的标记用酶）3、洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离。
4、底物显色HRPDH2+H2O2—————→D+2H2OH2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高。
供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种。
常用底物：四甲基联苯胺TMB四甲基联苯胺TMB是ELISA中应用最广泛的底物。
TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性。
二、常用方法与原理1、双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等2、双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似双抗体夹心法应用：乙型肝炎表面抗体3、竞争法（测抗原）方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。
加底物显色。
应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）4、竞争法（测抗体）原理：类似检测抗原的竞争法应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测5、间接法方法：用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。
酶联免疫分析技术在兽药残留检测中的应用
量越大 、 分子 结构 越复 杂则 免疫 原性 越强 。 兽药 大多
应， 生成抗体 （ 抗原 ） 一 待测抗原（ 抗体） 一 酶标记抗体 是 小 分子 物 质 。 属 于半 抗 原 ． 因此通 常要 与 分子 量较 成有色产物 ． 待测抗原 （ 抗体 ） 的定量与有色产物量 大的载体 （ 一般 为蛋 白质 ） 偶联 ， 形成兽药——载体 蛋白结合物免疫原 ， 即形成完全抗原 。 相同大小 的分
测试手段相结合而建立 的一种超微量 的测定技术 。 目 前 已广泛应用于临床医学 、兽医学 、生物学等领 域。Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ检测技术具有操作简单 、 前处理简化 、 检 测快速 、 准确 、 敏感 、 成本 低 、 容量大 ， 并 可 同时进 行
大批 量样 品检测 等优 点 ．这种 学 科交 叉 技术 正逐 渐 成 为兽药 残 留检 测 的一个 热点
０ｃ ｔ ｏ ｂ ｅ ｒ ２ ０ １ ３
酶联免疫分析技术在兽药残留检测中的应用
张泽 英
（ 武汉生物工程学 院食 品工程 系， 武汉 ４ ３ ０ ４ １ ５ ）
摘要： 介 绍 了酶联 免疫吸 附分析方 法的原理、 类型以及在兽 药残 留检 测 中的关键技 术环节和 国 内外应用现状 ， 讨论 了酶联免疫吸 附分析技术应 用于兽 药残 留检测所存在 的问题和发展前景 。
湖 北 畜 牧 兽 医
要 环节 理想 的免 疫半 抗原 一方 面 应尽量 具备 与待 测 物有类 似 的化学 特征 ．另 一方 面 与载体 连接 后应 尽 量保 证该 特征结 构 最大 程度 地被免 疫 活性 细胞识
隔臂 ” ） ， 目前 大多数 学者 认 为 ． 较适 宜 的间 隔臂 长度 为４ － ６个 碳 链 长 度 （ ０ ． ５ ～ ０ ． ８ ｎ ｍ） ． 能较 好 的 突 出与
牛的牛血清白蛋白残留检测酶联免疫分析(ELISA)
牛的牛血清白蛋白残留检测酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定牛血清，血浆及相关液体样本中类牛血清白蛋白残留检测的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛的牛血清白蛋白残留检测水平。
用纯化的牛的牛血清白蛋白残留检测抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入类牛血清白蛋白残留检测，再与HRP标记的类牛血清白蛋白残留检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的类牛血清白蛋白残留检测呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中牛的牛血清白蛋白残留检测浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存标准品：2700ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
牛血清白蛋白残留量测定
附录VIII F 牛血清白蛋白残留量测定法
本法系用酶联免疫法测定供试品中牛血清白蛋白（BSA）含量量，以判断供试品中BSA残残留量是否符合规定的检测方法。
以牛血清白蛋白标准品为标准，采用直线回归方法计算供试品中牛血清白蛋白含量。
供试品溶液的制备供试品如为冻干剂型，检测前应按标示量复溶后震荡混匀，室温静置30分钟，检测前应再次震荡混匀。
供试品如为液体剂型可直接用于检测。
采用试剂盒提供的供试品稀释液稀释供试品，供试品应至少进行两个稀释度测定，每个稀释度做双孔平行测定。
测定BSA含量的容器具应专用，防止实验室中BSA污染。
干扰试验制备溶液A（供试品溶液倍比稀释）、B（供试品溶液和30ng/ml 的内控标准品等量混合）和C（30ng/ml的内控标准品倍比稀释）。
其中，供试品溶液BSA含量高于试剂盒测定范围中点时，两倍稀释后制备溶液A和B。
溶液A、B可倍比稀释测定，溶液C应多孔测定，并在试验间均匀添加。
测定法按试剂盒说明书进行。
试剂盒标准品的吸光度值（A值）、内控参考品测定值、标准品线性相关系数、双孔测定吸光度值（A值）均应在试剂盒要求范围内，试验有效。
以试剂盒提供的标准品吸光度值（A值）和浓度制定标准曲线，根据供试品的A值计算供试品中BSA含量，按试剂盒说明书要求判定最终结果。
