生物药物分析与检验糖类、脂类和核酸类药物分析
实验 检测生物组织中的糖类
实验检测生物组织中的糖类、油脂和蛋白质一、实验目的1 尝试用化学试剂检测生物组织中糖类、油脂和蛋白质。
了解生物组织中的化学成分。
2了解颜色反应的一般方法，原理，步骤。
3制作徒手切片并进行染色。
练习使用高倍显微镜。
4分析实验现象，得出结论。
二、实验原理某些化学试剂能使生物组织中的有关有机化合物产生特定的颜色反应。
1可溶性还原糖如葡萄糖、果糖、麦芽糖等与斐林试剂发生作用，可生成砖红色的Cu2O沉淀。
因为还原性糖中含有醛基，在碱性溶液中加热煮沸2分钟后，会被Cu ( OH )2氧化，使醛基氧化变为羧基，葡萄糖被氧化成葡萄糖酸，Cu ( OH )2被还原成Cu2O。
2油脂油脂可以被苏丹Ⅲ染液染成橘黄色；被苏丹Ⅳ染液染成红色。
因为苏丹Ⅲ在油脂中的溶解度比在酒精中的溶解度大，当用苏丹Ⅲ的酒精溶液处理含有油脂的生物组织时，酒精中的苏丹Ⅲ进入油脂中，将油脂染成橘黄色。
3蛋白质蛋白质与双缩脲试剂发生作用，产生紫色反应。
蛋白质分子中含有很多肽键，在NaOH碱性溶液中，能与双缩脲试剂中的Cu2+作用，即双缩脲（H2NOC-NH-CONH2）与Cu2+作用，形成紫色的络合物。
双缩脲试剂可鉴定双缩脲的存在，而蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键。
因此，蛋白质都可与双缩脲试剂发生颜色反应。
加入双缩脲试剂A，溶液无色，再加入双缩脲试剂B，溶液显蓝色，振荡均匀后，出现紫色的络合物。
4淀粉遇碘变蓝色。
三实验材料、试剂的选择1 可溶性还原性糖的选取应选含糖高，颜色为白色的植物组织，如苹果、梨。
因为苹果、梨组织的颜色较浅，易于观察实验的结果。
还原性糖有还原性基团——游离醛基或酮基，如葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖。
非还原性糖有淀粉、纤维素、蔗糖、糖元。
2 鉴定还原糖的试剂斐林试剂: 由甲液（质量浓度为0.1g/mL的氢氧化钠溶液）和乙液（质量浓度为0.05g／mL的硫酸铜溶液）配制而成，二者混合后，立即生成淡蓝色的Cu（OH）2。
生物药物分析与检验
教材及参考资料
• 1、曾经泽主编 生物药物分析 北京医科大 学中国协和医科大学联合出版社
• 2、何华主编 生物药物分析 化学工业出版 社
• 3、白秀峰主编 生物药物分析 中国医药科 技出版社
有关内容
• 课程性质：专业必修课 • 考核方式：考试。 • 准备：作业本、计算器
第一章 绪论
第一节 生物药物概述 第二节 生物药物的质量及其控制 第三节 生物药物的分析检验
1. 凡例（General Notices）
把一些与标准有关的、共性的、需要 明确的问题，以及采用的计量单位、 符号与专门术语等，用条文加以规定， 以避免在全书中重复说明。
凡例是标准的一部分，同样具 有法律约束力。
2. 正文（Monographs）
是药典的主要内容，收载药品及其制 剂的质量标准。
修饰物等，如：丙种球蛋白。
（2）生物合成药物
• 由微生物代谢所产生的药物和必须利用 微生物及其酶转化反应共同完成的半合成
药物，如：青霉素、尿激酶、甾体激素、 维生素 。
（3）生物制品
• 预防接种用的生物制品包括疫苗、菌苗 和类毒素。
• 由细菌制成的为菌苗； • 由病毒、立克次体、螺旋体制成的为
疫苗。
荧光分析法
高效液相色谱法（HPLC）
色谱分析法
气相色谱法（GC）
电化学分析法
电导法 电位法 电解法 伏安法 极谱法
一、生物药物质量检验的程序与方法
