免疫学实验10 小鼠巨噬细胞功能测定
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验
3．6％可溶性淀粉肉汤：肉汤培养液100 m1，加入可溶性淀粉
6g，混匀后煮沸灭菌 4．小鼠解剖器械、显微镜、离心机、温箱等 5．试管、吸管、微量加样器、计数板
方法
(1)、小鼠巨噬细胞制备
实验前三天每只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1 ml。实验时眼
球放血、断椎处死小鼠，新洁尔灭浸泡5分钟。 剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口(注意 避开血管)，用1640灌注腹腔，收集腹腔液于试管中(约4 ml)， 1500 r/min，离心10 min，去上清，沉积细胞用1640洗一次。最
后沉积细胞用含10％小牛血清1640配成适当浓度备用 (1-2×106
／ml)。
（2）白色念珠菌制备
将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中，
培养48小时，收集菌，用适量生理盐水配成悬液，100℃，煮
沸30 min灭活，离心去掉上清，再用1％美兰染色30 min，用
生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃ 胞 0.5 ml 加 白 色 念 珠 菌 悬 液 0.5ml ， 置 37℃ 温 育
30min。
取1滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察计数。
高倍镜下观察计算：
吞噬率％=(吞噬白色念珠菌的巨噬细胞数/100个巨噬细胞)×100％
吞噬指数％=100个巨噬细胞中吞噬白色念珠菌总数 /100个巨噬细胞 **(吞噬指数式中巨噬细胞为阳性吞噬细胞)
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验
武汉大学基础医学院 免疫学教研室
吞噬细胞是机体天然抵抗力
的一个重要组成部分，也是特
异性免疫不可缺少的一部分。 因此，测定机体吞噬细胞的功 能，对了解机体免疫功能具有 相当重要的意义。
细胞吞噬作用原来是单细胞动物摄取营养物质的方式，也是
免疫学实验10 小鼠巨噬细胞功能测定
实验10 小鼠巨噬细胞功能测定
1.实验目的
了解小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的原理； 熟悉和掌握巨噬细胞吞噬试验的方法。
2.实验原理ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
巨噬细胞具有吞噬、分泌和参与免疫应答的各种 功能，是机体免疫水平和功能的重要指标，与抗肿瘤免 疫也有重要关系。本试验将鸡红细胞注入小鼠腹腔时， 会被腹腔中的巨噬细胞吞噬。取小鼠腹腔液涂片、染色 ，在显微镜下观察可见鸡红细胞被吞噬的现象。计算吞 噬百分率和吞噬指数，可判断巨噬细胞的吞噬功能，据 此可判断机体的非特异性免疫水平。
3.实验器材
（1） 器具：注射器、离心管、载玻片、平皿、烧 杯、橡皮乳头、解剖剪和镊子、解剖盘。 （2） 材料：Hank’s液、6%淀粉肉汤液、瑞氏染 色液、 1%鸡红细胞悬液、 小鼠。
4.实验方法（小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能体内测定法）
（1）实验前3d，给小鼠腹腔内注射无菌6%淀粉肉汤液1ml。 （2）实验当天，给小鼠腹腔注射1％的鸡红细胞悬液1ml ，轻 揉腹部使鸡细胞分散，令其活动20~30min。 （3）然后颈椎脱臼处死小鼠，仰卧固定。常规消毒腹部皮肤， 左手持镊提起腹中部皮肤。右手用剪子剪长5mm的小口， 从剪口处朝头、尾部用力，撕开皮肤，暴露腹壁。
