SDS_PAGE-原理和方法
SDS-PAGE电泳的基础原理和试验步骤
SDS-PAGE电泳的基础原理和实验步骤概述十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。
此项技术的原理，是根据检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。
在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中，SDS-PAGE更是必不可少的操作，其通常用于检测蛋白的表达情况（表达量，表达分布），以及分析目的蛋白的纯度等。
SDS-PAGE作用机理蛋白中含有很多的氨基（+）和羧基（-），不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷，为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理（上样缓冲液）。
即在样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的上缓冲液。
SDS即十二烷基磺酸钠（CH3-（CH2）10-CH2OSO3-Na+），是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。
电泳样品加入样品处理液后，经过高温处理，其目的是将SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷；另外样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程；另外样品处理液中还加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。
当样品上样并接通两极间电流后（电泳槽的上方为负极，下方为正极），在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。
样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含SDS多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。
电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8的上层，pH8.8的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。
出现了pH 不连续和胶孔径大小不连续：启动时Cl¯解离度大，Pro¯解离度居中，甘aaCOO¯解离度小，迁移顺序为（pH6.8）Cl¯>Pro¯>—COO¯。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量
02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂， 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术， 如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
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白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白，可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比，因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。
简述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和应用
简述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和应用1. 原理SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，简称SDS-PAGE）是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
它基于蛋白质的分子量和电荷差异，通过电场作用将蛋白质分离成不同的带。
SDS-PAGE的原理基于以下几个方面：1.SDS的作用：SDS是一种阴离子表面活性剂，可以使蛋白质分子迅速与其结合，并赋予蛋白质大量的负电荷，使得蛋白质在电场中按照大小和形状进行分离。
2.聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶是一种聚合物，可以形成一种网状结构，这种结构具有孔隙，可以通过孔隙大小筛选不同大小和形状的蛋白质分子。
3.电场作用：在电泳槽中施加电场后，带负电荷的蛋白质会向阳极迁移，迁移速度取决于蛋白质分子的质量和形状。
通过以上原理，可以将蛋白质样品加载在聚丙烯酰胺凝胶的孔隙中，然后施加电场，蛋白质按照其分子量的大小和形状进行分离，最终形成不同的蛋白质带。
2. 应用SDS-PAGE广泛应用于生物医学和生命科学的各个领域，以下是SDS-PAGE的几个主要应用：2.1 蛋白质分离与纯化SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离和纯化技术。
通过SDS-PAGE，可以将混合蛋白质样品根据其分子量进行分离，得到纯化的蛋白质。
这对于研究蛋白质的结构、功能以及相互作用具有重要意义。
2.2 亚细胞结构研究通过SDS-PAGE，可以将细胞或亚细胞结构中的蛋白质分离出来，进一步研究其在细胞内的定位、功能以及与其他分子的相互作用。
这有助于揭示细胞和亚细胞结构的功能机制。
2.3 蛋白质质量测定通过SDS-PAGE，可以通过与已知分子量的蛋白质标准品进行比较，估计未知蛋白质的分子量。
这对于研究蛋白质的结构、功能以及其在生物过程中的变化具有重要意义。
2.4 蛋白质组学研究SDS-PAGE结合质谱技术可以进行蛋白质组学研究。
SDS-PAGE原理及结果分析技巧
20161111
聚丙烯酰胺凝胶
➢ 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide,Acr）和交联剂 N’N’-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide, Bis）以29:1的比 例在聚合剂过硫酸铵(ammonium persulfate，APS)和催化剂
测定分子量
非还原/还原蛋白质状态的比较：为什么要用还原性电泳测分子量？
测定分子量
测定分子量ຫໍສະໝຸດ 测定分子量测定分子量
测定分子量
纯度分析
含量测定
含量测定
含量测定
蛋白质水解分析
蛋白质水解分析
组分分析
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TEMED的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
➢ 优点：
• 凝胶孔径可调节（改变单体和交联剂的浓度），因此可根据被分 离物的分子量范围选择合适的浓度 • 灵敏度可达1mg • 分辨率高，可分离大小相差仅3%的多肽。尤其在不连续凝胶电泳 中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体 • 无电渗作用，只要纯度高，操作条件一致，样品分离重复性好 • 凝胶透明，有弹性，机械效能好 • 化学性能稳定，与分离物不发生化学反应; 对pH和温度变化较稳定
PAGE 电泳原理
➢ 分子筛效应: 分子大小和形状
➢ 电荷效应：大部分的蛋白质在pH8.3电泳缓冲液的条件下
带有负电荷，表面负电荷多的蛋白质迁移快，反之则慢
（强阴离子去污剂SDS使蛋白结构松散，并带上大量负电荷， 导致本身电荷差别消失，因此SDS-PAGE分离蛋白主要依 赖分子大小，而非电荷或形状）
➢ 分析纯度 ➢ 测定蛋白质的含量 ➢ 蛋白质水解分析 ➢ 鉴定修饰（糖基化） ➢ 分离纯化 ➢ 结合Western Blot、免疫共沉淀等方法可用来鉴别
SDS-PAGE
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
