化学免疫荧光组织细胞
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析
二 抗
IHC
一
反
抗
应 原
抗
理
原
示
意
图
辣根过氧化物酶（HRP）
棕褐色络合物
3，3-二氨联苯胺（DAB） 显色剂
细 胞
组织切片/芯片制作
组织芯片/切片应用
1. 组织芯片
组织芯片（或组织微阵列）是将数十个甚 至上千个不同个体的组织标本集成在一张固 相载体上，组织芯片中含有蛋白，RNA及 DAN分子，是一种高通量的研究分析工具。 研究者一次可有效利用成百上千份正常或疾 病状态下的组织标本来研究特定基因及其所 表达的蛋白质与疾病之间的关系。
细胞浆衬染染料： 鬼笔环肽（phalloidin ）由鬼笔鹅膏真菌（Amanita phalloides）产生的一种 环肽。可与F肌动蛋白结合，使F肌动蛋白保持稳定。其荧光标记物是鉴定F 肌动蛋白的重要试剂。
荧光抗体的选择： 绿色荧光素：FITC，Alex488，Dylight488等。 红色荧光素：PE，Alex546等。
4. BCIP/INT显色法
产品描述：BCIP/INT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸/p-碘硝基四唑）是一种冷藏稳定的、单一 组分溶液，用于免疫组化、原位杂交、 western blot、northern blot和southern blot， 特异性地与碱性磷酸酶反应生成橙色/棕褐 色物质。
试剂盒组成：
操作过程中冲洗不充分，建议增加冲洗的 次数与冲洗时间。
组织富含内源性的生物素与过氧化物酶， 建议使用相关试剂进行封闭。
发生抗原异位。
蛋白封闭不充分，建议增加蛋白封闭时间。
3.显色强度弱
一抗浓度过低或孵育时间过短，建议增加 一抗浓度或延长孵育时间。
免疫荧光组织(细胞)化学技术基本原理
免疫荧光组织（细胞）化学技术基本原理免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量。
用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法。
用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。
免疫荧光组织化学分直接法、间接法和补体法。
1、直接法（1）检查抗原方法这是最简便、快速的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体，直接用于细胞或组织抗原的检查。
此法特异性强，常用于肾穿刺，皮肤活检和病原体检查，其缺点是一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。
（2）检查抗体方法将抗原标记上荧光素，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体在原位检测出来。
2、间接法（1）检查抗体（夹心法）方法此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。
（2）检查抗体方法用已知抗原细胞或组织切片，加上待检血清，如果血清含有切片中某种抗原的抗体，抗体结合在抗原上，再用间接荧光抗体(抗种属特异性IgG荧光抗体)与结合在抗原上的抗体反应，在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光。
此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。
（3）检查抗原法此法是直接法的重要改进，先用特异性抗体与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体与结合在抗原上的抗体结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。
免疫荧光(单标和双标)注意事项及具体方法
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。
b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。
d. 封闭液。
e. 0.01mol／LPBS缓冲液。
2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。
c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。
抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。