生物药物检验工作的基本程序一般为 取样、鉴别、检查、含量测定、写出检验 报告。 • （一）药物的取样 • （二）药物的鉴别试验 • （三）药物的杂质检查 • （四）药物的安全性检查 • （五）药物的含量（效价）测定 • （六）检验报告的书写
药物分析 糖类成分的鉴别
1. Fehling试验⽣药的⽔浸液加Fehling试剂，于沸⽔浴加热数分钟，若有还原性糖类成分存在，则产⽣砖红⾊氧化亚铜沉淀。
若有⾮还原性低聚糖及多糖存在，则必须加稀酸⽔解后，才能与Fehling试剂呈阳性反应。
2. Molish试验⽣药⽔浸液，加a -萘酚试剂数滴，摇匀后沿管壁滴加浓硫酸，若有糖类成分与甙类存在，则在⼆液⾯交界处出现紫红⾊环。
3. 成脎试验⽣药的⽔浸液与盐酸苯肼液共热，只要有糖类成分存在，即⽣成黄⾊的糖脎结晶。
镜检结晶，可视结晶的形状⽽鉴定出糖的种类。
4. 层析法取⽣药浸出液（多糖类需⽔解），以某种糖为对照品⼀起进⾏层析检测。
常⽤纸层析法，正丁醇-⼄酸-⽔（4 : 1 : 5上层）作展开剂，新配制的氨化硝酸银溶液为显⾊剂，结果还原糖形成⿊⾊斑点。
[讲解]生物药物分析与检验
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生物药物分析与检验生物药物分析与检验的特点：1.需要进行相对分子质量的测定、2.需要检查生物活性3.需做安全性检查4.需做效价测定5.要用生化法确证结构终点测定法的条件：1.必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得到它的制品；2.能够确定使这种酶反应接近进行完全的条件；3.反应中底物的减少、产物的增加、辅酶物质的改变等可以借助简便的方法进行测定高效液相色谱法的定性分析1.利用已知物质定性的方法①利用保留特性②利用不同柱比较2.色谱法与其他方法结合定性①利用化学反应定性②利用选择性检测器定性③液相色谱-质谱联用技术、液相色谱-核磁共振联用技术生物检定的范围:1.药物的效价测定2.体内微量生物活性物质的测定3.中药质量的控制4.某些有害杂质的限度检查基因工程药物的特点：1.分泌量极低而生理、药理活性极高2.具有细胞和组织特异性3.多数细胞生长因子具有多功能性4.细胞因子间存在复杂的相互作用5.具有低免疫原性特殊杂质检查方法：物理化学区分方法一、物理法“1. 臭味及挥发性的差异2. 颜色上的差异3. 溶解行为上的差异二、化学分析法1. 酸碱反应2. 呈色或沉淀反应4.氧化还原反应免疫电泳技术：将琼脂电泳与免疫扩散结合起来，即利用电场作用下带电蛋白质在琼脂凝胶中具有不同的迁移率，以及相同的蛋白质具有完整的抗原性的特点，用于分析抗原或抗体性质的一种技术。
电泳：带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。
终点测定法：先借助酶反应（单独的反应或几种酶构成的偶数酶反应）使被测物质定量地进行转变，然后在转化完成后，测定底物、产物或辅酶物质（第二底物）等的变化量生物检定：利用生物体（整体动物、离体组织/器官、细胞和微生物等）的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。
质反应：当一定剂量的药物注入动物体内后，观察某一反应或反应的某一程度出现与否，只有质的变化。
量反应：药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产生的量变可以测量者。
《生物药物分析与检验》课程教学大纲