3、蛋白质-SDS复合物的特点：
形状像一个长椭圆棒。 短轴对不同的蛋白质-SDS胶束基本上是相同的。
长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。
所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有电荷，消除了蛋 白质分子间原有电荷的差异。 在SDS-PAGE电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电 荷的影响，主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或 亚基分子量的大小。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
四、SDS-PAGE的应用
1、蛋白质纯度分析 2、蛋白质分子量、浓度的测定
3、免疫印迹的第一步
4、蛋白质修饰的鉴定 5、分离放射性标记的蛋白质 6、分离和浓缩用于产生抗体的抗原 7、显示小分子多肽
蛋白质分子量大小而定）； ② 恒定电压电泳一定时间； ③ 电泳结束后取下凝胶，至染色液中染色，过夜； ④ 用脱色液脱色至结果可见，经扫描保存。 结果分析参照蛋白质标准对照进行，或进一步进行 western blotting，分析不同蛋白质分子的组成。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
Western blotting多种蛋白的检测
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
二、SDS-PAGE样品检测
SDS-PAGE一般采用不连续缓冲系统，由Tris/甘氨 酸电极缓冲液、浓缩胶和分离胶构成，采用垂直电泳的 方式对待检测样品进行分析。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
二、SDS-PAGE样品检测
SDS-PAGE操作步骤如下：
① 采用一定浓度的浓缩胶和分离胶对样品进行检测（视
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-PAGE-蛋白电泳分析
SDS－PAGE 蛋白电泳分析一、目的掌握SDS-PAGE 电泳原理与方法二、电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。
这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。
由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。
三、试剂配制1．30% 丙烯酰胺：将29g 丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml 的水中。
加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。
用过滤器（0.45μm 孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温(丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。
称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料)。
2．1M Tris-Cl: 称取12.191g Tris 碱溶于80ml 蒸馏水中，用浓HCl 调到所需pH 值，定容至100ml。
SDS-PAGE原理及结果分析技巧课件
蛋白质在电场中会带电并在凝胶中移动，根据蛋白质分子量的不同，分离效果尤为显著。
SDS-PAGE的原理
1
样品处理
将待分离的蛋白样品添加SDS和还原剂，使之均质并去除与蛋白质分子量无关的 影响因素。
2
凝胶制备
制备聚丙烯酰胺凝胶，将凝胶浸泡在缓冲液中，直到完全交换缓冲液。利用缓冲 液在凝胶中形成pH梯度。
蛋白质分析软件
利用软件分析和解析SDS-PAGE 的光密度曲线，获取蛋白质的分 子量和含量等重要信息。
结果分析的基本原则
1 确认实验重复性
结果比较前应该确保实验 的可重复性，包括条件和 等量样品。
2 正确选择染色方法
染色的方法不同会影响蛋 白质条带的清晰度。
3 标准品的鉴定和确定
选择合适的分子量标准品 确定要检测的蛋白质分子 量范围。
结果分析的常见技巧
条带密度
密度越高，代表含量越丰富； 密度越低则代表含量越少。
比较分析
对比两个或以上样品的分离情 况和分子量等信息。
精细分析
利用一些特殊的处理和分析方 法，深入研究某一结果，如半 定量分析、分析带的异质性、 修改成像等。
结果分析的常见问题
条带分离不清晰
检查凝胶和样品的处理，或更换蛋白质分子量标准品。
SDS-PAGE原理及结果分析 技巧
本次课件将介绍SDS-PAGE技术的原理和步骤，并分享结果分析的基本原则、 常见技巧、问题和注意事项。
SDS-PAGE的定义
什么是SDS-PAGE?
SDS-PAGE，即聚丙烯酰胺凝胶电泳，是一种分离蛋白质的常用方法。
SDS-PAGE的作用？
SDS-PAGE可以将复杂的蛋白质混合物分离出各个单一的蛋白质分子，有化分析结果 的象征。
SDS-PAGE原理、方法详解
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、材料准备（1）丙烯酰胺单体（Arc）：在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺（2）N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）：交联剂（3）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。
（4）10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。
配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于1ml双蒸水中。
过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。
（5）N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED）：其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。
配制方法：原液使用。
应使用电泳级TEMED。
（6）30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液）配制方法（50mL体系）：14.55 g丙烯酰胺＋0.45 g N，N-甲叉双丙烯酰胺，先用40ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至50 ml，0.45μm滤膜过滤。
用棕色瓶储存于4℃（丙烯酰胺单体贮液在储存过程中因光和碱催化发生脱氨反应，会缓慢转化成丙烯酸和双丙烯酸，储存液应测定pH值不超过7.0。
丙烯酰胺单体贮液应在暗色瓶中保存，每隔数月须重新配制。
丙烯酰胺具有很强的神经毒性和致癌性，并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量时必须戴手套和面具。
）（7）分离胶缓冲液（pH8.8的Tris-HCl缓冲液）：1.5M Tris-HCl，pH8.8。
配制方法：9.08 g Tris溶解在40ml 双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值8.8，再用双蒸水加至50ml。
4℃保存。
（8）浓缩胶缓冲液（pH6.7的Tris-HCl缓冲液）：1.0M Tris-HCl，pH6.8。
配制方法：6.06 g Tris溶解在40 ml双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值6.8，再用双蒸水加至50 ml。
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D.
