牛血清白蛋白残留量测定
ELISA法检测干细胞溶液中残留牛血清白蛋白含量
［ １ Ｏ ］ ＨＯＮＭＡ Ｔ． Ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ｏ ｆ ｈ ｙ ｐ ｅ ｒ ｔ ｈ ｅ ｒ ｍｉ ａ — ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ａ ｐ ｏ ｐ ｔ ｏ ｔ ｉ ｃ
ｃ ｅ ｌ ｌ ｄ ｅ ａ ｔ ｈ［ Ｊ ］ ． Ｎｉ ｐ ｐ ｏ ｎ ｒ ｉ ｎ ｓ ｈ ｏ Ｊ ａ ｐ ａ ｎ ｅ ｓ ｅ ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ ｍｅ ｄ ｉ
Ｃｈ ｉ ｎ Ｊ Ｌａ ｂ Ｄｉ ａ ｇ ｎ， Ｏｃ ｔ ｏ ｂ ｅ ｒ ， ２ ０ １ ３， Ｖｏ ｌ １ ７ ， Ｎｏ ． １ ０
２ ０ ０６ ， ９ ８（ ２） ： ３ ５ ６ ．
［ ９ ］ Ｓ ｈ ａ ｒ ｉ ｆ — Ｋｈ ａ ｔ ｉ ｂ ｉ Ｌ， Ｋａ ｒ ｉ ｍｉ ｎ ｉ ａ Ａ， Ｋｈ ｏ ｅ ｉ Ｓ， ｅ ｔ ａ １ ． Ｈｙ ｐ ｅ ｒ ｔ ｈ ｅ ｒ ｍｉ ａ ｉ ｎ
Ｅ ４ ３ 曹智刚 ， 郭启 勇， 马
的影响Ｉ － Ｊ ３ ． 中 国 医 学 影像 技 术 ， ２ ０ ０ ６ ， ２ （ ０ ０ ６ ） ： ８ ０ ４ ． Ｅ ｓ ］ 陈声池 ， 张长其， 陈 映雪 ． 热 疗 联 合 长 春 瑞 滨 和 顺 铂 方 案 治 疗 晚 期 非小细胞肺癌 临床 疗 效 观察 ［ Ｊ ］ ．中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 １ ］ 汤
睿， 朱正纲 ， 瞿
颖， 等． 温 热 体 外 对 人 胃癌 细 胞 株 生 物 学 行
为的影响［ Ｊ ］ ． 世界华人消化杂志 ， ２ ０ ０ ６ ， １ ４ （ ２ ） ： １ ４ ４ ． ［ １ ２ ］ 崔 玉芳 ， 夏 国伟 ， 付小兵， 等． Ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｈ ｉ ｐ ｂ ｅ ｔ ｗｅ ｅ ｎ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｂ ａ ｘ
狂犬病毒基础知识与生产工艺
潜伏期
一般 20 – 60 天
从暴露后数天到数年，差别非常大
主要的影响因素
感染的病毒数量 感染的病毒株 暴露的严重程度 暴露的部位
41.87%
• 一般20 - 60天 • 1月内发病71% • 3月内发病87%
25.88%
3.25%
16.12% 3.25%3.25%6.38%
7-10 10-20 21-28 1-3 3-6 6-12
效价测定
热稳定性试验
牛血清白蛋白残留量
抗生素残留量
地鼠肾细胞蛋白质残留量
无菌检查
异常毒性检查
细菌内毒素检查
纯化
半成品配制 分装 目检 包装 入库 销售
C+A（病毒制备区）
aG病毒工作种子批
蛋白质含量 无菌检查
蛋白质含量 抗原含量 无菌检查
细菌内毒素检查 地鼠肾细胞蛋白质
残留量检测
控制区
B+A（灌装 区）
狂犬病毒的宿主动物
野生动物及家畜是狂犬病的传染源。人类狂犬病由狗、猫直接传染者占90%以上，其次为牛（主要 是水牛）、猪、兔、马、驴骡以及野生动物。
狂犬病致病机理
通过神经进入分泌腺体： 在唾液中排出病毒
进入大脑细胞引起全脑炎 在神经系统中向心性移动 通过肌肉周围神经末梢进入神经系统 病毒在伤口周围肌肉细胞中复制 被动物咬伤而感染病毒
鉴别试验 病毒滴定 无菌检查 支原体检查 病毒外源因子检查
毒种制备工艺：
原始种子（3aG4）→豚鼠脑内传代（3aG 5） →地鼠肾细胞传代（4aG ）→豚鼠脑内传2 代（ 4aG2）→建立主代毒种库
主代毒种库（ 4aG2）→豚鼠脑内传1代 （ 4aG3） →建立主工作毒种库
组织工程医疗产品中残留牛血清白蛋白的检验常见问题
ＮａｔｉｏｎａＩ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ ｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，
Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００５０，
Ｃ ｈｉｎａ
Ｆａ ｎ ｇ Ｙｕ★ ． Ｍａｓｔｅｒ，
Ｓｅｎｉｏｒ
ｅｎｇｉｎｅｅｒ，
Ｎａｔｉｏｎａｌ ｌｎｓｆ ｉｔｕｔｅ ｆｏｒ
０ 引言
随着组织工程技 术逐渐成熟 ，其在组织损 伤修 复 方 面 巨大的应用 潜 力使 得越 来越 多 的 研究人 员不再仅仅 满足 于理论及 实验研究，而 是将 目光投 向 了科研成果 的产业化 ，因此 陆续 有一些组 织工程 医疗产品应运 而生。胎牛血清 既是 大多数组 织工程 医疗产 品生产 中种 子 细 胞培养和扩增 时培 养液 的重要 组分 ，也是许 多 组织工程 医疗产品保存液 中的必要组 分。随组 织工程 医疗产 品进入人 体 的残 留 的牛血 清成 分作 为异种 来源的蛋 白，可能引发机体的免疫 反应 ［１４］。因此，组 织＿Ｔ－程 医疗产品 中的牛血 清 残 留量必须得到严格的控制 。牛血清 白蛋 白是 牛血 清 中的主要成分 （为３５～５０ ｇ／Ｌ），检测残 留牛血 清 白蛋 白的含 量在 一定程 度上 可 以反 映组 织工程 医疗产品 中牛血 清的残留量，因此 成为这 类产 品质 量控制 以及 安全性 评估 的 重 要指标 以及产 品标准 中的重要 组成部 分。
摘 要 ：胎牛血清既 是大多数组织工程 医疗产 品生产 中种子细胞培养和扩 增时培养液 的重要组分 ，也是许 多组织工程医疗 产 品保 存液中 的必要组 分之一 。为降低 残留牛血清 成分可能 引发的免疫反应 ，牛血清 白蛋 白残留量的检测 已成为这类产 品的质 量控制 以及风 险评估 的重要 指标 。文章简要 介绍 了牛血清 白蛋 白残 留量 的检测方法 。根据 以往对这类 产 品注册检 验 中积 累的经验 以及 发现的 问题 ，为保证组织工程 医疗产 品中牛血清 白蛋白的有效清除 以及 检测 结果的准确 性及可重 复 性 提 出 了 相 应 的 建 议 。 关键词 ：组织工程医疗产 品；残留牛血清 白蛋 白；注册标准 ；Ｈｏｏｋ效应；干扰物质
细胞培养基质量标准及检验方法
细胞培养基质量标准及检验方法中国医药生物技术协会二0一一年四月编写说明一、根据中国医药生物技术协会2010年9月20日组织召开的《动物细胞培养基生产管理及质量控制学术研讨会》纪要，结合我国的实际情况制定本标准。
二、本标准以《中国药典》2010版和《哺乳类动物细胞培养基》（HG/T 3935-2007）行业标准为依据，结合生物制品对细胞培养基原材料的特殊要求制定，增加了牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量等检测项目。
三、本标准分为细胞培养基检验项目和每个项目的检验方法两部分，为评判细胞培养基产品质量提供了依据和方法，从而规范我国细胞培养基行业健康发展。
四、结果评定依据本标准和方法对细胞培养基样品进行全项检验，所有项目均符合标准要求，判定该样品为合格；若有一项不符合标准要求，则判定样品为不合格。
细胞培养基质量标准及检验方法一、细胞培养基质量标准细胞培养基质量应符合表1所示的技术要求。
表1 技术要求二、检验方法除非另有说明，检验中仅使用确认为分析纯的试剂和中华人民共和国药典2010年版中规定的纯化水。
澄清度的测定称取每升标示量的实验室样品，置于1 000ml烧杯中，加水950ml，搅拌至溶解，补加水至1000ml, 搅拌均匀。
按中华人民共和国药典2010年版二部附录Ⅸ B进行。
pH值的测定称取每升标示量的实验室样品，置于1 000ml烧杯中，加水950ml，搅拌至溶解，补加水至1000ml, 搅拌均匀。
按中华人民共和国药典2010年版三部附录ⅤA进行。
干燥减量的测定按中华人民共和国药典2010年版三部附录Ⅶ L 干燥失重测定法进行。
渗透压的测定称取每升标示量的实验室样品，置于1 000ml烧杯中，加水950ml，搅拌至溶解，补加水至1000ml, 搅拌均匀。
按中华人民共和国药典2010年版三部附录ⅤH渗透压摩尔浓度测定法进行。
取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的5%。
牛血清白蛋白的提取与鉴定自主设计实验