《生物药物分析与检验》课程教学大纲一、课程性质本课程是生物工程专业本科学生的专业课，也是一门专业拓展课，在教学计划中占有重要的地位，本课程主要学习药物结构与药效的关系，药物的理化性质、鉴别方法、合成方法等，为后续课程如药剂学、药用分析化学等的学习打下基础，是全面掌握药学领域各学科知识的重要桥梁。
本课程需先修无机化学、有机化学、生物化学等课程。
二、教学目的通过生物药物分析与检验课程的教学，使学生掌握生物药物特有的一些分析思路和分析手段，能够设计生物药物的标准规格，培养学生独立思考工作的能力。
同时培养学生强烈的药物质量观念以及生物药物分析的基本知识和技能。
学习本门课程后，要求学生不仅能够熟练掌握普通生物药物分析的方法、而且能够独立设计药物质量标准、建立质量分析方法及方法学评价。
三、教材教参教材：《生物药物分析》，何华，化学工业出版社（第一版），2001年。
教参：《生物药物分析》，曾经泽，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，2000年；《生物药物分析》，白秀峰，中国医药科技出版社，1999年。
四、教学方式本课程以课堂讲授为主、自学和讨论为辅的方式组织教学，内容采用多媒体辅助手段。
五、教学内容及时数根据生物工程专业人才培养方案，本课程共1学分，总的教学时数为18学时，其中讲授18学时。
具体如下：1. 生物药物分析学概述 (1.5学时，其中讲授1.5学时)基本内容：药物分析的性质、任务、药品质量标准的内容、生物药品的分类和科学管理、生物药品分析检验的基本程序和检验内容、药物代谢与药物动力学中的分析方法。
重点：生物药物分析的性质、概念、应用范围、工作方法及有关内容。
难点：药物代谢与药物动力学中的分析方法。
新知识点：药品质量标准的内容。
2. 生物药物分析信息的获取（自学）3. 药物分析方法的选择、建立和认证（1.5学时，其中讲授1.5学时）基本内容：分析质量控制、标准、标准物质等概念、质量控制图、实验室内外部的质量控制、准确度、精密度、线性范围等参数的概念、考察方法。
1检测生物组织中的糖类脂肪和蛋白质解析
蛋白质+双缩脲试剂
橘黄色 红色
紫色
三．实验步骤
1. 还原糖的检测和观察
选材（含糖量较高，白色或近白色的植物组织）
制备组织样液（制浆
一层纱布过滤
取液）
显色反应（2ml组织样液+1ml刚配置的斐林试剂
50℃~65℃水浴加热
2min
砖红色沉淀
结论（组织样液中含有还原糖）
2. 淀粉的检测和观察
精溶液去浮色
滴一滴蒸馏水，盖上盖玻片）
显微镜下观察
结论（花生种子中含有脂肪）
4. 蛋白质的检测和观察
选材与制备（大豆组织研磨液）
摇匀
显色反应（2ml组织样液+1ml双缩脲试剂A液
+4滴双缩脲试剂B液
样液变紫色）
结论（大豆组织研磨液含有蛋白质）
斐林试剂与双缩脲试剂的比较
课堂练习
1. 组成家兔和狗尾草细胞的基本元素有（A） A . C、H、O、N B . H、O、K、S C . C、P、O、S D. N、P、K、Ca
检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质
一．实验目的
尝试用化学试剂检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质
二．实验原理
某些化学试剂能够使生物组织中的有关有机化合物产生特定的颜 色反应。
1. 糖类
① 还原糖+斐林试剂 ② 淀粉淀
2min
蓝色
2. 脂肪
① 脂肪+苏丹Ⅲ染液 ② 脂肪+苏丹Ⅳ染液
选材与制备（马铃薯匀浆）
摇匀
检测（组织样液+2滴碘液
样液变成蓝色）
结论：马铃薯匀浆中含有淀粉
3. 脂肪的检测和观察
方法一：
