柱层析色谱实验操作
层析柱原理和使用方法
层析柱原理和使用方法
层析柱原理是一种常用的色谱技术，可以分离复杂混合物中的各个组分。
层析柱是一个长管状结构，内部填充有吸附剂或离子交换树脂等材料。
根据组分在填料中的亲和性差异，不同组分会以不同的速度通过填料，从而实现分离。
层析柱的使用方法如下：
1. 样品预处理：将混合物中的目标组分溶解或悬浮于合适的溶剂中，并进行必要的样品处理（如pH调整、过滤等）。
2. 建立实验条件：选择合适的填料材料、填料粒径和填充方法，并确定适当的溶剂体系和流动相条件。
3. 装填填料：将选择好的填料装入柱中。
填料的打包密度和均匀性对色谱分离效果有重要影响，因此要确保填料的均匀性和紧密度。
4. 平衡柱：用流动相预浸柱，使填料均匀吸附流动相，并达到平衡状态。
平衡时间根据填料种类和样品性质而定。
5. 注射样品：将样品以适当的体积注射到柱中，并控制注射速度和压力。
6. 运行分析：启动流动相，控制流动相速度和温度，使样品组分逐渐分离，并记录结果。
7. 数据分析：根据检测器的信号，对分离出的目标组分进行定性和定量分析。
层析柱的使用注意事项：
1. 填料选择：根据被分离组分的性质选择合适的填料。
2. 流动相选择：要确保流动相对目标组分具有足够的分离能力。
3. 注射量控制：注射量应根据柱容量和检测器灵敏度进行合理
控制。
4. 柱温控制：柱温对于某些温度敏感性样品的分离效果有重要影响，可以根据需要进行柱温控制。
5. 柱保养：正确使用和保养层析柱，避免杂质吸附和填料破碎等情况的发生。
6. 数据分析：及时记录和分析实验结果，确保实验数据的准确性和可靠性。
柱层析实验报告.doc
柱层析实验报告.doc
柱层析实验是一种分离和纯化混合物的技术，利用不同物质在柱层析填料上的吸附性能差异，通过逐步洗脱来获得纯品。
本实验以小麦胚芽中的皂苷为主要研究对象，通过柱层析方法提取和纯化皂苷。
实验步骤：
1. 制备填料溶液：将0.5克硅胶和正己烷按1：10的比例配制成1%的硅胶溶液。
2. 准备样品：将10毫克小麦胚芽粉末加入10毫升甲醇中，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液作为实验样品。
3. 柱层析操作：使用玻璃柱装填1.5毫升硅胶填料，以极性小的正己烷为移液相，以甲醇为静相，样品用滴定管加入玻璃柱，分别收集不同分离峰的组分。
4. 进行TLC鉴别：将分离峰组分涂于TLC板上，以正己烷和甲醇为展开剂，在紫外灯下观察其色谱带。
实验结果：
实验得到了3个分离峰组分，分别对应TLC上的3个色谱带。
经过比较和鉴别，第1个分离峰为脂肪酸甲酯，第2个分离峰为皂苷，第3个分离峰为芦丁。
实验中使用的柱层析操作可在短时间内对小麦胚芽中的皂苷进行有效分离和纯化。
柱层析方法可以用于许多化学研究和工业生产中，例如生物化学、制药和化妆品等领域。
实验中需要注意的是，柱层析操作时不应以过量样品洗脱柱层析填料，否则可能引起柱塞，而且应适当控制移液相和静相的选择和比例，以达到较好的分离和纯化效果。
总之，本实验通过柱层析的方法成功分离和纯化了小麦胚芽中的皂苷，为后续研究和应用提供了基础支持。
(完整版)柱层析的操作步骤和注意事项
柱层析技术常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。
我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。
由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。
柱子可以分为：加压，常压，减压。
压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。
所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。
减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝聚），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。
以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。
加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。
压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。
非凡是在轻易分解的样品的分离中适用。
压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。
个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。
关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好。
柱子长了，相应的塔板数就高。
柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。
试想假如柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。
而假如样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较轻易得到完全分离了。
