293t细胞转染效率不高的原因
293T细胞的培养[1]
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293T细胞的培养[1]293T细胞的培养293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
293T为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。
培养条件为: 完全培养基: 高糖DMEM, 10%胎牛血清; 冻存液: 胎牛血清或完全培养基, 10% DMSO。
传代方法为:1．吸掉293T细胞培养瓶内的培养液;2．吸取适量的无Ca 2+和Mg 2+的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍;3．加少量的0.05%胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2的培养瓶加1 ml, 75 cm 2的培养瓶加2~3 ml), 放到培养箱温育20 s;4．细胞消化完毕, 加适量培养液终止消化, 并吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液;5．加足量的培养液, 分装到新的培养瓶中。
值得注意的是, 293T细胞的贴壁性不强, 轻微的干扰就可能使它们脱落。
所以, 在更换新鲜培养液或者用PBS冲洗的时候应该小心地添加新的培液进去, 以液体不冲打到贴壁的细胞为好。
传代的时候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-EDTA即可轻松把细胞消化下来, 不需要消化很长时间。
有些同学反映293T细胞容易结团不易被吹打开来。
如果遇到这样的情况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿1 ml移液枪反复轻轻吹打, 直至肉眼看不到大的细胞块为止, 然后加适量的培养液混匀, 这时候在显微镜下观察, 可见大多数细胞都是单个的, 只有少量的2~3个细胞聚在一起。
一般293T细胞可以长在塑料的培养瓶底面上直到90%融合, 再以1∶4~1∶8的比率传代。
合适的传代周期为2~3天。
传代过程中,消化的时间越短越好, 显微镜下观察到80%细胞脱落即可加培养液中止。
完成传代后放入培养箱前,应该把培养瓶或培养皿沿X、Y轴方向水平移动几下, 防止细胞都聚在中间或者四周。
冷冻293T细胞的冻存液可以用95%小牛血清加5%二甲基亚砜, 复苏率很高。
细胞实验中常见问题
细胞实验中常见问题
一、细胞培养问题
1.1 细胞生长缓慢或停止生长：可能原因是营养物质不足、血清质量不佳、培养箱温度不稳定或CO2浓度不正确等。
1.2 细胞形态异常：可能是由于培养基问题、营养不足、感染或污染等原因。
1.3 细胞结块：可能是由于细胞密度过大或血清用量过多等原因。
二、细胞活性检测问题
2.1 实验结果不一致或不准确：可能是由于试剂问题、操作误差或实验条件不稳定等原因。
2.2 假阳性或假阴性结果：可能是由于抗体交叉反应、实验操作不当或细胞状态不佳等原因。
三、细胞转染问题
3.1 转染效率低：可能是由于转染方法不正确、转染试剂选择不当或细胞状态不佳等原因。
3.2 细胞毒性：可能是由于转染试剂用量过多或转染条件不适应等原因。
四、细胞计数与消化问题
4.1 细胞黏附性强，不易消化：可能是由于细胞类型或状态不适应于消化方法等原因
4.2 细胞碎片多，影响计数：可能是由于消化过度或消化不充分等原因。
五、细胞标记与染色问题
5.1 染色不均匀或不显色：可能是由于染色时间过短或过长、抗体浓度不当或细胞状态不佳等原因。
5.2 非特异性染色问题：可能是由于抗体交叉反应或抗体纯度不佳等原因。
六、细胞分型与鉴定问题
6.1 分型结果不准确：可能是由于抗体选择不当、操作误差或细胞状态不稳定等原因。
6.2 鉴别困难：可能是由于细胞分化程度高、抗原表达量低或鉴别方法不敏感等原因。
七、细胞感染与病毒问题
7.1 细菌污染：可能是由于培养基或细胞株本身带菌等原因。
7.2 支原体污染：可能是由于培养环境不洁净、操作过程中污染等原因。
1. 吉玛293T转染oligo效率评价步骤
实验材料与方法一、 细胞培养人胚肾293T 细胞，常规培养使用含10% FBS (Gibco)的DMEM 培养基(Gibco)(含1.5 mM L-Glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml Streptomycin)中，37ºC 5% CO 2饱和湿度培养箱中培养。
二、 细胞转染实验材料及试剂D-Hank’s SolutionTrypsin-EDTA Solution (0.05% Trypsin - EDTA, Gibco)Lipofectamin2000转染试剂（Invitrogen ）siRNA-mate （genepharma ）Opti-MEM I Reduced serum medium(Gibco)96孔板 （Corning ）步骤1. 293T 细胞在6cm dish 中培养至80-90%融合时，倾去培养液，用3ml D-Hank’s solution 洗涤细胞两次。