f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。
免疫组化和荧光
①防止标本从玻片上脱落；
②除去妨碍抗原-抗体结合的类脂，使抗
注意事项 原抗体结合物脱易水于用获梯得度良乙好醇的（染由色低结到果高；）充分脱
标 脱 脱 抗 细 灭 血 一 抗 切本水蜡原胞活清抗体片固、和修通内封和稀清定石水复透源闭二释洗防蜡化性抗液染溶目目止包过浓组。液造一中的标荧一生织织苏的成来有埋氧度是蛋光般气上浅D切木新背异后源交形白素和化和用泡滴A为染数3注②③④均片素旧景性续的叉成进提Bm中，一由过作得制物孵了色）意温冲P可使脂核上复、的染显用结，反为织不的原1抗抗钠i细行前n抗B性方滴于程用细0防 ， 尤 ： 柔 洗以抗质内有染目深色色一*T果血应了中全多抗体体防片酶育S0胞定衰3抗体树 法 封组中，胞r可③般时的止所为①冲的由体而，剩时标次浅较i时致的清的后抗易而次体稀稀腐t轮位退体稀o和时胶是片织，从内以固用即一以重单洗时PD能使故余间抗，和强间。n假中位面原出产回反释释剂廓，。就释H等直液中发而抗A溶定4可生间X抗适要独，间够抗在的要原而特而不一阳动点的等现生收应液液、和，经B%能液-封接，部生失原解的冲1、当，冲防要充体细位看的一孵异本是般性物发抗结局非利不用中B物多离从常0顺的片在然分了去决细标洗S二地一洗止足分及胞点当定0抗育性底固室；自生体合灶特用佳一除聚子而用利PA素、，载后抗蛋抗定胞本.抗加般，切够要一温地大免可时位孵一条染着定温封身结等反性异较，H而般P稳其甲强更苏水要进蛋避玻一原白原族测膜易B值等强在防片，，抗度进分疫以的等育抗件色色的1闭的合试应反性好终4定P中醛度好木、干入S白0免片手在之性重率4℃、于B可试清一止的才包孵、入子组与室情后孵决的较，血抗；剂。应背。而-剂外54的地素对净胞3S酶产组拿甲间；新。过m℃细保能剂洗抗交脱能括育抗胞结化一温况的育定深浅特0清体但能若和景正出等即，使对复组和内kim醛交通暴夜效胞n存偏残（孵叉落彻孵温体内构时抗、，清条。等一，不够脱浸着因现组可还用织锋氢较3i灭与一或联过露n和1果核。酸留延育反。底育度浓7进的尤非洗件通般预能充蜡洗色为假份，加。化和要利0则好活相℃般多及抗，从育最膜固m，而长前应可洗时有度行物为特均在透是先与分和不。这阴，但了氢要完。可。内应31聚醛原提i冰时佳片、定而引时的造用去n间：有结质推异为免0液0和能一与水全种性对专叠灭求全否以二源左抗m甲基修高~箱间；等细剂使起间清成浸结、关4合进荐性5疫。二和抗组化 ，原结抗用氮3活。浸则适抗i性右原℃次醛的复抗n拿过孵0。胞的抗非和洗污洗合温，反入使结组如抗组来因果-体的化时蜡，当m一P，结、1*固封，原出长育器选特增是染方的度一5应胞用合化ThO同织源，。i间、容延般n而合室mr。定闭使检后易时膜择D异多。式物和般；i。浆，，反t短切易长i室o0。温n一3引间上一性次；质抗3过一和这应n.。点73片裂封温、7般起：的℃%X。体氧般胞样中℃，时片闭或3-3过脱这复浓化最71%可刀和时℃-氧片与温2度氢重过以片脱间h，化。孵，氧，
排雷攻略：一文教会你免疫组化、免疫荧光如何制片看片
排雷攻略：⼀⽂教会你免疫组化、免疫荧光如何制⽚看⽚最近带着新进门的研⼀师妹做实验，师妹问了三个问题：1、免疫组化和免疫荧光的区别？2、这两种实验该在什么情况下选择？3、组织是不是只能做免疫组化，细胞是不是只能做免疫荧光？4、免疫荧光为什么要做DAPI染⾊？我听完之后笑了，这种思考的态度是好的，但其实，师妹问的这⼏个问题就是⼀个问题。
归根结底，涉及到“免疫”⼆字总是离不开抗原抗体反应的，⼆者都属于免疫检测技术⼿段，⽽免疫组化和免疫荧光两项技术都可以应⽤在组织和细胞⽅⾯，前者采⽤的是化学发光的⽅法，后者是荧光。
因为我们在⽂献中看到的，很多⼈都会选择做组织的免疫组化、细胞的免疫荧光，所以这就给初⼊实验室的新⼿们带来了误区。
其实⽹上已经有很多详细的操作步骤，所以⼩六⼉今天想为各位新⼿朋友们总结⼀下我认为的免疫组化和免疫荧光制⽚看⽚的⼩技巧，帮助⼤家排雷区，同时也提出⾃⼰的⼀些疑问，希望能得到解答（因为本⼈只做过组织的免疫组化和细胞的免疫荧光，以下内容以这两⽅⾯为主，内容若有⽋缺，欢迎⼤家补充）。
免疫组化1、取材时要尽量去除⾎液的⼲扰：⼩⿏⿇醉后，从左⼼⽿插⼊针头，⼼尖处剪开⼀个⼩⼝，然后将PBS缓慢打⼊⼼脏中，缓慢跳动的⼼脏会将PBS运送⾄全⾝。
50ml的PBS⽤量对于Balb/c或昆明⼩⿏的体积⽽⾔就已⾜够，这⼀步骤对于像肺、肝和脾脏这样⾎管丰富的脏器取材极为重要。
2、取材时要尽量做到表⾯积⼤、厚度⼩：理想的取材厚度是2mm，这样的尺⼨可以让后续的固定、脱⽔等操作达到理想的效果。
器材选择上，⼿术⼑和超市购买的⼑⽚都可以，只要⼑⽚锋利即可，切勿反复切割揉搓组织。
