如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性
Primer-BLAST：NCBI的引物设计和特异性检验工具
Primer-BLAST：NCBI的引物设计和特异性检验工具一、Primer-BLAST介绍Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。
Primer-Blast可以直接从Blast主页（/）找到，或是直接用下面的链接进入：/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。
Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。
并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。
Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。
二、Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。
提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）。
跟其它的BLAST 一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。
（1）模板（Template）在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。
如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。
Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。
（2）引物（Primers ） 如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。
可以在Primer Parameters 区填入你的一条或一对引物。
并且选择好验证的目标数据库（在specificity check 区选择）。
根据需要可设置产物的大小，Tm 值等。
【必看】使用Primer-Blast比对引物的特异性
【必看】使⽤Primer-Blast⽐对引物的特异性使⽤ Primer-Blast ⽐对引物的特异性什么是引物的特异性引物是⼀段短的单链寡核苷酸，在PCR过程的退⽕阶段，引物与单链模板结合，DNA聚合酶沿着引物的3末端向后进⾏DNA的合成。
引物与模板的结合遵循碱基互补配对的原则，因此，当退⽕温度不合适或引物设计不合理时，引物会结合到模板的⾮⽬标区域，从⽽导致其他⽚段的扩增。
所谓引物特异性，就是引物结合模板正确位置的能⼒，或者避免结合⾮⽬标位置的能⼒。
引物的长度、GC含量、碱基分布、Tm值等性质，均会影响其特异性。
Primer-Blast⽐对引物特异性的原理NCBI收录了诸多物种的基因组DNA、编码序列mRNA以及其他相关核酸序列的数据。
使⽤Primer-Blast进⾏⽐对，⾸先要输⼊⼀对引物序列，并选择序列所属数据库。
此时系统将在该数据库中对序列进⾏查找和对⽐，并将引物可能结合的位置进⾏记录，⼀旦结合位置处于两条链并且产物⼤⼩符合要求，系统就会将这种情况列举到结果中。
需要注意的是，结合模板的引物不仅是⼀条正向⼀条反向，也有可能是两条正向或者两条反向引物。
Primer-Blast⽐对引物特异性的步骤打开NCBI，进⼊Blast，⽹页如下：点击上图红框标记的Primer-Blast，进⼊如下界⾯，在界⾯引物序列处，将正反向引物序列粘贴进去，5-3⽅向。
产物⼤⼩默认为70~1000，可以根据实际情况进⾏调整。
选择相应的物种和参考数据库。
⾸先，要确保Specificity check⼀栏中已经打勾。
Search mode⼀般选择Automatic即可。
物种：⼈源的基因选择Homo sapiens(taxid:9606)；⼩⿏的选择Mus musculus (taxid:10090)；⼤⿏的选择Rattus norvegicus(taxid:10116)。
参考数据库：要看PCR的模板是什么，如果是提取的RNA反转录后得到cDNA就选择Refseq mRNA（针对mRNA）或Refseq RNA（针对mRNA和lncRNA）；若模板是基因组，则应该选择Refseq representative genomes。
一步一步教你使用 NCBI 查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST 序列比对等
一步一步教你使用NCBI 查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST序列比对等最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST 进行序列比对……，这些问题在 NCBI 上都可以方便的找到答案。
现在我就结合我自己使用 NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下 BCBI 的使用。
希望大家都能发表自己的使用心得，让我们共同进步！我分以下几个部分说一下 NCBI 的使用：Part one 如何查找基因序列、mRNA、PromoterPart two 如何查找连续的 mRNA、cDNA、蛋白序列Part three 运用 STS 查找已经公布的引物序列Part four 如何运用 BLAST 进行序列比对、检验引物特异性特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。
关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充First of all，还是让我们从查找基因序列开始。
第一部分利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子（Promoter）下面以人的 IL6（白细胞介素 6）为例讲述一下具体的操作步骤1．打开Map viewer 页面，网址为：/mapview/index.html 在 search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。
操作完毕如图所示：2．点击“GO”出现如下页面：3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene 前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。
2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。
引物验证方法范文
引物验证方法范文1.比较序列法（比对法）：这是一种基于引物与目标序列的比对，通过比较两者的相似性来进行引物验证的方法。
首先，将引物序列与目标序列进行比对，然后利用一些比对算法计算两者之间的相似性分数。
