转基因和基因敲除技术介绍
转基因和基因敲除技术(及英文文献讲解)
5´
3´
5´
3´
3´ 3´ 5´
5´ 内切酶 5´ (recBCD)
3´
3´ 3´ 5´
5´ 5´ 3´ 5´ 3´
DNA侵扰
(recA)
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5´ 分支迁移
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5´ (recA)
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内切酶
(recBCD)
5´
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DNA
5´
3´
3´
5´ 连接酶
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
分子杂交
目录
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
目录
)
原 位 杂 交
目录
Southern印迹
目录
常用的植物转基因方法
遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养、再生植株可 分成两大类:
1、需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介 导转化法、基因枪法；
研究现状
现在基因敲除技术主要应用动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小 鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。
文献讲解
技术原理： 同源重组的基因敲除
实验目的： 用胚胎干细胞为基础的基因打 靶技术方法，构建基因敲除 （p53）的大鼠模型。
PGK-DTA(磷酸甘油酸激酶1-白喉毒素-A链)不参与同源重组，它的随机插入是 为了减少含有位随于机10目号标染媒色介体插上入，的包耐括抗10生个素外型显E子S细，胞其，中以启富动集子正外确显的子目2上标细胞。
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术
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TAL 靶点识别模块
X2
FokI
32
TALEN介导的同源重组
HR
基因敲入
Donor plasmid
片段删除 Left arm Right arm
Donor plasmid
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
同源重组发生率编辑升pp高t 几个数量级
33
TALEN的最前沿
27
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases，类转录因子效应物核酸酶)的靶向基因敲除技术是一 种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大 鼠等各类研究对象。
技术原理：
表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别 靶点核酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基 因敲除的过程。
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（三）诱导型基因敲除
• 诱导型基因敲除法也是利用Cre/Loxp系统 为基础，利用控制Cre表达的启动子的活性 或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点， 通过对诱导剂给予时间的控制从而在动物 的一定发育阶段和组织细胞中实现对特定 基因的敲除。
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• 由Cre/Loxp系统和诱导系统两个部分组成。Loxp 转基因动物是用常规基因打靶技术构建成的，基因 组中待修饰区域两端各携带1个Loxp位点的转基因 动物。诱导系统是指所携带的Cre基因的表达或所 表达的Cre的酶活性具有可诱导性的转基因动物。 人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计来对动 物基因敲除的时空特异性进行人为控制，以避免出 现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。
基因敲除与转基因互补
基因敲除与转基因互补英文回答：Gene knockout and genetic complementation are two important techniques used in molecular biology and genetics research.Gene knockout refers to the process of intentionally disabling or "knocking out" a specific gene in an organism. This is typically done by introducing a mutation into the gene, rendering it non-functional. Gene knockout is used to study the function of a particular gene by observing the effects of its absence. For example, if a gene is suspected to be involved in a specific disease, researchers can create a knockout mouse model by disabling that gene and then observe the resulting phenotype to understand the gene's role in the disease.On the other hand, genetic complementation is a technique used to determine whether a specific phenotype iscaused by a mutation in a particular