（完整版）生物药物分析重点完整版
（完整版）生物药物分析重点完整版第一章绪论1.生物药物分析：是生物工程制药专业设置的一门专业课，是应用微生物学、分子生物学、免疫学、生物化学、有机化学、数学、分析化学、生化工程等学科的理论及其技术成就，检测和研究各种生物药物质量的一门综合性学科。
2.药典：是国家对药物质量标准及其检测方法所做的技术规定，是药物生产、监控、供应、使用及管理部门共同遵循的法令。
3.我国的第一部药典1953年出版，从1963年版开始，中国药典分一、二部，药典内容一般包括凡例、正文、附录、索引四部分，生物药物收载在第三部分。
4. 美国药典—USP英国药典—BP日本药局方—JP英国副药典或英国准药典—BPC国际药典—Ph.Int5.基因工程药物的质量控制规则（暂时未找到）6.生物药物质量的科学管理：（5个）《良好药物实验研究规范》—GLP《良好药品生产规范》—GMP《良好药品供应规范》—GSP《良好药品临床试验规范》—GCP分析工作的质量管理—AQC第二章生物药物的杂质检查1.药物的杂质：（定义）指药物中存在的无治疗作用或影响药物的稳定性和疗效，甚至对人体健康有害的物质。
2.药物中存在的杂质其来源主要有两个：（1）是由生产过程中引入；（2）是贮存过程中受外界条件的影响，引起药物理化性质发生变化而产生。
3.杂质限量：（定义）指药物中所含杂质的最大容许量，它通常不要求准确测定其含量，只要在杂质含量在一定限度内。
4.杂质限量检查法的特点：只需通过与对照液比较即可判断药物中所含杂质量是否符合限量规定，不需测定杂质的准确含量。
5.一般杂质的检查方法在药典附录中加以规定。
一般杂质检查项目有氯化物、硫酸盐、水分、酸、碱、硫化物、硒、氟、氰化物、铁盐、重金属、砷盐、铵盐、易炭化物、干燥失重、炽浊残渣、溶液颜色与澄清度以及有机溶剂残留量等。
氯化物检查法：Cl- ┼Ag+──→AgCl↓原理：药物中微量的氯化物在硝酸酸性条件下与硝酸银反应，生成氯化银的胶体微粒而显白色浑浊，与一定量的标准氯化钠溶液在相同条件下生成的氯化银混浊程度比较，判定供试品中氯化物是否符合限量规定。
生化药物分析及生物检定技术
一、平皿法
4．药品的预处理 (2) 固体、半固体或黏稠液供试品 ③ 不溶于水的膜剂供试品 取100cm2，剪碎， 加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液100mL(必 要时可增加稀释剂)，浸泡，振摇，作为供试液。 ④ 肠溶胶囊(片)供试品 称取供试品10g，置 含pH6.8无菌磷酸盐缓冲液100mL的锥形瓶内， 于45℃水浴中，保湿，振摇，使溶解作为供试液。
一、平皿法
o 5．细菌总数计数 o (7) 结果报告 菌数报告：选择菌落数在30～300
之间的稀释级平板计数，以该稀释级的平均平板菌落数 乘稀释倍数作为报告菌数；若邻近的2个稀释级平均平 板菌落数均在30～300之间，计算级间比值，当比值 ≤2时，以2级菌落数的平均值为报告菌落数，比值大于 2但不超过5时，按低稀释级平均菌落数乘稀释倍数为 报告菌数。当比值大于5时，或高稀释级的菌落数大于 或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应重新验证； 各稀释级平均菌落数均不足30时，以最低稀释级平均 菌落数乘稀释倍数为报告菌数；如各稀释级平板均无菌 落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，以小于 1乘以最低稀释倍数的值为报告菌数。
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及