因为脏器的表⾯都是弧形，并且质地很软，如果你直接取材，第⼀是不好切，第⼆是弧形的⼀⾯肯定是厚度超标，所以这⾥建议各位将组织置于碎冰上后，沿着长轴在横切⾯处再切⼀⼑取材（针对实质性器官，且不要求取材部位）。
3、取材后的组织需⽴即固定：固定不仅是要保留组织原有的形态，也是在保留组织中的抗原。
免疫组化,免疫荧光
免疫组化,免疫荧光
免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）和免疫荧光（Immunofluorescence，简称IF）是常用于研究细胞和组织中蛋白质分布和定位的实验技术。
免疫组化：免疫组化是通过使用特异性抗体来检测和定位组织切片中特定蛋白质的技术。
它包括将组织切片与特异性抗体结合，然后使用染色试剂使抗原-抗体复合物形成染色反应，从而可视化目标蛋白质的位置。
该技术常用于研究细胞分化、组织病理学和肿瘤学等领域。
免疫荧光：免疫荧光是利用荧光染料（荧光标记的二抗或直接标记的一抗）结合目标抗原的方法来检测和定位组织或细胞中的蛋白质。
通过特异性的抗体与目标蛋白质结合，然后使用荧光标记的二抗或直接标记的一抗与抗原-抗体复合物结合，使目标蛋白质在显微镜下产生荧光信号，以观察其位置。
免疫荧光技术广泛应用于细胞生物学研究、免疫学和医学诊断领域。
这两种技术在原理上非常类似，但在应用上有一些区别。
免疫组化主要用于固定的组织切片，可用于定量和定位分析。
而免疫荧光通常用于固定的细胞，可以提供更高分辨率的蛋白质定位信息，并可以进行多色荧光共标记以研究多个蛋白质的相互作用和定位。
无论是免疫组化还是免疫荧光，都依赖于合适的抗体选择和样本处理步骤来确保结果的准确性。
技术的选择应根据研究
的目的和样本的性质进行评估和决策。
免疫组织化学、免疫荧光染色
免疫组织化学（Immunohistochemistry，简称IHC）和免疫荧光染色（Immunofluorescence，简称IF）是两种常用的免疫细胞化学技术，用于在组织切片或细胞涂片上检测特定蛋白质或抗原的存在和分布。
这两种技术都依赖于抗体与抗原之间的特异性结合反应。
免疫组织化学是一种使用酶标记抗体来检测抗原的方法。
在这个过程中，首先将组织切片与特定的初级抗体（针对目标抗原的抗体）孵育，然后洗涤以去除未结合的抗体。
接下来，将切片与带有酶标记的次级抗体（针对初级抗体的抗体）孵育。
再次洗涤后，加入酶的底物，它会在酶的作用下产生颜色沉淀，使得抗原的位置在显微镜下可见。
常用的酶包括过氧化物酶和碱性磷酸酶。
这种方法的优点是可以产生永久性的记录，因为颜色沉淀是稳定的。
免疫荧光染色则涉及使用荧光染料标记的抗体来检测抗原。
在这个过程中，初级抗体和次级抗体都带有荧光标记。
当这些抗体与抗原结合时，它们发出的荧光可以在荧光显微镜下观察到。
这种方法的优点是可以同时使用多种颜色的荧光染料来检测多个不同的抗原，而且荧光信号通常比免疫组织化学的颜色反应更强。
两种技术都有其应用范围。
免疫组织化学常用于病理学诊断，因为它可以用于存档的组织样本，并且结果可以用常规显微镜观察。
而免疫荧光染色则更适合于研究目的，特别是在活细胞成像和多标记实验中，因为它可以提供更丰富的信息和更高的灵敏度。
总之，免疫组织化学和免疫荧光染色都是强大的工具，它们使得科学家能够在细胞和组织水平上可视化蛋白质的表达和定位。
选择哪种技术取决于实验的具体需求和可用的设备。
常用免疫组织化学染色方法
常用免疫组织化学染色方法免疫组织化学染色是通过将抗原与抗体结合来检测组织中特定蛋白质的染色方法。
它是现代生物医学中常用的一种技术，可以用于研究分子生物学、细胞生物学、病理学等领域。
以下是一些常用的免疫组织化学染色方法介绍：1. 免疫组化染色(Immunohistochemistry, IHC)：免疫组化染色是免疫组织化学中最常用的方法之一、其基本原理是使用一种与目标抗原特异性结合的抗体，将抗原与抗体结合，然后通过染色方法将表达该抗原的细胞或组织可视化。
常用的染色剂包括多聚酶、酶标、荧光素和放射性同位素。
IHC可以用于检测细胞表面抗原、细胞器中的抗原以及胞内蛋白质的定位。
2. 免疫荧光染色(Immunofluorescence, IF)：免疫荧光染色利用荧光标记的抗体来检测特定抗原。
它可以提供高度特异性和灵敏度的探测，可以用于研究蛋白质的亚细胞定位、蛋白质相互作用等。
利用该方法可以用于检测多种类型的标记（单标记、双标记、复合标记等），从而实现多重染色或共定位染色。
3. 免疫电镜染色(Immunoelectron microscopy, IEM)：免疫电镜染色是一种将金粒标记的抗体用于电子显微镜下观察并定位特定抗原的方法。
通过将金粒结合到抗原-抗体复合物上，可以在电子显微镜下清晰地观察到抗原的位置和分布。
这种方法具有高分辨率和高特异性的优点，广泛应用于超微结构的研究。