未被吞噬的鸡红细胞
吞噬了鸡红细胞 的巨噬细胞
5.注意事项
（1）涂片的薄厚要适当，否则影响计数。 （2）小鼠腹腔注射时不要刺伤内脏。 （3）如小鼠腹腔液过少，可腹腔注入适量Hank’s液揉动 后再取。 （4）剪开小鼠腹腔时应避免出血，否则将影响试验结果。 （5）被吞噬的鸡红细胞时间过长可被消化，时间过短未 被吞噬，必须掌握好吞噬作用时间。
实验1.吞噬细胞功能的测定
实验一、巨噬细胞吞噬功能的观察
[原理]
吞噬细胞属于机体的固有免疫系统，对异物有识别和清除的能力。
巨噬细胞是吞噬细胞之一，主要分布于机体的淋巴结、脾脏、结缔组织等处。
[材料]
1．小鼠、1%绵羊红细胞、瑞氏染液等。
2．注射器、吸管、手术器械、显微镜等。
[方法]
1．实验前3天，小鼠腹腔注射硫乙醇酸钠培养基，诱导腹腔巨噬细胞。
2．将上述小鼠腹腔注射1%绵羊红细胞2ml/只，等待30-60min。
3．小鼠断颈椎处死，轻揉腹部约1min，吸取腹腔液做推片。
4．标本片充分干燥后，瑞氏染液染色10min，冲洗，吸干水后镜检。
5．镜下观察巨噬细胞的吞噬现象，计算吞噬百分数和吞噬指数。
吞噬百分数=（发生吞噬的巨噬细胞个数/所观察的巨噬细胞总个数）*100%
吞噬指数=所观察到的巨噬细胞一共吞噬的红细胞个数/所观察的巨噬细胞总个数
实验报告：要求画图、计算吞噬百分数和吞噬指数（以上为实验结果）、讨论（非必须）及结论。
强烈建议实验报告使用A4大小的纸张。
实验报告不返还，若要留底请自行备份。
巨噬细胞吞噬作用的观察实验报告
巨噬细胞吞噬作用的观察实验报告一.实验目的1.通过小鼠腹腔巨噬细胞对异物吞噬作用的观察，了解巨噬细胞在非特异性免疫中的功能。
2.掌握小鼠等实验动物腹腔巨噬细胞采集和制片的方法。
3.学习小鼠腹腔注射的操作方法和步骤。
二.实验原理1.向小鼠腹腔内注射无菌淀粉肉汤，排异反应使小鼠产生大量巨噬细胞，且巨噬细胞吞噬淀粉肉汤后不会对细胞造成伤害，反而被“喂养”。
连续多天注射使小鼠腹腔内聚集大量巨噬细胞。
2.台盼蓝是一种生物染料，专一染色死细胞。
活细胞的细胞质膜对台盼蓝有不透过性。
巨噬细胞吞噬含有台盼蓝的淀粉肉汤后，可以消化其中的淀粉和蛋白质，但是不能消化其中的台盼蓝，因此台盼蓝会聚集在溶酶体中。
是一种溶酶体染色的方法。
3.当向小鼠腹腔中注射鸡红细胞时，鸡红细胞作为外源物质，会被小鼠细胞识别并吞噬，在适当的的时机，我们就有可以在显微镜下观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的过程三.实验材料及设备1.实验材料：a）连续2~3天向腹腔中注射含台盼蓝的淀粉肉汤的小鼠一只b）鸡红细胞悬液c）生理盐水2.实验设备：a）普通光学显微镜b）载玻片、盖玻片若干c）注射器d）染色皿若干、吸水纸、滴管、剪刀、白瓷板等四.实验方法及步骤1.小鼠处理与巨噬细胞采集a）连续2-3天（每天一次）向小鼠腹腔中注射含台盼蓝的淀粉肉汤。
b）选择已注射淀粉肉汤3小时以上的小鼠一只。
c）一人控制住小鼠，露出腹部，另一人用注射器向小鼠腹腔中注射1ml鸡红细胞悬液。
按摩小鼠腹部。
d）20-30分钟后，再注射1-1. 5ml生理盐水（0. 9%NaCl）按摩小鼠腹部。
e）3分钟后，引颈法处死小鼠f）迅速在腹腔剪开一个不大的开口（注意要剪开腹部的肌肉层），用无针头的注射器吸取腹腔液。
g）在载玻片上滴2-3滴腹腔液，加上盖玻片，在显微镜下观察。
2.观察在不同倍数下观察样本，找到正在消化或者吞噬鸡红细胞的巨噬细胞。
注意避免玻片液体干涸。