2. 加1ml Trypsin-EDTA solution, 混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC 放置3-5分钟。
3. 在加入2 ml 含10%FBS 的DMEM 培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。
4. 血球计数板计数，将细胞稀释至3×105细胞/ml 。
5. 按3×104细胞/孔的浓度接种96孔板。
6. 转染试剂Lipofectamin2000，用于转染NC-FAM ，剂量如下，每个剂量设三复孔。
Lipofectamin2000 siRNA-mate 转染试剂用量(μl)0.1250.25 0.5 0.25 0.5 1 Oligo 用量（pmol ）10 10 10 10 10 10 吉玛基因7. 每1 OD 260 oligo 用125 μl DEPC-H 2O 溶解，终浓度约为20 μM 。
8. 在1.5 ml EP 管中加入75 μl （25μl/well*3well ）Opti-MEM I ，再加入根据上述表格算出的不同剂量的NC-FAM ，混匀；取另一1.5mlEP 管，加入75 μl （25μl/well*3well ）Opti-MEM I ，加入根据上述表格算出的相应剂量的Lipofectamin2000或siRNA-mate ，混匀，室温放置5分钟后将两组管混合，室温放置20分钟。
293t细胞培养说明书
293T细胞培养说明书一、实验简介293T细胞是由肾脏细胞系统转染外源基因而产生的细胞系，具有较好的培养性和转染性。
因此，293T细胞常用于基因表达研究，尤其是蛋白表达和病毒载体的构建。
二、培养条件1. 培养基：293T细胞培养最常用的培养基是Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)，其次是RPMI-1640培养基。
2. 氧气浓度：293T细胞培养一般需要一个较高的氧气浓度，如5%~10%。
3. 温度：293T细胞的培养温度一般为37℃。
4. 水分：293T细胞的培养液中的水分一般为95%~100%。
5. 添加物：293T细胞的培养液中通常会添加10%的牛血清，以促进细胞生长。
三、细胞培养步骤1. 将293T细胞从细胞库中取出，放入清洗后的培养皿中，以DMEM培养基浸泡；2. 将培养皿放入培养箱，调节温度为37℃，氧气浓度为5%~10%；3. 将添加10%牛血清放入培养液中，搅拌均匀；4. 用细胞活性检测试纸测定细胞活性；5. 根据细胞活性的变化情况，调整培养液中的水分，以维持细胞的生长；6. 将培养液更换，每1~2天更换一次；7. 定期观察细胞形态，记录细胞生长情况。
四、注意事项1. 在培养293T细胞时，需要注意细胞的温度、氧气浓度以及水分，以保证细胞的正常生长；2. 培养液的清洗和更换要及时，以保证细胞的正常生长；3. 在操作293T细胞时，一定要注意实验室的清洁卫生，以防止细胞的污染。
五、总结293T细胞培养是一种常用的培养方法，在培养293T细胞时，要注意培养液的温度、氧气浓度以及水分，并及时更换培养液，以保证细胞的正常生长。
在实验操作中，还要注意实验室的清洁卫生，以防止细胞的污染。
293、293T细胞培养及转染一点经验
qq ：439572370HEK-293是用DMEM 培养基培养吗？
HEK-293细胞是我在锐赛生物实验室做项目时常培养的细胞，DMEM+10%血清+双抗+谷氨酰胺，这类的细胞贴壁性不是太强，所以不要消化过久，容易损伤细胞。
状态较好的293细胞
细胞生长较快，一般1:3~1:5传代，30%~50%融合度2-3
天即可长满。
细胞状态不好后会变瘦、产生大量黑点（细胞碎片）。
网友咨询：我们这里的293转染质粒效率一直不高，
各种方法均试过了，很少能达到50%，老板说他在
国外做293转染很容易达到80%以上。
我想问一下哪里有好的293细胞卖？非常感谢。
答：293系列的细胞都是非常好转染的：注意点：
1.转染前细胞的铺板密度、细胞状态
2.转染的时间
3.转染试剂与质粒的比值
干扰载体转染293T 细胞48h 的图片，供参考。
293T 细胞生长速度更快，形态较293A 细胞小，贴壁性比293
细胞弱很多，消化时间更要注意，没培养过的刚接手细胞要在注意留种的同时多试验消化几次，掌握经验值。
293
细胞常用于腺病毒包装、293T
细胞常用于慢病毒包装。
293t
293T细胞的培养关键词：293T细胞慢病毒包装培养 2011-10-28 18:14 来源：丁香园点击次数：5037包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7. 将细胞离心，1000rpm，2min。
8.根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+ 20% FBS + 10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
9. 分装进细胞冻存管，放入泡沫盒中，放入-80℃超低温冰箱。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
