实时定量PCR简介
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用一、本文概述实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的分子生物学技术，它能够在PCR 扩增过程中实时监测反应产物的积累，从而精确地定量目标DNA或RNA的初始浓度。
自20世纪90年代诞生以来，qPCR技术以其高灵敏度、高特异性、快速性和定量准确等优点，在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等多个领域发挥了重要作用。
随着技术的不断发展和完善，实时荧光定量PCR已成为现代生物学研究中不可或缺的工具。
本文旨在全面综述实时荧光定量PCR技术的最新研究进展，包括其原理、方法、技术优化、应用领域的拓展以及面临的挑战等。
文章首先简要介绍qPCR技术的基本原理和常用方法，然后重点论述近年来在技术优化、多重PCR、数字化PCR等方向上的进展。
接着，本文详细探讨实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等领域的应用案例和前景。
文章还将讨论实时荧光定量PCR面临的挑战，如引物设计、数据分析等问题，并提出相应的解决方案。
通过本文的综述，读者可以对实时荧光定量PCR技术的最新进展和应用有一个全面的了解，为相关研究提供参考和借鉴。
二、实时荧光定量PCR的基本原理与技术特点实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在PCR扩增过程中，通过对荧光信号的实时检测，对特定DNA片段进行定量分析的技术。
其基本原理是利用荧光染料或荧光标记的特异性探针，在PCR反应过程中实时检测PCR产物量的变化，从而得到DNA模板的初始浓度。
实时性：通过荧光信号的实时检测，可以实时了解PCR产物的生成情况，无需PCR结束后进行电泳等后续操作，大大缩短了实验时间。
定量性：通过标准曲线的建立，可以准确地计算出DNA模板的初始浓度，实现了PCR的定量分析。
实时荧光定量PCR简介
实时荧光定量PCR简介荧光定量PCR检测技术从诞生到现在已经有8 年了，但是其应用在近四年才迅猛增长。
在Medline 数据庫中，用“ Taqman” 或”real time PCR” 作为关键词检索，在1996 年仅有19 篇，在1997 年仅有28 篇，在98 、99 、2000 年分别达到了52 、157 、409 篇，2003 年已经达到2984 篇，相信在不久的将来会有更多的文章发表。
针对实时PCR 这一热点领域，闪晶公司对它进行了深入细致的研究，并且及时地为广大科研人员推出这项技术服务。
荧光定量PCR基本原理•Taqman 技术：该技术以美国ABI 公司为代表。
PCR 扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。
该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号；PCR 扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的5' －3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。
•Beacon 技术：该技术以美国人Tagyi 为代表。
也是加入了荧光探针，但它是环状的寡核苷酸探针，分别由茎部和环部组成，两端分别标记荧光报告基团和荧光猝灭基团，在无靶序列的情况下，探针始终是环状，报告基团的荧光被猝灭基团猝灭，使荧光检测仪检测不到荧光信号；而在有靶序列时，即在PCR 的退火阶段探针与靶序列结合，使荧光报告基团和猝灭基团分开，这样荧光仪可以检测到荧光，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。
•FRET 技术：该技术以Roche( 罗氏公司) 为代表。
它的基本原理是：两条直线型寡核苷酸探针，其中一条的3 …端标记荧光激发基团，另一条的 5 ' 端标记荧光检测基团，在无靶序列的情况下，两条探针分开，无法进行能量的传递，这样荧光仪不能检测到荧光信号；而当有靶序列时，即在PCR 的退火阶段两条探针与靶序列结合，使得两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递，这样荧光仪就可以检测到荧光信号，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。
实时定量PCR技术(real-time PCR)
样品重复
重复次数请遵循统计学的要求 小样本统计，n>6（n>3） 未知样品和标准品都要重复 所有复管在同样条件下完成PCR
2.2 技术方法及数据
绝对定量与相对定量
绝对定量：绝对标准曲线法
标准品拷贝数的计算 待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释 倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓 度/样本分子量×6×1014