当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。
现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。
假如所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm 的柱子）；假如相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm 的，也可以减小淋洗剂的极性等等。
柱层析实验报告
柱层析分离色素一、【实验目的】1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。
2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。
二、【实验原理】叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。
利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。
柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。
常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。
吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。
由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。
继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。
用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。
本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。
由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。
三、【实验材料】原料：新鲜的菠菜叶试剂：1．无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝2．石英砂 6．饱和氯化钠溶液3．丙酮 7.水硫酸钠4．石油醚（60-90℃） 8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材：层析柱（1×30cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，铁架台四、【实验操作】1．色素的提取：20克菠菜，加少许石英砂，再加20毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中,再加入40毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用. 2．样品的浓缩：将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5-8毫升左右，以备加样使用。
层析柱 操作规程
层析柱操作规程
《层析柱操作规程》
层析柱是一种分离和纯化化合物的工具，它在实验室和工业生产中都得到广泛应用。
为了正确、高效地运用层析柱进行实验操作，必须严格按照规程进行操作。
1. 准备工作
在开始操作层析柱之前，首先需要检查仪器设备和试剂是否准备就绪。
确保层析柱、柱子和柱底都是干净的，没有杂质和残留物。
同时，检查溶剂和流动相的浓度和pH值是否符合实验要求。
2. 样品预处理
样品在进入层析柱之前，需要进行适当的预处理。
通常包括溶解、过滤或稀释等步骤，以确保样品的纯度和浓度符合层析柱的使用要求。
3. 层析条件选择
根据样品的特性和分离要求，选择合适的层析柱和流动相。
流动相的选择包括了溶剂的种类、比例和流速等参数，需要根据实验要求进行合理选择。
4. 样品加载
将经过预处理的样品通过适当的方法加载到层析柱中。
可以采用重力流动、压力注入或者其他方法，确保样品均匀地进入层析柱。
5. 层析过程监控
在样品加载后，需要监控层析过程并进行记录。
包括流出液的收集、色谱图谱的观察等，以便及时发现异常情况并进行调整。
6. 收集和分析分离物
根据层析过程中的监控数据，及时收集目标物质，并进行分析和检测。
可以通过色谱、质谱等技术进行分析，得到分离物的纯度和产率数据。
7. 层析柱的清洗和保养
在操作完毕后，及时清洗和保养层析柱。
包括流动相的冲洗、柱子和柱底的清洗以及存放，以保证下次使用时的质量。
在实验操作层析柱时，严格按照规程进行操作，能够确保实验的准确性和重复性，同时也保证了仪器设备的长久使用。
层析柱操作规程
层析柱操作规程
《层析柱操作规程》
一、前言
层析柱操作是化学分离和纯化技术中常用的一种手段，它能够对混合物中的成分进行有效的分离。
为了确保操作过程的顺利进行和分离效果的最大化，需要制定一套严格的操作规程。
二、设备准备
1. 确认层析柱和相关设备是否完好，无污染；
2. 准备好使用的溶剂，保证纯度和新鲜度；
3. 根据实验需求，准备好实验所需的各种样品和标准物质；
4. 准备好密封垫和管接头等辅助器材。
三、操作步骤
1. 将层析柱连接至固定相泵；
2. 实验前先进行层析柱的扫表，观察并记录基础数据；