五.实验结果巨噬细胞图2小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞装片（100X物镜不染色）左上角示未知种类细胞100x物镜放大倍数，光镜下可见随机分布的不同种类的细胞。
巨噬细胞功能检测讲解学习
巨噬细胞功能检测单核－巨噬细胞吞噬功能测定单核－巨噬细胞在机体免疫反应中起着重要作用，因此，检测单核－巨噬细胞功能对于了解机体的免疫功能状态具有重要意义。
小鼠巨噬细胞吞噬功能试验（体外法）1、原理巨噬细胞具有吞噬异物的功能，将巨噬细胞与被吞噬物(鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共同温育，染色，在油镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，以此判断巨噬细胞的吞噬功能，从而评价机体的免疫状态。
2、方法(1)．小鼠巨噬细胞制备实验前三天每只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1 ml。
实验时眼球放血、断椎处死小鼠，碘酒、洒精消毒皮肤，剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口(注意避开血管)用生理盐水(或1640)灌注腹腔，收集腹腔液于试管中(约4 ml)，1500 r/min，离心10 min，去上清，沉积细胞用生理盐水(或1640)洗二次，离心转速、时间同上。
最后沉积细胞用含10％小牛血清1640配成适当浓度备用(1~2×106／ml)。
(2)被吞噬物的制备1）．鸡红细胞制备从鸡翼下抽取静脉血，加入5倍量Alsever液(2.05 g葡萄糖，0.42 g NaCl，0.8 g枸橼酸钠5H2O、0.55 g枸椽酸，加双蒸水到100 ml，加热溶解后过滤分装，8磅高压灭菌，4℃保存)，置4℃可以保存1个月。
用前取适量鸡红细胞悬液，用PBS洗涤二次后配成1％的浓度备用。
2）．白色念珠菌制备将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理盐水配成悬液，100℃，煮沸30 min灭活，离心去掉上清，再用1％美兰染色30 min，用生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃冰箱保存备用。
3、操作取巨噬细胞0.5 ml加1％鸡红细胞或l×l08／ml白色念珠菌悬液0.5ml，置37℃温育30min。
取2滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察计数，或离心1000r／min,10min，取细胞沉淀混悬液制成涂片，甲醇固定，姬姆萨染色、油镜观察计数。
小鼠三个不同部位巨噬细胞的分离培养与鉴定
小鼠三个不同部位巨噬细胞的分离培养与鉴定[摘要] 目的建立小鼠三种不同部位巨噬细胞体外分离培养的方法，并对其进行鉴定。
方法分别从小鼠腹腔、脾脏、骨髓中分离获取巨噬细胞，经台盼蓝染色计数后于含10%胎牛血清的DMEM培养液、1%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养；通过活细胞形态观察；HE 染色光镜观察；吞噬鸡红细胞功能检测；酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。
结果获得高纯度的巨噬细胞，具有巨噬细胞的形态特征，具备良好的吞噬功能，鸡红细胞吞噬率分别为腹腔94.68%，脾脏92.47%，骨髓93.11%；酸性磷酸酶染色阳性率为腹腔89.43%，脾脏85.21%，骨髓88.55%；α-醋酸奈酚酯酶染色阳性率为腹腔85.32%，脾脏81.81%，骨髓85.76%。