供试品测定时，低稀释度A值明显低于高稀释度A值时可能存在HOOK效应或操作失误，需重试或调整稀释倍数进行检测。
首次应用该试剂盒的供试品应进行干扰试验。
干扰试验中B－A值应在C值测定的95％可信区间内。
牛血清白蛋白
牛血清白蛋白1. 引言牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，简称BSA）是一种来源于牛血浆的重要蛋白质。
BSA在生命科学研究、药物开发和生物技术等领域具有广泛的应用。
本文将介绍牛血清白蛋白的物理特性、生化功能以及常见的应用领域。
2. 物理特性2.1 分子结构牛血清白蛋白是一种单链蛋白质，由583个氨基酸残基组成。
其分子量约为66.5 kDa。
BSA的分子结构是球状的，具有3个域，其中一个是脂肪酸结合域。
BSA的最大吸收波长为280 nm。
2.2 热稳定性BSA在不同温度下的热稳定性是其广泛应用的重要特点之一。
通常情况下，BSA可以在室温下稳定存储。
当温度升高时，BSA的热稳定性会降低。
3. 生化功能3.1 结合能力BSA具有结合能力，可以与多种物质发生特异性的结合作用。
例如，BSA可以结合药物、脂肪酸、金属离子等。
这种结合能力可以用于药物输送系统的设计和生物分离技术的开发。
3.2 缓冲作用BSA可以作为缓冲液中的稳定剂，维持溶液的pH值在一定范围内。
BSA具有良好的缓冲性能，可以稳定酶和其他蛋白质在实验过程中的活性。
3.3 抗氧化性BSA具有抗氧化性，可以中和自由基和氧化物质，减少氧化应激对细胞和组织的损害。
这种性质使得BSA可以应用于抗氧化剂的研究和开发。
4. 应用领域4.1 细胞培养BSA在细胞培养基中起到重要的作用。
它可以提供细胞所需的营养物质和能量，促进细胞的生长和增殖。
同时，BSA还可以在细胞培养过程中稳定细胞的内环境，提高细胞培养的成功率。
4.2 免疫学研究BSA在免疫学研究中常被用作抗原或抗体的稀释剂和扩增剂。
它可以提供稳定的背景信号，并促进抗原与抗体的结合反应。
此外，BSA还可用于免疫印迹、酶联免疫吸附试验等实验技术。
4.3 生物分离技术BSA在生物分离技术中广泛应用。
例如，利用BSA的结合能力，可以将目标分子从混合物中特异性地吸附到BSA固相材料上，实现目标分子的纯化和富集。
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牛的牛血清白蛋白残留检测酶联免疫分析（ELISA）
试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用
目的：本试剂盒用于测定牛血清，血浆及相关液体样本中类牛血清白蛋白残留检测的含量。
实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛的牛血清白蛋白残留检测水平。
用纯化的牛的牛血清白蛋白残留检测抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入类牛血清白蛋白残留检测，再与HRP标记的类牛血清白蛋白残留检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的类牛血清白蛋白残留检测呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中牛的牛血清白蛋白残留检测浓度。
试剂盒组成：
试剂盒组成48孔配置96孔配置保存
说明书1份1份
封板膜2片（48）2片（96）
密封袋1个1个
酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存
标准品：2700ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存
样本处理及要求：
1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上
清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心
20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程
中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/
分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备
用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上
进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标
准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。
（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为1800ng/L，1200ng/L ，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样
品孔。
在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
15分钟.
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止
液后15分钟以内进行。
注意事项：
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值
大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
试剂盒性能：
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。
2.批内与批见应分别小于9%和11%
检测范围：
100ng/L -2000ng/L
保存条件及有效期：
1.试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月。