3. 使用实验样品进行预洗柱操作，确保固定相表面无污染；
4. 将样品溶解于溶剂中，装入进样瓶，连接至固定相泵；
5. 开始进行层析分离操作，收集分离出的目标成分，并记录各分离组分的流出时间；
6. 根据实验需求，对分离得到的目标物质进行进一步的纯化操作；
7. 实验结束后，对层析柱进行清洗消毒，保持设备的卫生和使用寿命。
四、实验注意事项
1. 操作过程中要随时检查设备状态，及时处理出现的故障和异常；
2. 严格遵守操作规程，不得随意更改操作步骤；
3. 对固定相、流动相、样品等各项实验条件进行严格控制，确保实验的准确性和可重复性；
4. 清洗消毒后的层析柱应储存于干燥通风的地方，避免细菌污染。
五、结语
层析柱操作规程的制定和执行对于保证实验的顺利进行和分离效果的最大化具有重要意义。
实验人员在操作过程中需严格遵守规程，不得有过失。
同时，定期检查和维护层析柱设备，确保设备处于良好状态，也是保证实验顺利进行的重要环节。
柱层析法分离甲基橙和亚甲基蓝
柱层析法分离甲基橙和亚甲基蓝
1、装柱（湿法）
取一支色谱柱（25ml酸式滴定管），在柱子的收缩部塞一小团脱脂棉花，注意松紧要适度。
将色谱柱垂直固定在铁架台上，往柱内加适量95%乙醇溶液，打开活塞，赶走气泡。
再向柱中倒入适量95%乙醇溶液，控制滴速为1滴/秒，用小锥型瓶承接，同时通过漏斗慢慢装入15g中性氧化铝（以95%乙醇混悬），使其逐渐沉入底部。
用洗耳球敲打柱子，使氧化铝装实、均匀。
2、加样
当溶剂的液面刚好流至氧化铝表面时关闭旋塞，立即用滴管加入待分离混合液（甲基橙和亚甲基蓝混合液）0.5mL，尽量避免分离混合液粘附在柱的内壁上。
打开旋塞，当此溶液流至接近表面时，立即用少量溶剂洗下管壁的有色物质，关闭旋塞。
3、洗脱
向柱内加入95%乙醇，打开旋塞进行洗脱。
用锥形瓶收集蓝色的亚甲基蓝溶液。
当蓝色溶液收集完后，等柱内柱内液面接近滤纸面时，加入水洗脱，用锥形瓶收集橙色的甲基橙溶液。
注意洗脱时切勿使溶剂流干！
实验结束后，应让溶剂尽量流干，然后倒置，用吸耳球从活塞口向管内挤压空气，将吸附剂从柱顶挤压出。
使用过的吸附剂倒入垃圾桶里。
试述柱层析的基本操作过程
试述柱层析的基本操作过程柱层析是一种常用的色谱分离技术，广泛应用于生物、化学、医药等领域。
以下是柱层析的基本操作过程，主要包括以下几个方面：1. 装柱首先，选择适当规格的色谱柱，将其清洗干净并晾干。
然后，在色谱柱中装入适量的吸附剂或凝胶，注意要将其填充均匀，不留气泡。
最后，用柱塞密封色谱柱，以防止样品进入柱体时发生泄漏。
2. 上样将需要分离的样品按规定要求放入色谱柱的上部，然后在适宜的pH和离子强度下进行上样。
上样过程中要注意控制流速，避免样品快速通过色谱柱，导致分离效果不佳。
3. 洗脱通过改变洗脱液的组成和离子强度，选择合适的洗脱液进行洗脱，使目标化合物与吸附剂充分分离。
洗脱过程中要控制好流速，使洗脱液能够充分淋洗柱体中的样品。
通常采用分步洗脱的方式，根据化合物的不同性质，依次选用不同的洗脱液进行洗脱。
4. 收集在洗脱过程中，将洗脱液收集于合适的容器中，并贴上标签，注明时间和条件等信息。
收集的容器通常采用锥形瓶或烧杯等具有良好倾倒性的容器。
5. 检测根据需要，可以采用各种方法对收集到的液体进行检测，判断目标化合物是否成功分离。
常用的检测方法包括紫外-可见光谱法、红外光谱法、质谱法等。
检测过程中要注意对照标准品，确保分离得到的化合物与目标化合物一致。
6. 洗柱为了防止杂质吸附，需要定期更换洗脱液，并进行洗柱操作。
洗柱过程中要注意控制好流速，避免过快导致吸附剂流失。
通常采用逐步降低流速的方式进行洗柱，直到流出液与洗脱液一致为止。
7. 记录记录实验过程中的各种操作和检测信息，以方便实验过程的追溯和整理。
记录的内容包括实验日期、实验人员、色谱柱规格、吸附剂类型、样品名称和来源、上样条件、洗脱液组成和离子强度、流速控制、检测方法等。
这些信息将有助于对实验结果进行分析和总结，提高分离效果和实验效率。
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缺点：使用湿法则需要较多的溶剂，导致上 样层变厚，分离效果不好。
洗脱与检测
在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程。
当我们选定好洗脱液后，洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱 三种。
简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止 。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或 洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适 方能使各组分的分配系数较大。否则应采用下面的方法。
流动相体系的选择
特殊样品：会造成拖尾，严重影响分离效果 碱性物质
洗脱剂中加千分之一的三乙胺，或用千分之一到百分之 一的氨水、三乙胺或者氨甲醇，碱化柱子。
酸性物质
洗脱剂中加千分之一的醋酸。
如果流动相中加入酸碱，再洗脱完毕时，有必要时应水 洗除去洗脱剂中的酸碱。
层析柱的选择
关于柱子的尺寸，应该是粗长 的最好 ：横截面/高度比
柱层析色谱
基本原理