牛血清白蛋白的提取与鉴定自主设计实验实验目的：本实验的目的是通过自主设计实验，探究牛血清中白蛋白的提取和鉴定方法。
实验原理：牛血清中的白蛋白是一种重要的血浆蛋白，提取牛血清白蛋白一般采用碳酸铵沉淀法。
实验步骤：1.首先，将牛血液收集到干净的离心管中，然后离心10分钟，以分离血浆和红细胞。
2.将分离得到的血浆转移至一个新的离心管中，并加入2mL的碳酸铵溶液，充分混合。
3.将混合液在4℃下孵育30分钟，然后在3000g下离心20分钟。
4.倒掉上清液，得到沉淀。
5.使用0.9%的氯化钠溶液将沉淀洗涤3次，每次离心10分钟。
6.吸去上清液，将沉淀溶解在适量的生理盐水中，得到白蛋白溶液。
鉴定牛血清白蛋白的方法有很多，这里我们以SDS-电泳为例进行鉴定：1. 准备1.5mm厚度的10%分离凝胶和4%集中凝胶。
2.将提取得到的牛血清白蛋白样品和已知浓度的蛋白标准品分别加入适量的2×样品缓冲液，进行蛋白样品的变性处理。
将样品在100℃水浴中加热10分钟。
3. 将蛋白样品和蛋白标准品以及预染色标记的蛋白质分子量标记物（Marker）加载到凝胶孔中，并进行电泳。
4.样品电泳结束后，将凝胶转移到显色/脱色缓冲液中，进行凝胶染色。
5.在染色后，观察凝胶中蛋白质的迁移情况，并用相应的软件或图像分析系统进行分析。
根据分子量标记物的迁移位置，可以确定牛血清白蛋白的迁移位置，并据此进行鉴定。
实验注意事项：1.实验操作货真价实，遵守实验室安全规定，注意个人防护。
2.实验过程中要注意消毒操作，避免细菌的污染。
3.实验设备及试剂用前要检查是否完好，避免实验过程中的故障。
4.实验室操作要注意卫生，实验后要做好清洁工作。
实验结果分析：根据实验结果，我们可以通过SDS-电泳方法成功提取并鉴定牛血清白蛋白，并确定其迁移位置。
根据其迁移位置可以进一步研究牛血清白蛋白的性质和功能。
实验改进及扩展：1.可以尝试不同的提取方法，如层析法、电泳法等，比较不同方法的效果。
试验方法
3 4 1 1 牛血清白蛋白残留量测定法试验目的:测定牛血清白蛋白残留量实验原理:1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。
由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
本法系采用酶联免疫法测定供试品中残余牛血清白蛋白(BSA)含量。
实验步骤：供试品溶液的制备供试品如为冻干剂型，检测前应按标示量复溶后混勻，室温静置30分钟,检测前应再次混匀。
供试品如为液体剂型可直接用于检测。
干扰试验首次采用该法检测的供试品应进行干扰试验。
制备溶液I(供试品倍比稀释）、溶液 II (供试品和30ng/m l的内控标准品等量混合）和溶液 DI(30ng/ml的内控标准品倍比稀释）。
当供试品溶液BSA含量高于试剂盒测定范围中点时，则 2 倍稀释后制备溶液 I 和溶液 II。
溶液 I 、溶液 II 可倍比稀释测定，溶液 E 应多孔测定（至少 10 孔以上），并在试验间均匀添加。
按测定法操作，分别测定溶液I 、溶液 n 、溶液 in 的 b s a 含量，溶液 I 与溶液 n 的含量之差应在溶液El含量测定值的 95%可信区间内，表明供试品不会对该检测法产生干扰作用。
牛血清白蛋白 标准
牛血清白蛋白标准白蛋白是一种重要的血浆蛋白，它在维持人体正常生理功能和健康方面起着重要的作用。
牛血清白蛋白标准的制定和应用，对于研究白蛋白的功能、生物学活性以及治疗疾病等具有重要的意义。
本文将详细介绍牛血清白蛋白标准的相关内容。
牛血清白蛋白标准是指根据一定的标准和规定，通过一系列的实验和数据统计得出的牛血清白蛋白的理想特性值。
这些特性包括分子量、纯度、生物活性等。
二、牛血清白蛋白标准的制定过程制定牛血清白蛋白标准需要经历以下几个步骤：1. 收集相关文献和研究成果，了解当前牛血清白蛋白的研究现状。
2. 确定制定牛血清白蛋白标准的目的和应用范围，例如治疗疾病、药物研发等。
3. 设计实验方案，选择合适的实验方法和指标，例如蛋白质含量检测、电泳分析等。
4. 进行实验并收集数据，通过数据分析和统计，得出牛血清白蛋白的理想特性值。
5. 评估和修订标准，根据实验结果和应用需求，对标准进行评估和修订，确保其准确性和适用性。