如果相似性分数较高，则说明引物与目标序列非常匹配，可以用于实验。
相反，如果相似性分数较低，则需要重新设计引物。
2. 引物特异性验证：这是一种通过引物特异性验证引物与目标序列之间的选择性结合的方法。
主要包括两个方面的验证：第一是通过BLAST 等工具对引物序列进行比对，确保引物与目标序列是唯一匹配的；第二是通过在PCR反应中引入阻断试验（Melt curve analysis）等技术来检测引物的特异性。
阻断试验可以通过观察引物与非特异性序列之间的结合情况来验证引物的特异性。
3.引物稳定性验证：这是一种通过分析引物的理化性质来验证引物的稳定性的方法。
稳定性是指引物是否会发生降解、氧化或变性等情况，这些都会影响引物与目标序列的结合。
常用的验证引物稳定性的方法主要有电泳、测序等。
通过在实验室条件下模拟引物受到的各种环境因素，观察引物的稳定性变化情况，并根据变化情况选择最佳的引物。
4.引物效能验证：这是一种通过实验检测引物的效能的方法。
它可以通过PCR扩增、酶切等实验来检测引物的效能。
首先，将引物与目标序列一起进行PCR扩增，观察扩增产物的纯度、数量、特异性等。
如果扩增产物满足预期的要求，则说明引物的效能较高。
此外，还可以通过酶切反应来验证引物的效能。
将引物与目标序列一起与特定的酶进行反应，观察酶切产物的大小和数量。
5.使用引物库验证：这是一种通过引物库进行验证的方法。
引物库主要是指包含大量已知引物序列的数据库，例如NCBI的引物库。
在实验设计中，可以通过比对引物库中的引物序列与目标序列，来选择合适的引物。
此外，利用引物库还可以根据目标序列的属性，选择合适的引物设计策略。
总之，引物验证方法对于实验结果的准确性和可靠性非常重要。
Primer-BLAST-NCBI 的引物设计和特异性检验工具
Primer-BLAST：NCBI的引物设计和特异性检验工具一、Primer-BLAST介绍Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。
Primer-Blast可以直接从Blast主页（/）找到，或是直接用下面的链接进入：/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。
Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。
并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。
Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。
二、Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。
提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）。
跟其它的BLAST 一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。
（1）模板（Template）在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。
如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。
Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。
（2）引物（Primers）如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。
可以在Primer Parameters区填入你的一条或一对引物。
并且选择好验证的目标数据库（在specificity check区选择）。
根据需要可设置产物的大小，Tm值等。
一步一步教你使用 NCBI 查找DNAmRNAcDNAProteinpromoter引物设计BLAST 序列比对等
一步一步教你使用NCBI 查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST 序列最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST 进行序列比对……，这些问题在 NCBI 上都可以方便的找到答案。
现在我就结合我自己使用 NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下 BCBI 的使用。
希望大家都能发表自己的使用心得，让我们共同进步！我分以下几个部分说一下 NCBI 的使用：Part one 如何查找基因序列、mRNA、PromoterPart two 如何查找连续的 mRNA、cDNA、蛋白序列Part three 运用 STS 查找已经公布的引物序列Part four 如何运用 BLAST 进行序列比对、检验引物特异性特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。
关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充First of all，还是让我们从查找基因序列开始。
第一部分利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子（Promoter）下面以人的 IL6（白细胞介素 6）为例讲述一下具体的操作步骤1．打开Map viewer 页面，网址为：/mapview/index.html在 search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。
操作完毕如图所示：2．点击“GO”出现如下页面：3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene 前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。
2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。
如何利用BLAST分析验证引物序列
如何利用BLAST分析验证引物序列引物设计完成之后，需要用软件进行分析，找到最佳的引物对，采用Blast分析验证引物，可以知道序列的正确性，也能知道引物的特异性状况、引物的具体位置以及PCR产物的大小。
先找到需要设计引物的目标基因的在有引物序列的mRNA序列，可以通过全文（如最先发现该基因的文章），全文中有时可以找到大鼠c-jun mRNA序列的ACCESSION NUMBER，在PubMed中的“Nucleotide”中用此ACCESSION NUMBER就能找到序列。
可以利用这个ACCESSION NUMBER在PubMed中的“Nucleotide”中搜索到序列后，点击右边的“Links”，再点击里面的“Related Sequences”就能找到所有的大鼠c-jun mRNA序列及其他物种的一些c-jun mRNA序列。
文献中的引物最好先验证其序列正确，并用软件分析引物比较好后再采用。
