质粒转染的注意事项
重组质粒的转化及阳性克隆的筛选
(二)阳性克隆的鉴定与筛选
将目的基因与载体进行连接形成重组子并转化后, 在连接产物中既有载体和目的基因的连接,也有载体 的自连和目的基因的自连,更多的是未发生连接反应 的载体和目的DNA片断.这就需要我们对阳性克隆进 行鉴定和筛选,将含有外源DNA的宿主细胞和不含外 源DNA的宿主细胞分开,将含有正确重组子的宿主细 胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开.
阳性克隆的筛选与鉴定可以从DNA, RNA和蛋白质三个不同的层次水平进行.可以 利用载体本身的一些特性,如抗生素抗性基因, 包装容量等对重组子筛选.可以直接分析重组 子中的质粒DNA,分析其插入片段的有无,大 小和酶切图谱,也可直接通过测序分析重组子 中的插入片断.有时可以通过间接分析和目的 基因相连的基因或蛋白的表达来检测目的基因 的表达,比如将目的基因和报告基因同时整合 到宿主中,如果报告基因表达,则说明目的基 因也可能正确表达.
四,操作步骤
(一)重组质粒的转化 1,从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其 解冻,解冻后立即置冰上. 2, 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超 过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后. 3,42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速 置于冰上冷却3-5分钟. 4,向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后 37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质 粒编码的抗生素抗性基因(Ampr ). 5,将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平 板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后 倒置培养皿,37℃培养16-24小时.
五,注意事项
1,麦康凯选择性琼脂组成的平板,在含有适当抗生素 时,携有载体DNA的转化子为淡红色菌落,而携有带 插入片段的重组质粒转化子为白色菌落.该产品筛选 效果同蓝白斑筛选,且价格低廉.但需及时挑取白色 菌落,当培养时间延长,白色菌落会逐渐变成微红色, 影响挑选. 2,X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖以半乳糖苷酶 水解后生成的吲哚衍生物显蓝色.IPTG是异丙基硫代 半乳糖苷为非生理性的诱导物,它可以诱导lacZ的表 达. 3,在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上,携带载体 DNA的转化子为蓝色菌落,而携带插入片段的重组质 粒转化子为白色菌落,平板如在37℃培养后放于冰箱 3-4小时可使显色反应充分,蓝色菌落明显.
转染详细步骤大攻略
转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。
将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。
具体操作步骤如下：1）质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下：(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
（注：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低）(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
（注：混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏）(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。
（注：溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清）(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min 至溶液变清亮。
(6)37℃水浴5 min，不时振荡，溶液又变浑浊。
12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。
(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。
质粒转化、细胞转染步骤
转化：将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性。
转染（transfection）:将含有目的gene的载体转到真核cell内
转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程。
有时也指在真核cell之间通过逆转录病毒转移和获得cellDNA的过程。
1.质粒转染（transfection）
6-well-plate 每well 60-70%时transfection
接种时×105个/ml/well
质粒DNA 转染液优化培养基opti-MEM
步骤：质粒DNA + 200ul opti-MEM + 6ul转染液混匀室温静置15min 待转染cell换优化培养基，切记要轻轻加培养基，勿冲起cell 把transfection complex(200ul)轻轻均匀滴入cell培养基中，十字形摇晃plate,混匀
37℃，CO2培养箱培养
2.