色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在 两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同 来进行分离的。
由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与 固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随 着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次 的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不 同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适 当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的 分离与检测。
气泡的产生与排除
气泡产生原因 由于溶剂和吸附剂之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产
生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然 产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加 溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花。另外，在 变换洗脱剂时，由于溶剂极性的改变页容易产生气泡；天气太热，溶剂挥发 也易产生气泡。 排除对策： 1.装柱之前应搅拌均匀，然后装柱； 2.装柱尽可能一次性的装完， 3.一定要用较多的溶剂“走柱子”，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到 室温后再撤去压力 4.过柱的时候，你是否干过柱，这也会产生气泡； 5.在装完柱后，最好在硅胶上方加一片圆形滤纸，加上后再加一块棉花，这 样加溶剂冲洗时，可以避免冲起硅胶，产生气泡； 如果气泡已经产生，可以： 1.加压驱赶气泡；
再 在 上 面 加 入 一 层 约 0.5cm 厚的洁净细砂，轻扣击柱管，使砂 面平整。
装柱
干法
直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧， 至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度， 最后再用气泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。
接着是用洗脱剂“走柱子”，一般洗脱剂是采用TLC 分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面 加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较 方便，但最大的缺陷在于“走柱子”时，由于溶剂和硅胶 之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产 生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲 烷更为明显。
洗脱完毕，采用薄层色谱法对各收集液进行鉴定，或紫外 光检测，以洗脱液体积对被洗脱物质浓度作图，可得到洗脱 曲线把含相同组分的收集液合并，除去溶剂，便得到各组分 的较纯样品。
制备板分离
原理同TLC
展
制备板：吸附剂GF254
开 方
向
0.3~0.4mm
载样量<100mg 点样处
操作流程
将样品溶解，用0.5或0.9mm毛细管将样品均
洗脱剂可根据分离物中各成分的极性、溶解度 和吸附剂的活性来选择。所用洗脱剂的浓度大小 和极性强弱的选择，需通过试验确定。
在实践中，选择洗脱剂的顺序是由极性小到极 性大(正向层析)。当把极性小的洗脱剂换成极性 大的时，宜先将极性大的和极性小的洗脱剂混合 使用，浓度则由低到高。总之，选用洗脱剂的原 则是能较完全地洗脱所要分离的成分，并力求用 量少、洗脱时间短。
在选择一定的流动相的前提下，调整流动相组分或比例，使目标 物的Rf值为0.2~0.3，与邻近杂质的分离度最好在0.1以上（当然是 越大越好，Rf达到0.2~0.3就很容易分离了）
根据所选的吸附剂的目数
因为TLC是高效板，硅胶柱的分离效果较差，所以一般需要在 TLC流动相的基础上放大5~10倍，甚至更多才可以得到相似的分离 度
传质阻抗项(C·u) 产生原因：组分在两相间分配，组分未及溶解就被带走或者 进入固定相的组分未及解吸，从而造成峰扩张。
速率理论
分类
柱层析方法分类： 吸附色谱柱：吸附剂，洗脱剂（流动相）； 分配色谱柱（萃取原理）：载体，固定相， 流动相； 离子交换树脂柱； 凝胶柱
吸附色谱柱较为常用，下面重点讨论
吸附剂
硅胶 中性、酸性，比较适合分离中性或酸性物质 粒度100~200目，200~300目，300~400目，更 高
氧化铝 酸性，适合分离酸性物质 中性，pH值7.5，适合分离碱性物质 碱性，pH值10，适合分离碱性物质
聚酰胺 硅藻土 活性炭
吸附剂的选择
中性、酸性物质优先试用硅胶分离，如果 效果不好可以使用氧化铝
流动相体系