gene. It involves introducing a functional copy of the gene into an organism that carries a mutation in the same gene. If the introduced gene is able to restore the normal phenotype, it indicates that the mutation in the original organism was responsible for the observed phenotype. This technique is often used to confirm the causative role of a gene mutation in a particular disease or trait.Both gene knockout and genetic complementation have their own advantages and limitations. Gene knockout allows researchers to study the function of a specific gene by observing the effects of its absence. It helps in understanding the role of genes in development, disease, and other biological processes. On the other hand, genetic complementation helps in confirming the causative role of a gene mutation by restoring the normal phenotype. It provides evidence for the involvement of a specific gene in a particular phenotype or disease.中文回答：基因敲除和转基因互补是分子生物学和遗传学研究中两种重要的技术。
分子生物学课件：基因敲除
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活，但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活， 但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123
基因敲除小鼠技术
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
生物工程学中的基因工程技术
生物工程学中的基因工程技术生物工程学是一门涵盖多个领域的学科，其中包括基因工程技术。
所谓基因工程技术，就是通过切割、粘贴、合成等手段修改生物体的遗传信息。
这项技术可以用于研究基因的功能、制造人工生物、生产生物制品等多个领域。
基因工程技术的原理和方法基因工程技术的基础是DNA分子，DNA是生命的遗传物质，包含了决定生物特征和功能的基因序列。
基因工程技术的方法主要有4种：DNA分子修饰技术、蛋白质表达技术、基因敲除技术和基因突变技术。
- DNA分子修饰技术DNA分子修饰技术是通过切割、粘贴、合成等手段修改DNA分子的结构和信息。
其中，酶切技术是一种常用的DNA切割技术，可以把DNA切成不同大小的片段，这些片段可以用于构建重组DNA。
重组DNA是通过将两个或多个不同来源的DNA片段连接起来，形成新的DNA序列。
- 蛋白质表达技术蛋白质表达技术是将DNA序列转录成mRNA，再将mRNA翻译成蛋白质的过程。
在这个过程中，需要用到表达载体（如质粒），将目标基因插入载体的表达区域，使其在宿主细胞内表达。
这项技术可以用于生产蛋白质制品，如药物、酶等。
- 基因敲除技术基因敲除技术是通过导入人工合成的DNA序列，使其与目标基因发生同源重组，从而使目标基因失效。
这项技术可以用于研究基因功能，了解目标基因对生物体的重要性。
同时，还可以用于植物育种、治疾病等领域。
- 基因突变技术基因突变技术是在基因DNA序列中插入或删除特定的碱基或片段，从而改变目标基因的信息。
这项技术可以用于研究基因功能，如寻找可以治疗基因疾病的靶标基因等。
基因工程技术的应用基因工程技术的广泛应用，涉及多个学科领域。
以下是基因工程技术在不同领域的应用。
- 生物医学领域基因工程技术在生物医学领域的应用非常广泛，主要包括以下几个方面：1）基因诊断：利用基因工程技术分析人类DNA序列，检测基因突变，帮助医生对疾病作出早期诊断。
2）基因治疗：利用基因工程技术将正常基因导入患者体内，替代或修复受损基因，治疗某些遗传性疾病。
基因敲除-简介
用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目
的(gene knock-out)。
同源重组（Homologus Recombination) 是指发生在姐妹染色单体（sister
chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重
新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、 RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11Rad50等等。
glrA
Ta
actin
Ta
hph
glrA
ble
3.9 kb
RT-PCR验证∆glrA及cglrA菌株
影响因素
细菌的限制性修饰系统。
合适的选择性标记。 高效的转化技术(CaCl2法、电转化、原生质体、结合转 移、农杆菌介导的转化）。
Thanks!
1、建立高效的遗传转化系统。
2、构建基因敲除载体（最好带有双标记）。
3、转化实验。
4、筛选基因敲除的转化子。
5、验证转化子。
构建glrA 基因缺失株、遗传互补株和高表达菌株
PCR 2 (2.67 Βιβλιοθήκη b)∆glrA ∆glrA
WT
WT
NC
PCR 1 (1.52 kb)
NC
Ladder
3 kb 2 1.6 1
除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成 功的有基因的插入突变(insertional mutagenesis) 和RNAi
(gene knock-down) 。
a.基因载体的构建
把目的基因和与细胞 内靶基因特异片段同源 的DNA 分子都重组到带 有标记基因的载体上， 成为重组载体。