转化：外源DNA(质粒作为载体)导入受体细胞（大肠杆菌感受态cell）步骤：
50ul感受态cell（一管）加入12ul质粒DNA→轻柔混合
↓
冰浴30min
↓
42℃热激90s
↓
迅速冰浴2min
↓
向管中加入培养基，混匀后37℃震荡培养（﹤225rpm）1h,使细菌恢复正常生长状态
↓
涂板正培1h后，倒培过夜。
瞬时转染实验步骤
瞬时转染实验步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：瞬时转染实验是一种常用的基因转染技术，可用于将外源DNA或RNA导入到目标细胞中，以研究基因表达和功能。
本文将介绍瞬时转染实验的步骤及注意事项。
一、实验前准备1.1 制备转染试剂：根据所需的转染试剂种类，准备相应的试剂。
常用的转染试剂包括有机溶剂转染试剂（如Lipofectamine 2000）、阳离子聚合物转染试剂（如Polyethylenimine，简称PEI）等。
1.2 制备转染质粒：准备含有目标基因的转染质粒。
转染质粒应进行质粒提取、纯化并测序确认。
1.3 培养细胞：细胞应在培养皿中充分培养至70%～90%的浓度，以保证转染效率。
1.4 预热培养基：将足够的培养基提前预热至37℃，以用于细胞培养和转染。
二、转染操作步骤2.1 向细胞培养皿中加入转染试剂：按照转染试剂的使用说明书，向培养皿中加入适量的转染试剂，并在无血清培养基中混合均匀。
2.2 加入转染质粒：将准备好的转染质粒溶液滴加入培养皿中，注意避免空气泡。
2.3 孵育细胞：将培养皿放置在37℃的培养箱中孵育一定时间，通常为4～6小时。
2.4 更换培养基：在转染后适当时间内更换含有血清的培养基，以保证细胞正常生长。
2.5 收获样品：根据实验设计和研究目的，选择合适的时间点收获转染后的细胞样品。
三、注意事项3.1 转染试剂浓度：转染试剂的浓度应根据实验目的和细胞类型进行优化，以达到最佳的转染效果。
3.2 转染时间和转染效率：转染时间过长或过短都可能影响转染效果，应根据实际情况进行调整。
3.3 质粒浓度和纯度：转染质粒应具有足够的纯度和浓度，以确保转染效果。
3.4 细胞密度和状态：细胞应在良好的状态下进行转染，过高或过低的细胞密度都会影响转染效果。
3.5 实验控制组：应设置适当的对照组，以进行比较和验证实验结果的可靠性。
总结：瞬时转染实验是一种常用的基因转染技术，通过适当的实验操作步骤和注意事项，可获得可靠的实验结果。
质粒转染技术
质粒转染技术质粒转染技术是现代生命科学研究中常用的实验手段之一，广泛应用于基因工程、细胞生物学、分子生物学等领域。
本文将从质粒转染技术的原理、方法和应用等方面进行介绍。
一、质粒转染技术的原理质粒转染技术是指将外源质粒DNA导入到细胞内的一种方法。
质粒是一种环状DNA分子，具有自主复制和表达基因的能力。
质粒转染技术通过将质粒DNA导入到细胞内，使其在细胞内复制和表达，从而实现对目标基因的研究和应用。
1. 化学法转染：化学法转染是最常用的质粒转染方法之一。
其基本原理是利用化学物质（如聚合物、脂质体等）与质粒DNA结合，形成复合物后与细胞膜发生相互作用，使质粒DNA进入细胞内。
这种方法操作简单、成本低廉，适用于大多数细胞类型。
2. 电穿孔法转染：电穿孔法利用高压电脉冲的作用，瞬时破坏细胞膜，使质粒DNA能够进入细胞内。
这种方法适用于多种细胞类型，转染效率较高，但操作较为复杂。
3. 粒子轰击法转染：粒子轰击法利用高速粒子（如金属微粒）的撞击作用，将质粒DNA导入细胞内。
这种方法适用于质粒DNA较大、难以通过其他转染方法的细胞。
三、质粒转染技术的应用1. 基因表达研究：质粒转染技术可用于将外源基因导入细胞，使其在细胞内表达，从而研究基因的结构、功能和调控机制。
2. 基因敲除研究：质粒转染技术结合CRISPR/Cas9等基因编辑技术，可以实现对特定基因的敲除，从而研究该基因的功能。
3. 基因治疗：质粒转染技术可用于将治疗基因导入患者的细胞，修复或替代异常基因，实现基因治疗的目的。
4. 细胞药物递送：质粒转染技术可用于将药物敏感基因导入细胞，使其在细胞内表达，从而增强对药物的敏感性，提高治疗效果。
四、质粒转染技术的进展与挑战随着生命科学研究的不断发展，质粒转染技术也在不断改进和完善。
目前，研究人员正在努力提高转染效率、降低细胞毒性和改善转染的特异性等方面。
同时，也面临着一些挑战，如如何选择合适的转染方法、如何提高质粒的稳定性等问题。
细胞的脂质体转染法和电穿孔法
细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法（一）脂质体转染一、实验试剂及器材Lipofectamine® 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 μg/μL储液)，Opti-MEM®减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。
二、实验步骤1. 接种细胞至70－90%汇合度时转染；2. 使用Opti-MEM®减血清培养基稀释Lipofectamine® 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM®培养基为125 μL× 2，Lipofectamine® 3000为3.75和7.5 μL）；3. 在每管已稀释的Lipofectamine® 3000试剂中加入稀释的DNA（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）；4. 室温孵育5分钟；5. 加入DNA－脂质体复合物至细胞中；6. 37°C(PK-15在39°C下培养)孵育细胞2–4天，然后分析转染细胞。