结论小鼠三个不同部位均可简便实用的分离出巨噬细胞，可以满足不同的研究目的。
巨噬细胞不仅是许多病原体的宿主细胞,而且在先天性和后天性免疫应答过程中起着关键性作用[1-3],比如调节促炎和抗炎细胞因子的释放、吞噬或杀死胞内微生物和肿瘤细胞、降解和提呈抗原等。
它还可以与其他免疫细胞协同发挥更大的功能，比如树突状细胞、粒细胞、NK细胞和T细胞等。
小鼠巨噬细胞吞噬作用是反映机体非特异性免疫功能的主要指标，也是临床免疫学实验常用的方法之一。
现将已有的巨噬细胞分离方法改进，从3种不同部位分离小鼠巨噬细胞，并做以对比。
1 材料与方法1.1主要试剂和仪器DMEM培养基（Hyclone）；RPMI-1640培养基（GIBCO）；胎牛血清（GIBCO）；倒置显微镜（Olympus）；CO2培养箱（Binder，Thermo）。
1.2 从小鼠腹腔中分离巨噬细胞（1）取6~8周龄左右的小鼠，腹腔注射2mL无菌的液体石蜡。
待3~4d后收集腹腔细胞。
（2）颈椎脱臼法法处死小鼠，消毒，用注射器抽取5mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1~2 min，静置5min，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中。
免疫学实验报告
免疫学实验报告免疫学实验报告免疫学是研究机体免疫系统的科学，通过实验研究，我们可以更好地了解免疫系统的功能和作用。
本次实验旨在探究免疫系统对外部病原体的应对机制以及免疫细胞的活性。
实验一：外源性抗原刺激下的免疫反应首先，我们选择了小鼠作为实验对象。
将小鼠分为两组，一组注射了抗原A，另一组注射了生理盐水作为对照组。
注射后，我们观察到注射抗原A的小鼠出现了明显的免疫反应，如红肿、瘙痒等症状，而对照组的小鼠则没有出现这些症状。
为了进一步研究免疫反应的机制，我们对两组小鼠进行了淋巴细胞计数。
结果显示，注射抗原A的小鼠的淋巴细胞数量明显增加，而对照组的小鼠则没有明显变化。
这表明，外源性抗原的刺激可以引发免疫系统的活化，进而增加淋巴细胞的数量。
实验二：免疫细胞的活性研究为了进一步了解免疫系统的活性，我们进行了一系列的实验。
首先，我们选择了巨噬细胞作为研究对象。
通过给巨噬细胞添加外源性抗原，我们观察到巨噬细胞的吞噬能力明显增强。
这表明，免疫系统可以通过巨噬细胞来清除体内的病原体。
接着，我们研究了T细胞的活性。
通过给T细胞添加外源性抗原，我们发现T 细胞的增殖能力明显增强。
这说明，T细胞在免疫反应中起到了重要的作用，能够识别并攻击体内的病原体。
实验三：免疫系统的记忆性为了研究免疫系统的记忆性，我们进行了一项长期实验。
首先，我们注射了抗原A给小鼠，观察到小鼠出现了免疫反应。
然后，经过一段时间的休息，我们再次注射了抗原A给同一批小鼠。
令人惊讶的是，这次注射后，小鼠的免疫反应明显减弱，甚至没有出现明显症状。
这表明，免疫系统具有记忆性，能够对之前接触过的抗原做出更快、更有效的应对。
结论通过本次实验，我们深入了解了免疫系统的功能和作用。
免疫系统对外部病原体的应对机制是多样的，包括免疫反应、巨噬细胞的吞噬能力以及T细胞的攻击能力。
同时，免疫系统还具有记忆性，能够对之前接触过的抗原做出更快、更有效的应对。
这些研究结果对于深入理解免疫系统的功能和作用具有重要意义。
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验
首先用吸管吸取少许稀释后的单细胞悬液，从盖片 端滴一小滴（不宜过多），液体自行向内渗入，静置数 分钟后，再放在微镜下观察计数。
温育30min。
取1滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察 计数。