4. 免疫酶标染色(Immunoenzyme staining, IES)：免疫酶标染色是使用酶作为标记物，通过化学反应将抗原与酶标记的抗体结合，从而显示出特定抗原的位置和分布。
常用的标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等。
在检测抗原时，标记物可以与染色底物产生反应生成可见色素，形成染色，以显示抗原的位置和分布。
5. 免疫组织化学原位杂交(Immunohistochemical in situ hybridization, IHC-IS)：免疫组化原位杂交技术是一种结合了原位杂交和免疫组化技术的方法。
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DAB (3，3-二氨联苯胺) 棕黄色 4-氯-1-萘酚 灰兰色 α-笨脂派若宁 红色
ALP 是以As-Mx为底物，FB/FR为发色团，生成蓝色/红色不溶性沉淀。
ALP标记抗体主要用于内源性过氧化酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等 的ICC染色 GOD 是以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为β-D-葡萄糖67mg、 NBT6.7mg、PMS（Phenazine Methylsulfate）0.167mg,0.05mol/L PB(pH8.3)10.0ml,37℃孵育1h。生成蓝色不溶性沉淀
免疫组织化学的原理及其应用
中南大学基础医学院病理学教研室
免疫组化技术的原理
利用抗原与抗体的特异性结合原理
和特殊的标记技术，对组织和细胞 内的特异性抗原和抗体进行定位、 定性或定量检测的一门技术。
免疫组化的发展史
1941年，Coons 免疫荧光技术
1968年，Nakane(中根一惠) 酶标记技术
1974年，Sternberger
免疫组化定量分析(图象分析)
灰度 长度 面积
免疫组化结果的判断原则
1.必须设立对照 2.抗原表达必须在特定部位 3.阴性结果不能视为不表达 4.免疫组化与HE切片诊断冲突应以HE诊断为准
Ck阳性
•滴加PAP (或 ABC或SP)复合物，60min •PBS冲洗，5min×3次 •显色:新鲜配置的DAB溶液，3~10min
HRP标记抗体的呈色液为0.01%～0.1%H2O2, 0.01%～0.05% DAB, 0.05～0.1mol/L Tris –HCl(pH7.4)
•自来水冲洗
•复染
•中性树胶固定
抗原 ＋Ⅰ抗＋Ⅱ抗＋ Ⅲ抗（酶抗）＋酶＋底物
注意： Ⅰ抗与 Ⅲ抗同源
酶桥法克服了酶标抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶 活性。 但仍有其不足：
① 在酶抗体血清中，含有低亲合力和高亲合力两类抗体，它们作 为抗 原与桥抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲合力，而与其本身对酶的 亲合力无关，故二者均可被连结在桥抗体上。低亲合力的抗酶抗体与酶 结合较弱，漂洗时易解离，使大部分酶（70%左右）丢失，降低了方法 的敏感性。 ② 第三步所用的抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗 酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响组织抗原的 显示. 为此70年代初，Sternberger(1970)又建立了PAP法，并加以改良，现为 ICC研究中常用的方法之一。
四、PAP法 (peroxidase anti-peroxidase2分子抗体3分子酶),小而稳定,穿透性好 注意： Ⅰ抗与 PAP 复合物同源, 第二抗体必须过量
优点:
敏感(较间接法敏感100倍),非特异性染色极轻微
五. ABC法
A-(avidin)卵白素, B-(biotin)生物素化的酶, C-复合 物
辣根过氧化物酶
（Horseradish peroxidase , HRP）
是最常用的一种酶。HRP广泛分布于植物界，以植物辣根 （西洋山嵛菜）的叶内含量最丰富而得名。它是由无色的
酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合组成的一种糖蛋白，糖占
16%～18（8条糖链分布在HRP分子表面），分子量40kD ， 最适pH5～5.5，最适温度40～45℃； pH4～11，50℃ 以下均较稳定，易溶于水和58%以下 的饱和硫酸铵溶液。
直接法的优点: 方法简单,特异性高。
直接法的缺点: 每一种特异性抗体都需要标记, 敏感性相对较低.