基因治疗中的基因敲除技术及其应用
基因治疗中的基因敲除技术及其应用基因治疗是一种利用基因工程技术来治疗疾病的新型医疗方法。
基因敲除技术是基因治疗的关键技术之一，它通过引入干扰性RNA或基因编辑工具，针对患者身体内的异常基因进行靶向打击，以实现基因疾病的治疗。
本文将介绍基因敲除技术的基本原理、方法及其在基因治疗中的应用。
基因敲除技术是指通过致使特定基因失活或删除之前定义的区域，来研究近亲气生物中基因的功能，尤其在人类基因组中的应用十分广泛。
基因敲除技术通常包括两种方法：RNA干扰技术和基因编辑技术。
RNA干扰技术是一种用来靶向沉默特定基因表达的方法。
它通过引入干扰性RNA（siRNA或shRNA）来干扰目标基因的转录或翻译，从而使目标基因的表达水平下降。
siRNA是由人工合成的双链RNA构成，可以选择性地降解与其互补的mRNA，使其无法被翻译成蛋白质。
shRNA是一种基因表达载体，可以产生siRNA，并持续地抑制目标基因的表达。
基因编辑技术是一种直接修改基因组的方法，可以实现精确编辑和改变DNA 序列。
基因编辑技术主要包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录调节因子样活化基因编辑酶（TALENs）和CRISPR-Cas9系统。
这些工具通过引导靶标DNA序列，切割和修复DNA，来实现基因敲除。
基因敲除技术在基因治疗中具有广阔的应用前景。
首先，基因敲除技术可以用于治疗单基因型遗传疾病。
通过针对致病基因进行敲除，可以恢复受影响的细胞正常功能，从而治疗疾病。
例如，囊性纤维化患者常常携带突变的囊性纤维化转膜调节器（CFTR）基因，通过使用基因敲除技术，可以删除异常CFTR基因，恢复肺部细胞的正常功能。
其次，基因敲除技术还可以用于癌症治疗。
癌症是由于细胞基因突变引起的，因此通过敲除异常基因可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。
例如，肿瘤抑制基因TP53的突变在很多类型的癌症中都很常见。
使用基因敲除技术来恢复正常TP53基因的功能，可以促进癌细胞凋亡和抑制其生长。
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文献：
Construction of pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and their Applications in Poly(hydroxyalkanoate) Production
1． 利用基因同源重组进行基因敲除
应用最为广泛 其具体的原理和应用将在后 ——基因捕获法
利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因 载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携 带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获 得相应的基因敲除细胞。
普遍性转导 局限性转导
噬菌体可以转导给体染色体的任何部分到 受体细胞中的转导过程
在转导过程中,如所转导的只限于供体菌 染色体上特定的基因,则称为局限性或特 异性转导.
转染：通过感染方式将外来DNA引入宿主 细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过 程称为转染(transfection)。转染是转化的一 种特殊形式。
在聚乙二醇存在下，使两个细胞原生质融合， 融合后的细胞形成二倍体细胞，具有两套 染色体，表现两者的特征。常用作生物工 程的研究
补充资料
“基因敲除小鼠”： 他们利用“基因敲除”的方法创造了一套完整的“基因敲除小鼠”的
方式，把任意改变小鼠基因变为现实，不仅可以研究单个基因在动物 体内的功能，而且为人类攻克某些遗传因素引发的疾病，提供了药物 试验的动物模型。 所谓“基因敲除小鼠”，就是先在小鼠的胚胎干细胞上通过基因重 组的办法进行基因修饰──就是将胚胎干细胞中的靶向基因改掉，然 后将“修饰”后的胚胎干细胞植入小鼠的早期胚胎，生成嵌合体小鼠。 这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被“修饰”过的基因和未被 “修饰”的基因。如果某些小鼠的生殖细胞恰巧被“修饰”过了，则 它们就会生出基因完全被“修饰”过的小鼠
PCR
B
A
C
质粒的构建 构建一种质粒敲掉phaZ基因
转基因和基因敲除技术介绍
张晓军 刘杰 魏岱旭
主要内容
转基因技术 基因敲除技术 文献
一、转基因（Transgenesis）技术
定义：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中， 由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰的 技术
微生物中的基因转移
植物转基因技术
动物转基因技术
1、微生物中的基因转移
a1
A2
第二次重组的第二种情况
A1 a2
b
a1 A2 目的基因 B
A1 a2
B
目的基因
A2 a1
A
A1 A2 目的基因
B
b a1 a2
b
第一次重组
第二次重组
x
目的基因不在基因组上
目的基因还是在基因组上
转导：由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗 传交换的一种方式
一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到 另一个细胞中
3.RNA干扰引起的基因敲除
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进 化过程中高度保守的、由双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效 特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上 由双链RNA诱发的基因沉默现象。所以RNAi的反应过 程也可以用于基因敲除。
转化
转导 接合 溶原性转换 原生质体融合
2、植物转基因技术
农杆菌介导转化法：根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti 质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入 细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