高倍镜下观察计算： 吞噬率％=(吞噬白色念珠菌的巨噬细胞数/100个巨噬
细胞)×100％
吞噬指数％=100个巨噬细胞中吞噬白色念珠菌总数 /100个巨噬细胞
**(吞噬指数式中巨噬细胞为阳性吞噬细胞)
注意事项
1、菌与细胞混合后充分混匀非常重要。对于此实验，菌 与吞噬细胞之比10：1时吞噬作用容易观察和计数。但 是吞噬效果好，能真正反映实际情况又可被检测的比 例为1：1。
计数时，若细胞位于小方格的线上，应遵循“数上 线不数下线，数左线不数右线”的原则，以减少误差。 计数应重复3次，取其平均值。
数完毕后，依下式计算： 每1mL白细胞悬液细胞数＝（4个中方格细胞总数 /4） ×104× 稀释倍数
每1mL红细胞悬液细胞数＝（80个小方格细胞总数 /80） ×400×104× 稀释倍数
2、菌和细胞在摇床中作用的时间不超过30 min，如果在 37C 条件下作用时间过长，被吞噬的菌很快会被裂解， 也就不能计数为吞噬了菌的细胞。
3、滴片时加入的细胞数依细胞的大小而定，如果使用的 吞噬细胞是细胞系，细胞体积较大，那么加入的细胞 数就相应的少一点。
血球计数板计数法
血球计数板是由一块厚玻片特制而成，其中央有 两个计数室。每个计数室划分出9个大方格（见下图）， 每格面积1mm2，加盖玻片后的深度为0.1mm。因此， 每大方格容积为0.1mm3。
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1.实试验的方法。
2.实验原理
巨噬细胞具有吞噬、分泌和参与免疫应答的各种 功能，是机体免疫水平和功能的重要指标，与抗肿瘤免 疫也有重要关系。本试验将鸡红细胞注入小鼠腹腔时， 会被腹腔中的巨噬细胞吞噬。取小鼠腹腔液涂片、染色 ，在显微镜下观察可见鸡红细胞被吞噬的现象。计算吞 噬百分率和吞噬指数，可判断巨噬细胞的吞噬功能，据 此可判断机体的非特异性免疫水平。
未被吞噬的鸡红细胞
吞噬了鸡红细胞 的巨噬细胞
5.注意事项
（1）涂片的薄厚要适当，否则影响计数。 （2）小鼠腹腔注射时不要刺伤内脏。 （3）如小鼠腹腔液过少，可腹腔注入适量Hank’s液揉动 后再取。 （4）剪开小鼠腹腔时应避免出血，否则将影响试验结果。 （5）被吞噬的鸡红细胞时间过长可被消化，时间过短未 被吞噬，必须掌握好吞噬作用时间。
（5）提起腹前壁，避开血管剪一小口，用毛细吸管吹吸 混匀腹腔内液体，并收集于试管内。 （6）在干净的载玻片上滴加一滴腹腔液制作涂片 。待涂 片晾干后，瑞氏染液染色5min。 （7）结果判断：高倍镜/油镜下镜检。镜下可见巨噬细胞 核呈蓝色，被吞噬的鸡红细胞呈椭圆形，其胞浆呈红色而核 被染成蓝色。计数巨噬细胞吞噬鸡红细胞情况，计算吞噬百 分率和吞噬指数。 ①吞噬百分率：即100个巨噬细胞中吞噬有鸡红细胞的 巨噬细胞数。 ②吞噬指数：将100个巨噬细胞中所吞噬的鸡红细胞 总数除以100即得吞噬指数，即平均每个巨噬细胞吞噬的鸡 红细胞数。
3.实验器材
（1） 器具：注射器、离心管、载玻片、平皿、烧 杯、橡皮乳头、解剖剪和镊子、解剖盘。 （2） 材料：Hank’s液、6%淀粉肉汤液、瑞氏染 色液、 1%鸡红细胞悬液、 小鼠。
4.实验方法（小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能体内测定法）
（1）实验前3d，给小鼠腹腔内注射无菌6%淀粉肉汤液1ml。 （2）实验当天，给小鼠腹腔注射1％的鸡红细胞悬液1ml ，轻 揉腹部使鸡细胞分散，令其活动20~30min。 （3）然后颈椎脱臼处死小鼠，仰卧固定。常规消毒腹部皮肤， 左手持镊提起腹中部皮肤。右手用剪子剪长5mm的小口， 从剪口处朝头、尾部用力，撕开皮肤，暴露腹壁。