E. F.
The Apparatus
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/images/pipetting.jpg
Proteins treated with sample loading buffer containning SDS and Me
The Principle
MW estimation: standard curve Proteins separation by SDS-PAGE is due solely to differences in size, so, this method can be used to determine MW of proteins. A calibration curve can be made by plotting relative mobility of standard proteins ( i.e. mobility relative to bromophenol blue track dye)versus their log MW, and subsequently used to estimate the MW of an unknown protein running on the same gel.
A Quick Intro to the SDS-PAGE
1. 2. Stands for sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Proteins are separated using polyacrylamide gels rather than agarose gels, because the polyacrylamide matrix: A) have pore sizes similar to the sizes of proteins (DNA is usually larger in size) B) are much tighter than agarose gels, thus are able to resolve the smaller protein molecules. 3. 4. Separates proteins according to molecular weight. Prior to electrophoresis, proteins are treated with sample loading buffer containning sodium dodecyl sulfate and dithiothreitol.
Migration of band (cm)
Relative migration/mobility
Rf =
Migration of dye front (cm)
The Procedure
1. Preparation of the gel Reagents
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
Proteins Separation by SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
He Zhiliang Chongqing Medical University November 13, 2010
Workshop Outline
A. B. C. The Apparatus used in the experiment. An Intro to the SDS-PAGE The principle: C1. About the gel C2. About SDS C3. About DTT C4. MW estimation and standard curve The Procedure: D1. preparation of the gel D2. sample preparation D3. running the gel D4. protein detection by stainning Notes Discussion
2
A lower separating (ruuning) gel with higher concentration(7%~15% ) of gel and high pH(8.8) → separates according to molecular weight.
/~williams/bCourse_Information/4581/techniques/gel_elect/gel.jpg
2.
The Principle
About DTT/ME
1,4-dithiothreitol (DTT) or 2-mercaptoethanol (ME)are used to cleave disulfide bonds of proteins.
Hale Waihona Puke DTT/MeSHS-S HS
The Principle
The Procedure
1) Clean and completely dry the plates, combs, and any other experiment materials. Assemble the system according to manufacturer’s instruction. 2) Prepare the separating gel solution as directed in the tabe of last page. Ammonium persulfate and TEMED are added when the gel is ready to be polymerized, stir gently, then immediately apply to the sandwich until the gel height is lower 1.5 cm than the short plate. Allowing the gel to polymerize 30~60min by covering gently with a layer of water (1cm). 3) Until a sharp optical discontinuity at the watet/gel interface is visible, pour off the water. 4) Prepare the stacking gel solution in a similar way to the separating gel . Insert the comb and allow the gel to polymerize completely.
The Principle
About SDS
1.
linearlizes the protein structure, eliminates the effect of differences in shape . gives the protein an overall negative charge with a strength that is relative to the length of the protein. SDS coats proteins with approx. uniform charge-to-mass ratio (approx. 1.4g SDS/g protein).
The Principle
polymerization
The Principle
A discontinuous gel system is used frequently
1. An upper stacking gel with low concentration (2.5%~5% ) and low pH(6.8) →
Chloride ions move faster (leading ions) than glycine (trailing ions) and create steep voltage gradient. Glycine ions are pulled due to the charge gradient and the two ions move at same speed. The proteins with intermediate mobility are carried along becoming stacked into very thin, distinctive layers in order of mobility.
The Principle
About the gel Polyacrylamide gels (PAG)are formed by the
polymerization of acrylamide in aqueous solution in the presence of small amounts of a bifunctional crosslinker, usually bisacrylamide (bis). The polymerization occurs via a free-radical mechanism after adding a catalyst. 1) ammonium persulfate initiates free radicals 2) tertiary aliphatic amine N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) is a catalyst for free radical propagation The copolymerization a mesh-like network in three dimensions, consisting of acrylamide chains with interconnections formed from the bisacrylamide. Gel pore size is determined by the total acrylamide concentration and degree of cross-linking that regulated by varying ratios of acrylamide to bisacrylamide.