基因枪介导转化法：利用火药爆炸或高压气体加速（这一加速设备被 称为基因枪），将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入 完整的植物组织和细胞中。
RECOMBINATION
第一次重组
A、B为一段DNA序列，并非是基因
A
B
A1 A2 目的基因
a1 a2 a
构建质粒 b
A1 a2 b
a1 A2 目的基因 B
第二次重组的第一种情况
A1 a2
b
a1 A2 目的基因 B
A1 a2
b b1 b2
a1 A2
目的基因
A1 a2
B2 B1 B
b1 B2
目的基因
Pseudomonas stutzeri 1317, were expressed in the mutant strains to test the PhaC enzyme substrate specificity. The result showed P. putida KTOY01 or KTOY02 could provide not only mcl PHA monomers but also 3-hydroxybutyrate from fatty acids, which may allow the production of copolyesters poly(3HB-co-mcl 3HA). Plasmid pCJY10 containing phaC2Ps, phbA, and phbB genes encoding PHA polymerase, b-ketothiolase, and acetoacetyl-CoA reductase, respectively, were transformed into P. putida KTOY01 and KTOY02. Shake-flask culture showed P. putida KTOY01 or KTOY02 (pCJY10) could accumulate poly(3HB-co-mcl 3HA) from glucose. The above result showed pha operon knockout mutant of P. putida KT2442 was a very useful host of great potential not only for studying PhaC synthase, but also for microbial production of copolyesters poly(3HB-co-mcl 3HA), which is very difficult to abtain.
实验目的： 在P.Putida KT2442基因组中敲掉目的基因 phaC1-phaZ-phaC2,检测不同phaC基因的特 异性
运用原理：同源重组的基因敲除
Abstract
Pseudomonas putida KT2442 could accumulate medium-chainlength poly(hydroxyalkanoate)s (PHA) consisting of 3hydroxyhexanoate, 3-hydroxyoctanoate, 3-hydroxydecanoate, and 3-hydroxydodecanoate from a wide range of carbon sources. In this study, the PHA synthase pha operon (phaC1-phaZ-phaC2) was knocked out and the vgb gene encoding vitreoscilla hemoglobin protein (VHb), which could enhance oxygen uptakerate especially at low oxygen concentration, was integrated into the P. putida KT2442 genome to replace the deleted fragment. The resulting mutant P. putida KTOY01 or gene-replaced mutant KTOY02 was used as the host to study PHA synthase properties and PHA production. Different PHA polymerase (PhaC) genes, phaCRe from Rastonia eutropha H16, phaCAc from Aeromonas cavie, and phaC2Ps from
接合：是供体菌通过性菌毛相互沟通，将 供体菌的遗传物质（质粒）转移给受体菌。
溶原性转换：温和噬菌体感染细胞后使之 发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主 染色体上，而使后者获得了新性状的现象。
原生质体融合：将两个不同的细菌在溶菌酶 或青霉素作用下，失去细胞壁成为原生质 体后进行融合的过程
反转录病毒转染法：把含有重组的逆转录病毒载体病毒颗粒去感染卵 裂期胚胎，于是携带外源基因的逆转录DNA可以在感染过程中，整合 到宿主细胞的染色体上。
体细胞核移植
二、基因敲除技术
定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。 1、应用DNA同源重组原理进行基因敲除。 2、利用随机插入突变进行基因敲除 3、RNA干扰也可以引起基因敲除
花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用 植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精 卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的 发育而成为带转基因的新个体。
3、动物转基因技术
显微注射法：在显微镜下，直接将DNA注射到胚胎的细胞核内， 再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。
基因敲除技术与诺贝尔奖
医学领域的诺贝尔奖（2007年）已经揭晓。三位在基因敲除技术方面进行了 卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了诺贝尔生理或医学奖，他们 是美国盐湖城犹他州大学的Marie Capecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的 Oliver smithies教授以及英国加蒂夫大学的Martin Evans教授