扩增效率 扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为： 扩增效率（E）＝10-1/斜率。理论上，在每个指 数扩增循环中，PCR产物的量加倍，即PCR产 物2倍增加，反应效率为2，扩增效率就为2， 就可得2＝10-1/斜率，标准曲线得斜率就为-3.32， 斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。 如果将扩增效率用百分率来表示，即： E%=(E-1)×100%，对于理想的PCR反应， E=2，即：扩增效率E%=(2-1)×100%=100% 如果E＝1.92，带入方程(1.92-1)×100%=92%， 表示每个循环的终点，扩增产物的拷贝数增加 1.92倍，或每次循环有92％的模板被扩增。
TaqMan探针
TaqMan定量原理
荧光共振能量转移(FRET)
当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸 收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可 以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长 （低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振 能量转移(FRET),实际相当于短波长荧光基团释放 的荧光被屏蔽。
PCR效率对定量结果的影响
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光定量pcr名词解释
实时荧光定量pcr名词解释
实时荧光定量 PCR 是一种用于检测和分析 DNA 或 RNA 的方法，通过在 PCR 反应体系中添加荧光基团，实时检测 PCR 扩增产物对应的荧光信号，从而对起始模板进行定量和定性分析。
荧光基团包括荧光染料和荧光探针两种形式。
荧光染料如 SYBRGreen 是一种结合于
双链 DNA 的双螺旋小沟区域的绿色荧光染料，在游离状态下发出微
弱的荧光，一旦与双链 DNA 结合后，荧光大大增强，可以根据荧光
信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。
而 TaqMan 荧光探针则是在 PCR 扩增时添加的一条特异性的荧光探针，其中 5"端标记一个报告荧光基团，3"端标记一个淬灭荧光基团。
在 PCR 扩增时，Taq 酶的 5"-3"外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。
实时荧光定量 PCR 具有灵敏度高、操作简单、实时监测等优点，广泛应用于基因表达分析、基因突变检测、病毒检测等领域。
实时定量荧光pcr原理
实时定量荧光pcr原理
实时定量荧光PCR（quantitative Real-Time PCR）是一种基于PCR技术的高效、准确且可靠的DNA分析方法。
其主要原理
是通过在PCR反应过程中实时监测DNA扩增产物的累积量，从而定量测定起始DNA模板的数量。
实时定量荧光PCR的核心是使用荧光探针的方法来定量检测PCR反应过程中的DNA扩增产物。
在PCR反应中，荧光探
针包含一个荧光染料和一个荧光素（quencher）分子。
当探针
与PCR反应中的模板DNA序列互补结合时，荧光染料与荧光素分子之间距离较远，荧光信号强度较高。
而当PCR反应进
行到延伸阶段，DNA聚合酶酶活将荧光探针的酶切位点切除，导致荧光染料与荧光素分子之间距离缩小，荧光信号强度降低。
根据荧光信号的变化情况，可以推算出PCR反应过程中DNA
扩增产物的实时累积量。
为了实现定量测定，实时定量荧光PCR还需要设置一个标准
曲线。
首先，制备一系列包含已知浓度的DNA标准品，然后
通过实时定量荧光PCR测定这些标准品的荧光信号。
根据标
准品荧光信号与其对应浓度之间的关系，构建标准曲线。
最后，通过比较待测样品的荧光信号与标准曲线，可以确定样品中的DNA起始数量。
实时定量荧光PCR在科学研究和临床诊断中具有广泛应用。
它可以用于分析基因表达水平、研究遗传变异、检测病原体等。
相比传统的定量PCR方法，实时定量荧光PCR具有灵敏度高、
精确性好、操作简便等优点，成为分子生物学领域中不可或缺的实验技术之一。
实时定量pcr的原理及应用
实时定量PCR的原理及应用一、什么是实时定量PCR？实时定量聚合酶链反应（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction），简称实时定量PCR，是一种高度敏感且快速的核酸检测技术。
它不仅可以定性地检测目标核酸序列的存在与否，还可以精确测量目标序列的数量。
二、实时定量PCR的原理实时定量PCR利用DNA聚合酶的酶活性，在双链DNA模板上合成新的DNA 链。
该技术的原理是：首先，通过一个DNA引物与目标DNA序列特异性结合，并将DNA聚合酶带有荧光标记的探针与其结合。
然后，在每一轮的PCR循环中，DNA聚合酶将合成新的DNA链，并释放一个荧光信号。
这个荧光信号可以实时地被特定的检测设备及时检测到。