11. 复苏检测细胞存活率，细胞状态等，并记录。
二. 293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
5. 放回37℃、3%CO和95%相对湿度的培养箱中培养。
2三. 293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
和95%相对湿度的培养箱中培养。
细胞转染效率低的原因及解决方案
细胞转染效率低的原因及解决方案
细胞转染是细胞生物学和分子生物学的一种常用的技术手段。
而转染效率低下却是实验人员经常遇到的问题，尤其是原代细胞转染，转染难度更大。
现分享几个细胞转染实验常见的几个陷阱，望实验人员能够注意。
1.准备不足
做细胞转染的时候，在开展正式实验前要多做预试验，优化转染条件。
优化转染条件包括：转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。
2.细胞污染
细胞污染也是造成细胞死亡，转染效率低下的一大原因。
首先，转染细胞用的质粒必须保证无菌。
而现在市场上的一般的质粒提取试剂盒都做不到绝对无菌。
分享一个小秘诀：将提完质粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，这样就除菌了。
3.质粒质量问题
转染用的质粒首先要保证数量，一般为2μg以上。
质粒纯度不够或者含有细菌LPS或其他对细胞有毒害作用的物质，也会影响转染效率。
这个时候，就应该对质粒进行纯化和浓缩。
4.细胞状态不好
细胞状态不好，会导致转染效率低下。
一般进行转染的细胞应该处于对数生长期。
如果是贴壁细胞的话，贴壁率应该在70-80%；如果是悬浮细胞的话，应该是6×105个/孔（24孔板），一般是转染前一天换液，转染前用无血清培养基或PBS洗细胞一次。
5.转染试剂问题
脂质体试剂毒性较大，易造成细胞死亡和转染效率底下。
可选择非脂质体转染试剂，如Entranster试剂。
电转染实验效率低的原因有哪些？
电转染实验效率低的原因有哪些？
电转染实验效率低，可能是以下几点原因：
1. 不合适的电场强度
合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。
不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。
2. 细胞选择错误
用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。
因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构致密比稳定期的细胞差，电转后，细胞膜的恢复能力强，而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA.
3. 质粒质量不佳
应选择纯度高的质粒，首先DNA／RNA应该超纯(A260／A280>1．8)，其次应不含内毒素，同时质粒应溶于双蒸水而不是TE 缓冲溶液。
另外，DNA浓度不宜过高。
4. 电转染试剂不合适
电击会对细胞造成一定程度的伤害，在转染试剂的选择上要注意，应选择具有细胞膜修复成分的电转染试剂，如Entranster-E，可将电击对细胞的损伤降到最低。
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293t细胞转染效率不高的原因
1.细胞状态问题：细胞的健康状态是影响转染效率的重要因素。
在转染前，293t细胞应处于对转染条件最为适合的生长状态。
不适当的细胞密度、细胞健康程度不佳或细胞老化等都会降低细胞的转染效率。
因此，在进行转染前应严格控制细胞的生长条件，例如，将293t细胞保持在对数生长期，确保细胞的健康状态。
2. 转染条件问题：转染时使用的转染试剂和转染方式会直接影响转染效率。
对于293t细胞，常见的转染试剂包括聚合物转染试剂（如聚乙烯醇，PEI）和脂质体转染试剂（如Lipofectamine系列）。
不同的转染试剂和转染方式具有不同的适用范围，需要根据具体的实验目的选择最合适的转染试剂和转染方式。
此外，转染试剂的浓度和转染时间也是影响转染效率的重要因素，需要进行优化。
3. 基因表达载体问题：转染效率也受到基因表达载体的选择和构建的影响。
“293t”代表的是人胚肾293细胞系，通常在293t细胞中进行的转染是为了进行基因表达。
选择合适的基因表达载体对于高效转染
293t细胞至关重要。
常见的基因表达载体包括携带启动子、报告基因和靶基因的质粒，例如pcDNA3.1、pCMV-Tag1A等。
此外，质粒的纯度和浓度也会影响转染效率，要保证质粒具有足够的纯度和浓度。
4.细胞特性问题：293t细胞在某些抗体和抑制剂的影响下可能会表现出较低的转染效率。
例如，有报道指出，加入一些非离子性均一剂（如聚乙二醇）能够导致293t细胞的转染效率显著下降。
因此，在进行转染实验时，应该了解并考虑特定细胞系的特性，并选择合适的实验条件。
综上所述，要提高293t细胞的转染效率，需要优化细胞状态、转染条件、基因表达载体选择和细胞特性等方面的因素。
通过综合考虑这些因素并进行合理的优化，可以显著提高293t细胞的转染效率。