其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检
查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控
制菌检查。微生物限度检查应在环境洁净度 10 000级下的局部洁净度100级的单向流 空气区域内进行，其全过程必须严格遵守无 菌操作，防止再污染。
二、检查方法
药品微生物限度检查采用活菌计数，
三、生化药物分析进展 总体向理化/仪器分析发展 如：GC、HPLC、UV、TR、质谱、磁共振、 超离技术、放射免疫、酶试剂、酶电极检 测等。 另，应用细胞培养，对生化药的活力 和效价检测。 单克隆体免疫分析技术及基因分析技 术，提高检测限量和灵敏度。
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(二) 与斐林（Fehling）试液反应
葡萄糖醛基的还原性
Fehling试液
葡萄糖 碱 性酒石 酸铜
水、△
Cu2O↓
(三) 红外分光光度法
中国药典规定本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致。
(四) 高效液相色谱法
供试品溶液的保留时间应与对照溶液主峰的保留时间一致。
四、检查
1、分子与分子量分布：右旋糖酐20
➢ 取本品1％水溶液，加氨制硝酸银试液数滴， 即产生白色胶状沉淀。---嘌呤碱基
➢ 取含量测定项下的溶液,照分光光度法测定，在 248nm的波长处有最大吸收，在222nm的波 长处有最小吸收。
➢ 色谱图
➢ 红外光谱（IR）
4.检查
➢ 溶液的澄清度与颜色（溶液的透光率） 取本品0.5g，加水 50ml使溶解，照分光光度法在430nm的波长处测定透光率， 不得低于98.0％(供注射用)。
➢有机化合物的结构中含有手性碳原子，具有旋光现象。利 用测定药物的旋光度进行定性、杂质检查和定量的分析方法， 称为旋光度测定法。
➢手性碳原子，是指和四个不同的原子或基团连接的碳原子。
➢在一定条件下测得的旋光度称为比旋度，以[α]表示。
➢比旋度可以反映其纯度，故药典对葡萄糖原料不作专项含 量测定，只规定比旋度范围
5.含量测定
1）UV法：取本品，精密称定，加水制成每 1ml中约含10μg的溶液，照分光光度法在 248nm的波长处测定吸收度，按 C10H12N4O5的吸收系数（E1％1cm）为460 计算。
2）HPLCBiblioteka 6.作用与用途 辅酶类药。有改善机体代谢作 用。用于各种类型肝脏疾患、心脏疾患、白 细胞减少症、血小板减少症、中心视网膜炎、 视神经萎缩等。
本品为复方制剂，右旋糖苷20有旋光性，而氯化钠无旋光 性，不干扰测定，用旋光度法测定右旋糖苷20的含量。
c%
100
20 D
l
100 0.5128
195 1
C为每100mL注射液中含右旋糖酐20的质量，g; α为测得的
旋光度×稀释倍数
✓ 滴定法：甘露醇的含量测定 ✓ 高效液相色谱法：硫酸软骨素的效价测定 ✓ 生物法：肝素的效价测定
7.用法与用量口服，一次0.2～0.6g一日0.6～ 1.8g
(一) 肌苷的质量分析
1.结构：C10H12N4O5 268.23
本品为9β-D-核糖次黄嘌呤。按干燥品计算，含 C10H12N4O5应为98.0～102.0％。
2.性状：
本品为白色结晶性粉末；无臭，味微苦。 本品在水中略溶，在氯仿或乙醇中不溶，在稀盐 酸和氢氧化钠溶液中易溶。
3.鉴别