三、注意事项1. 在无血清培养基（如Opti-MEM®减血清培养基）中制备DNA－Lipofectamine® 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清／抗生素存在或不存在时均可）；2. 转染后无需去除转染复合物或者更换／添加培养基；3. Lipofectamine® 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine® 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染；4. Lipofectamine® 3000试剂应放在4℃储存（切勿冷冻）。
附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：（二）电穿孔转染法一、实验试剂及器材BTX ECM2001®2001细胞电融合仪，细胞，胰蛋白酶，电转液，DMEM，培养板，离心机等。
CHO-S细胞蛋白表达操作规程
CHO-S细胞转染操作规程ExpiCHO™ Expression Medium不会抑制转染，因此转染时无需更换培养基。
一、实验材料：1、ExpiCHO-S™ cells cultured in ExpiCHO™ Expression Medium。
2、无菌、无苯酚、无氯化钠，主要是超螺旋结构的含目的基因的质粒。
N0te：推荐使用《PureLink™ HiPure Plasmid Ki t 》试剂盒抽提质粒。
为了保证无菌，可以使用0.22um的过滤器过滤质粒。
3、抗体表达阳性对照质粒（100 µL of the 1 mg/mL，由试剂盒提供）4、ExpiFectamine™ CHO Reagent（4℃冷藏使用，使用前无需预热）5、OptiPRO™ SFM complexation medium（4℃冷藏使用，使用前无需预热）6、ExpiCHO™ Expression Medium（使用前预热至37℃）Note:转染过程中不能添加抗生素，否则会影响转染效率。
7、Polycarbonate, disposable, sterile Erlenmeyer flasks。
8、37℃，8%CO2，可空气加湿的摇床。
9、测定活细胞密度和百分比的试剂和仪器。
（牛鲍计数板、台盼蓝染液）二、转染注意事项：1、新复苏的细胞在转染之前至少要传2代以上。
2、所有针对细胞的操作要严格无菌、动作轻柔，避免剧烈的震荡或移液，细胞的健康状态对最大程度的提高转染效率至关重要。
3、如果不使用ExpiFectamine™ CHO Reagent转染高密度的ExpiCHO-S™ 细胞，转染效率将会大幅度降低。
4、ExpiFectamine™ CHO Reagent使用之前柔和颠倒4-5次，确保试剂充分混匀。
5、质粒DNA与ExpiFectamine™ CHO Reagent的混合可在室温下进行，使用4℃冷藏试剂。
6、一旦ExpiFectamine™ CHO/DNA复合物形成，应立刻将该复合物加到细胞悬液中，5分钟之内不影响转染效率，但不能超过10分钟。
质粒DNA细胞转染(Entranster)应注意的事项
1，质粒的构建：启动子的选择
启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的。
对于转染过程本身虽然无甚影响，但是对转染结果却有着微妙的影响。
2，质粒的大小和质量
线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。
而线性化DNA转染的整合几率高。
质粒太大了转染会困难一些。
毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。
如果你的质粒正好比较大，又没有经验，选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几率会高一些。
有的转染试剂还会提供一些促进DNA凝聚的成分，使得DNA形成转染复合物时更致密一些，更容易转染一些。
纯化质粒的质量也会影响转染效率，一定要选择高质量的质粒。
3，质粒DNA的浓度和量
既然质粒纯化已经不成问题，初学者通常都不会在乎甚至愿意多加点DNA，但是要注意的是，DNA量过少固然转染效率不高，DNA量过多同样会降低转染效率。
所以预实验需要按照说明书的要求，按一定比例混合适量的质粒DNA和转染试剂。
有的转染试剂要求DNA的量多些，有的转染试剂效率高只要很少DNA。
4，转染试剂的选择
在确定了质粒的质量之后，就要考虑转染试剂的选择了。
目前大多数用的是脂质体类的转染试剂，但这类试剂的毒性较大，转染效率低，最好选择非脂质体的转染试剂，如Entranster试剂。
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质粒转染的注意事项
1. 质粒的纯度：质粒转染的前提是质粒需要高纯度，否则可能会产生不必要的背景信号，影响实验结果。
2. 质粒的浓度：质粒浓度的选取直接影响到转染效率，通常建议使用1-2μg/mL 的质粒。
3. 细胞密度：转染前需注意细胞密度的选取，通常细胞密度不宜过于密集，否则会影响转染效果。
4. 转染剂：选择适当的转染剂可以提高转染效率，目前常用的转染剂有Lipofectamine、JetPrime、PEI等。
5. 转染时间：不同种类的细胞对转染时间有不同的要求，一般来说转染时间不宜过长或过短。
6. 转染后细胞处理：转染后需要对细胞进行适当的处理，如改变培养基、加入药物等，以促进目的基因的表达或抑制。