二、间接法
抗原 ＋Ⅰ抗（特异性抗体）＋酶标Ⅱ抗＋底物
间接法的优点:不必标记每一种抗体
敏感性提高3-4倍
三、酶桥法
基本原理 首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强 的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在 与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体， 经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶 标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价 连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节 省第一抗体的用量。
免疫细胞化学常用的酶
名称 Horseradish peroxidase 分 子 量 内源性 商品 有
40～45KD
+
Alkaline phosphatase Acid phosphatase
80～120Kd
++
有
100Kd
+++ －
有 有
Glucose oxidase 160～190kD
显色反应(底物)
•PBS冲洗，5min×3次
•0.3%过氧化氢甲醇溶液，20min(阻断内源性过氧化酶)
•PBS冲洗， 5min×3次
•蛋白酶消化(可省)
•滴加非免疫动物血清，1/5—1/30, 20min
•滴加第一抗体，60min
•PBS冲洗，5min×3次 •滴加第二抗体，60min •PBS冲洗，5min×3次
PAP技术
1975年，Kohler 和Milstein 单克隆抗体技术
1981年，Hsu(许世明)
1990年代--现在，
ABC法
SP法，原位杂交，原位PCR
免疫荧光组织(细胞)化学
免疫荧光组织(细胞)化学是根据抗原抗体反应的原理， 先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再
用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织
内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，
利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出
明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细
胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用
定量技术测定含量
免疫荧光技术的不足
需要荧光显微镜
荧光衰减,不能长期保存
定位不准确
A与B有极强的亲和力，一个A结合四个B 抗原 ＋Ⅰ抗＋生物素化Ⅱ抗＋ ABC 复合物＋底物 注意： AB复合物临时配制 B液浓度不能太高
六. SP法
SP：链霉菌抗生物素蛋白 抗原 ＋Ⅰ抗＋生物素化Ⅱ抗＋ SP 复合物＋底物
显色
DAB (3，3-二氨联苯胺) 棕黄色 4-氯-1-萘酚 α-笨脂派若宁 灰兰色 红色
免疫组化的优点
特异性强 敏感性高 定位准确、形态与功能相结合
免疫组化主要染色方法的原理
主要的技术:免疫荧光技术
免疫金银标记技术 免疫酶标记技术(PAP法) 亲和免疫组化技术(ABC法, SP法)
一、直接法
抗原 ＋酶标Ⅰ抗（特异性抗体）＋底物
用于标记的酶应具备以下几点
① 酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易 于光镜或电镜下观察 ② 所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向 周围组织弥散，影响组织学定位 ③ 较易获得的酶分子，最好有商品出售 ④ 中性pH时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存1～2年活性不应改变， ⑤ 酶标过程中，酶与体连结，不能影响二者的活性 ⑥ 被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质
免疫组化染色方法选择的原则(五个S原则 )
Specificity Sensitivity Simplicity
Safety
Save of time and money
免疫组化染色步骤
•切片脱蜡至水后
①石蜡切片经二甲苯或Hemo-De脱蜡，下行酒精至水。 ②固定/无固定新鲜组织冰冻切片，室温干燥2h以上
•镜检,观察,记录
可以系列酒精脱水、Hemo-De透明、DPX封固
结果判断
阳性细胞数: －(0%)，+(25%)， ++(50%)，+++(75%) 阳性强度: －，+，++，+++
阳性分布：细胞膜、细胞浆、细胞核
免疫组化半定量分析
考虑阳性强度和细胞比例
参照Bresalier方法综合评分进行半定量分析，阴性为0分 ；弱阳性为1分；阳性为2分；强阳性为3分。平均染色强度 计分IS(intensity score)公式为: IS=∑{(0×F0)+ (1×F1)+ (2×F2)+ (3×F3)}