➢ 取0.01％供试品溶液适量,加等体积的3,5-二羟 基甲苯溶液(取3，5-二羟基甲苯与三氯化铁各 0.1g，加盐酸使成100ml)，混匀，在水浴中 加热约10分钟，即显绿色。---苔黑酚反应
➢ 干燥失重 取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过 1.0
➢ 炽灼残渣 不得过0.1％(供注射用),或不得过0.2％(供口服用
➢ 重金属 取本品1.0g，依法检查含重金属不得过百万分之十。
➢ 次黄嘌呤 ①精密称取本品0.5g，置50ml量瓶中, 加水溶解 并稀释至刻度，摇匀，照纸色谱法试验，吸取上述溶10μl，点 于3×25cm色谱滤纸上，照上行法，以水为展开剂，展开约 20cm处，取出晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，不得出现 杂质斑点。 ②HPLC
一、药物结构与性质
葡萄糖 蔗糖 乳糖 淀粉
单糖 双糖 多糖
赋形剂和矫味剂
医学上的糖类：
葡萄糖属单糖，是人体能量的主要来源之一。 乳糖、蔗糖，淀粉常被用作药物制剂的赋形剂或矫味剂。
临床上常用多糖药物：葡萄糖、右旋糖酐、肝素、硫酸软 骨素等。
二、鉴别试验
（一）比旋度测定
➢旋光度：直线偏振光通过光学活性化合物液体或溶液时， 能引起旋光现象，使偏振光平面向左或右旋转，旋转的度数 称旋光度。
来源：系蔗糖经肠膜状明串珠菌发酵后生成的一种高分子葡萄
糖聚合物，经处理精制而得。由于聚合的葡萄糖分子数目不同， 而产生不同分子量的产品。有高分子(平均分子量10-20万）、 中分子（6-8万）、低分子（2-4万）、小分子（1-2）。
性状：为白色或类白色无定形粉末，无臭，无味。易溶于热水，
不溶于乙醇。其水溶液为无色或微带乳光的澄明液体。
第三节 核酸类药物的分析
➢ 1869年核酸最早分离自外科绷带脓细胞的细胞核， 当时发现这种物质含磷量之高超过当时发现的任何 一种有机物，并且含有很强的酸性，故得名核酸。
➢ 1909年其组成被研究清楚，1944年生物功能初步 澄清，在X射线衍射技术支持下1953年结构澄清。
➢ 核酸是脱氧核糖核酸（DNA）与核糖核酸（RNA） 的通称。
用途：是目前最佳的血浆代用品之一。临床上常用的有中分子
右旋糖酐，用于出血性、创伤性及烧伤性休克等。低、小分子 右旋糖酐，能改善微循环，亦有扩充血容量作用。
注:右旋糖酐70（中分子）；右旋糖酐40（低分子）；右旋糖酐10（小分子）
2、总氮量：肝素钠 3、残留溶剂：残留溶剂
四、含量测定
1、旋光光度法
右旋糖苷20氯化钠注射液的含量测定。
一、结构和分类
核酸
核苷酸
水
解
磷酸
核苷
戊糖
碱基
二、理化性质
➢ （一）两性性质：磷酸基；碱基（通常：酸性） pH影响碱基间氢键稳定：DNA pH4.0-11.0
➢ （二）水解性：微溶于水，不溶于一般的有机溶剂 ➢ （三）UV：λmax=260nm 蛋白质280nm
A260/A280 纯DNA＞1.8 纯RNA应达到2.0 混有杂蛋白 比值降低
第九章 糖类、脂类及核酸类药物的分析
第一节 糖类药物的分析
糖类物质：是多羟基（2个或以上）的醛类或酮类化合物，在
水解后能变成以上两者之一的有机化合物。在化学上，由于其由 碳、氢、氧元素构成，在化学式的表现上类似于“碳”与“水” 聚合，故又称之为碳水化合物。
生物学功能：
1.提供能量。植物的淀粉和动物的糖原都是能量的储存形式。 2. 细胞的骨架。纤维素、半纤维素、木质素是植物细胞壁的主要成 分，肽聚糖是原核生物细胞壁的主要成分。 3.细胞间识别和生物分子间的识别。细胞膜表面糖蛋白的寡糖链 参与细胞间的识别。红细胞表面ABO血型决定簇就含有岩藻糖。