通过BLAST 验证，既可知道序列是否正确，也可同时了解引物的特异性、引物的位置及PCR产物的大小等。
如果仅仅是为了验证引物序列是否正确（仅适合于基于完全匹配原则设计的引物），也可以用Blast的“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn )”或“Search for short, nearly exact matches”搜索，具体方法为：1. 打开Blast，点击“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”2. 等新页面完全显示后，将引物序列直接copy到“Search”框（没有必要将下游引物序列转换成其互补链），下面3种方法都可以（我觉得3种方法的搜索结果没什么区别，没仔细比较过哦！）（１）直接拷贝上游引物序列，然后直接将下游引物序列拷贝在上游引物后面（２）直接拷贝上游引物序列，在上游引物序列后加一空格，然后直接将下游引物序列拷贝在空格后面（３）直接拷贝上游引物序列，换行，然后直接拷贝下游引物序列注意：记住上、下游引物的长度，如上游引物为19bp、下游引物为18bp，这在查看Blast结果时有用。
使用 NCBI 查找DNA引物设计BLAST序列比对
最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST 进行序列比对……，这些问题在 NCBI 上都可以方便的找到答案。
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关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充First of all，还是让我们从查找基因序列开始。
第一部分利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子（Promoter）下面以人的 IL6（白细胞介素 6）为例讲述一下具体的操作步骤1．打开Map viewer 页面，网址为：/mapview/index.html 在 search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。
操作完毕如图所示：2．点击“GO”出现如下页面：3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene 前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。
2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。
尽管你分别点击后，序列代码、序列代码等有所差异，但碱基基本一致，不影响大家研究分析序列。
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序列比对，绝大多数战友都会想到BLAST，但BLAST的使用确实又是一个很大的难题，因为他的功能比较强悍，里面涉及到的知识比较多，而且比对结束后输出的结果参数（指标）又很多。
如果把BLAST的使用详细的都讲出来，我想我发帖发到明天也发不完，更何况我自己也不是完全懂得BLAST的使用。
所以我在这里也就“画龙点睛”——以比对核酸序列为例来给大家介绍一下BLAST的使用，也算是BLAST 的入门课程吧。
请看帖的战友好好体会，如果你用心看，在看帖完毕之后BLAST
的基本使用（包括其他序列的比对）应该没有问题了。
一、打开BLAST页面，
打开后如图所示：
（缩略图，点击图片链接看原图）对上面这个页面进行一下必要的介绍：
BLAST的这个页面主体部分（左面）包括了三部分：BLAST Assembled Genomes、Basic BLAST、Specialized BLAST。
相信大家可以看懂这三个短语的意思，我就不多说了；我要说的是，可以认为这是三种序列比对的方法，或者说是BLAST的三条途径。
第一部分BLAST Assembled Genomes就是让你选择你要比对的物种，点击相应物种之后即可进入比对页面。
第二部分Basic BLAST包含了5个常用的BLAST，每一个都附有简短的介绍。
第三部分Specialized BLAST是一些特殊目的的BLAST，如IgBLAST、SNP等等，这个时候你就需要在Specialized BLAST部分做出适当的选择了。
总之，这是一个导航页面，它的目的是让你根据自己的比对目的选择相应的BLAST 途径。
下面以最基本的核酸序列比对来谈一下BLAST的使用，期间我也会含沙射影的说一下其他序列比对的方法。
二、点击Basic BLAST部分的nucleotide blast链接到一个新的页面。
打开后如图所示：
=" width=640 height=462 title="Click to iew full ２.JPG (849 X 613)" border=0 align=absmiddle> 介绍一下上述页面：
Enter Query Sequence部分是让我们输入序列的，你可以直接把序列粘贴进去，也可以上传序列，还可以选择你要比对的序列的范围（留空就代表要比对你要输入的整个序列）。
Job Title部分还可以为本次工作命一个名字。
Choose Search Set部分是让我们选择要与目的序列比对的物种或序列种类（genome DNA、mRNA等等）。
如果是人或老鼠的话，就可以直接选择了如果是其他物种就要选择“others”了，这时候网页会主动跳出一个下拉对话框和一个输入
式对话框，你可以分别选择和输入要跟你的序列比对的序列种类和物种。
下面的Entrez Query可以对比对结果进行适当的限制。
Program Selection部分其实是让我们选择本次比对的精确度，种内种间等等。
在BLAST按钮下面有一个“Algorithm parameters” ，这是参数设置选项，一般用户使用不到此项，所以它比较隐蔽，点击，原网页下方即可增加了Algorithm parameters的内容。
大部分战友都用不到更改这里面的选项，我也不多说了，有兴趣的朋友可以自己研究一下。
三、依次填写上述网页必须部分，点击BLAST按钮后，出现如下界面（只截取其中一部分）：
（缩略图，点击图片链接看原图）出现的这个结果页面信息含量非常大，如果我们用心观察，还是可以发现其中的一些主要指标的。
列举上图也是为了给大家展示一下这些评价标准。
其中Description部分推荐大家详细看一下，另外说一下“E alue” 这个指标与其他指标不同，它的数值越小相似程度越高，其他几个（如Totle score）都是数值越高相似度越高。
在这个图示的表格下方就是具体的相似性的核酸序列了，还配合着各种参数的得分。
好了，各位亲爱的战友，我的BLAST就发到这里为止了，更具体的东西有待大家一起去努力研究。
伴随着BLAST的终结，我的“一步一步教你使用NCBI”也要暂时告一段落了，很高兴自己发第一个帖子时说的话今天终于做到了。
以后如果我有新的NCBI使用方法的话，我还会添加到这里来，但我想这一阵子是不会接着发了，呵呵。