6. 正式发布标准，将制定好的牛血清白蛋白标准公开发布，供科研人员和相关机构使用。
牛血清白蛋白标准在科研和医学领域具有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 蛋白质研究：牛血清白蛋白标准可以作为蛋白质研究的参考，用于比较不同样品中白蛋白含量和纯度的差异。
2. 药物研发：在药物研发过程中，牛血清白蛋白标准可以用作药物的活性检测和效价测定的参考。
3. 临床诊断：通过测定牛血清白蛋白的含量，可以评估人体内白蛋白的代谢状态，对一些疾病的诊断和治疗提供参考依据。
4. 生物技术应用：牛血清白蛋白标准可以作为基因工程、蛋白质工程等生物技术的研发和生产过程中的参考物质。
总之，牛血清白蛋白标准的制定和应用对于研究和利用白蛋白具有重要的意义。
通过准确制定标准并应用于科学研究和临床实践中，有助于推动相关领域的发展，提高研究结果的准确性和可比性，为人类健康和生物技术的发展做出贡献。
牛血清白蛋白残留量测定
附录VIII F 牛血清白蛋白残留量测定法
本法系用酶联免疫法测定供试品中牛血清白蛋白（BSA）含量量，以判断供试品中BSA残残留量是否符合规定的检测方法。
以牛血清白蛋白标准品为标准，采用直线回归方法计算供试品中牛血清白蛋白含量。
供试品溶液的制备供试品如为冻干剂型，检测前应按标示量复溶后震荡混匀，室温静置30分钟，检测前应再次震荡混匀。
供试品如为液体剂型可直接用于检测。
采用试剂盒提供的供试品稀释液稀释供试品，供试品应至少进行两个稀释度测定，每个稀释度做双孔平行测定。
测定BSA含量的容器具应专用，防止实验室中BSA污染。
干扰试验制备溶液A（供试品溶液倍比稀释）、B（供试品溶液和30ng/ml 的内控标准品等量混合）和C（30ng/ml的内控标准品倍比稀释）。
其中，供试品溶液BSA含量高于试剂盒测定范围中点时，两倍稀释后制备溶液A和B。
溶液A、B可倍比稀释测定，溶液C应多孔测定，并在试验间均匀添加。
测定法按试剂盒说明书进行。
试剂盒标准品的吸光度值（A值）、内控参考品测定值、标准品线性相关系数、双孔测定吸光度值（A值）均应在试剂盒要求范围内，试验有效。
以试剂盒提供的标准品吸光度值（A值）和浓度制定标准曲线，根据供试品的A值计算供试品中BSA含量，按试剂盒说明书要求判定最终结果。
供试品测定时，低稀释度A值明显低于高稀释度A值时可能存在HOOK效应或操作失误，需重试或调整稀释倍数进行检测。
首次应用该试剂盒的供试品应进行干扰试验。
干扰试验中B－A值应在C值测定的95％可信区间内。
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附录VIII F 牛血清白蛋白残留量测定法
本法系用酶联免疫法测定供试品中牛血清白蛋白（BSA）含量量，以判断供试品中BSA残残留量是否符合规定的检测方法。
以牛血清白蛋白标准品为标准，采用直线回归方法计算供试品中牛血清白蛋白含量。
供试品溶液的制备供试品如为冻干剂型，检测前应按标示量复溶后震荡混匀，室温静置30分钟，检测前应再次震荡混匀。
供试品如为液体剂型可直接用于检测。
采用试剂盒提供的供试品稀释液稀释供试品，供试品应至少进行两个稀释度测定，每个稀释度做双孔平行测定。
测定BSA含量的容器具应专用，防止实验室中BSA污染。
干扰试验制备溶液A（供试品溶液倍比稀释）、B（供试品溶液和30ng/ml 的内控标准品等量混合）和C（30ng/ml的内控标准品倍比稀释）。
其中，供试品溶液BSA含量高于试剂盒测定范围中点时，两倍稀释后制备溶液A和B。
溶液A、B可倍比稀释测定，溶液C应多孔测定，并在试验间均匀添加。
测定法按试剂盒说明书进行。
试剂盒标准品的吸光度值（A值）、内控参考品测定值、标准品线性相关系数、双孔测定吸光度值（A值）均应在试剂盒要求范围内，试验有效。
以试剂盒提供的标准品吸光度值（A值）和浓度制定标准曲线，根据供试品的A值计算供试品中BSA含量，按试剂盒说明书要求判定最终结果。
供试品测定时，低稀释度A值明显低于高稀释度A值时可能存在HOOK效应或操作失误，需重试或调整稀释倍数进行检测。
首次应用该试剂盒的供试品应进行干扰试验。
干扰试验中B－A值应在C值测定的95％可信区间内。