正己烷和石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二 硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯 <丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸
极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统（有时样品溶 解性差的可以加入二氯甲烷）
极性较大的用 甲醇：二氯甲烷系统 极性大的用 甲醇：水：正丁醇：醋酸系统
匀的点在板的下方，吹干溶剂，放入展缸展开。 显色或UV确定所要色带，将所需要的色带用小刀
刮下，硅胶用溶解性好的溶剂浸泡，过滤，浓缩， 即可得到产物。
优点：与TLC板情况比较吻合，操作简便，柱效 高，分离效果好。
根据待分离的样品的量进行选 择：装柱太短了可能分离效果不
好，太长了也会由于扩散或拖尾导 致分离效果不好，同时浪费时间， 不稳定的物质还可能会变质。
A0.2)的样品 小目数吸附剂，较大极性，快速过柱
目标产物与杂质Rf值相差很小（0.1~0.2）难以分 离的样品 增加吸附剂的目数和用量，减小洗脱极性， 延长洗脱时间； 或者先进行粗分，除去容易出去的杂质，再 二次层析
碱性物质也可以使用硅胶分离，但需要用 三乙胺等碱性物质碱化吸附剂
如果选择氧化铝分离，需要使用氧化铝TLC 板点板，使用硅胶板不能准确选择流动相 体系
吸附剂的选择
吸附剂目数的选择 对于Rf值>0.4的杂质，可以选择目数100~200的
硅胶 对于Rf值在0.2~0.4的，一般用200~300目 对于Rf值在0.1~0.2的，用300~400目 对于Rf值<0.1的，需要更多的吸附剂用量、较小
流动相体系的选择
首先从待分离物质的结构上判断
1. 极性基团较多的，如胺基、羧基，选择极性 较大的体系。一般为甲醇：氯仿体系，
2. 可形成氢键部位较多的，应选择极性较大的 流动相体系
3. 脂溶性集团较多的，一般乙酸乙酯：石油醚 体系就可以
流动相体系的选择
由TLC实验数据推断柱层析流动相配比：
塔板理论
基于热力学的塔板理论
它是色谱学的基础理论，塔板理 论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离 组分在分馏塔的塔板间移动，在每一 个塔板内组分分子在固定相和流动相 之间形成平衡，随着流动相的流动， 组分分子不断从一个塔板移动到下一 个塔板，并不断形成新的平衡。一个 色谱柱的塔板数越多，则其分离效果 就越好。
塔板理论
理论塔板高度越低，在单位 长度色谱柱中就有越高的塔 板数，则分离效果就越好。
决定理论塔板高度的因素有： 固定相的材质、色谱柱的均 匀程度、流动相的理化性质 以及流动相的流速等。
速率理论----范式方程
➢ 1956 年荷兰学者 van Deemter 等在研究气液色谱时提出 ➢ 色谱过程动力学理论 ➢ 应用了塔板理论板高 H 的概念 ➢ 充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程 ➢ 从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素
分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级 洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用 。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。
梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。 它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值 等。最常用的是浓度梯度。
2.如果还不行，就用高极性的溶剂冲下样品，收集，重新装柱。
上样
干法： 把待分离的样品用少量溶剂溶解后，
在加入少量硅胶（一般是样品的1~2倍量）， 拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小 心加到柱子的顶层。
干法上样较麻烦，但可以保证样品层很 平整。 而且适用于溶解性差的样品，
湿法
湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂， 如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大 的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头 滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。
的流动相体系、较长的时间
洗脱剂的选择
洗脱剂指的是溶解被吸附样品和平衡固定相的溶剂。洗脱 剂的选择基本按照“相似相溶”的原则， 即：即欲洗脱极性大的组分，选择极性大的洗脱剂（如水、乙 醇、氨等）；极性小的组分宜选用极性小的洗脱剂（如石油 醚、乙醚等）， 并应符合下列条件：①纯度较高；②稳定性好；③能较完全洗 脱所分离的成分；④黏度小；⑤易和所需要的成分分开。
van Deemter方程的数学简化式为
H
A
B u
Cu
涡流扩散项：A (1) 产生原因
载气携样品进入色谱柱，遇到来自固定相颗粒的阻力 → 路 径不同→涡流扩散 (2) 影响因素：