根据荧光信号的量，可以判断目标DNA序列的数量。
实时定量PCR主要包含以下步骤：1.DNA模板的制备：包括从生物样本中提取DNA，如细胞、组织或血液等；2.引物的设计：设计两个与目标DNA序列特异性结合的引物，确保引物的长度和温度适宜；3.反应体系的准备：准备PCR反应体系，包括引物、荧光标记的探针以及DNA聚合酶等；4.PCR循环条件的设定：确定PCR循环的温度和时间条件以实现合成新的DNA链；5.实时检测和数据分析：通过特定的实时定量PCR设备实时检测荧光信号，并根据标准曲线计算目标DNA序列的数量。
三、实时定量PCR的应用实时定量PCR在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
以下是实时定量PCR常见的应用领域：1. 生物学研究实时定量PCR可以用于研究基因表达的变化，从而揭示生物体内基因调控的机制。
它可以定量测量不同组织或细胞中特定基因的表达水平，帮助科研人员了解基因在不同生理状态下的功能和调控网络。
2. 分子诊断实时定量PCR在疾病的分子诊断中扮演着重要角色。
通过对人体样本中特定基因的定量检测，可以帮助医生确定某些疾病的存在，并评估疾病的严重程度。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结实时荧光定量PCR技术是一种用于测定DNA样本中特定序列的数量和表达水平的分子生物学技术。
它能够在PCR反应进行过程中实时监测PCR 产物的扩增情况，通过检测荧光信号的强度和PCR循环次数来确定起始模板的数量。
该技术具有高灵敏度、准确性和广泛的应用领域，被广泛用于基因表达分析、病原微生物的定量检测和分子诊断等领域。
在使用引物和探针系统进行实时荧光定量PCR时，引物通过与模板DNA序列的互补配对，在PCR扩增过程中结合并扩增目标序列，而探针是一种荧光标记的序列，通过与目标序列的特定区域配对来检测PCR产物的扩增。
当目标序列存在于DNA模板中时，引物与探针结合扩增会释放出荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过监测荧光信号的强度和PCR循环数，可以推导出起始模板的数量。
SYBR Green是一种无标记引物的特殊荧光染料，可以与扩增产物的双链DNA结合并发出荧光信号。
在PCR扩增反应中，SYBR Green会通过与扩增产物结合形成复合物，并发出荧光信号。
由于SYBR Green能与任意DNA结合形成复合物，所以在使用SYBR Green进行实时荧光定量PCR 时，需要进行特异性验证和内参基因的设计，以确保准确测量目标序列的数量。
在实时荧光定量PCR技术中，还需要进行标准曲线法来定量PCR产物的数量。
标准曲线法是通过制备一系列已知浓度的标准DNA模板并进行PCR反应，测量荧光信号的强度和标准DNA模板的浓度之间的关系，建立一个标准曲线。
然后，通过测量待测样品PCR反应的荧光信号强度，根据标准曲线来计算待测样品中目标序列的起始模板数量。
总结来说，实时荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、准确度和广泛应用的分子生物学技术，可以实时监测PCR反应中荧光信号的强度来确定PCR产物的数量。
它的基本原理包括使用引物和探针系统或SYBR Green 染料来检测PCR反应产物的扩增，并通过荧光信号强度和PCR循环数来推导起始模板的数量。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Real-time Quantity PCR
NJSunshine 李文 2005.11.17
实时定量PCR简介
定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸 定量技术。实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反 应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监 测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板 进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA 模板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠性 更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染 性、具实时性和准确性等特点 。
实时定量PCR的两个重要概念 的两个重要概念 实时定量
反应的前15 （1）荧光域值（ threshold）： 以PCR反应的前15 个循环的荧光信 荧光域值（ threshold）： PCR反应的前 号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3---15 15个循环的荧光信号 号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3---15个循环的荧光信号 的标准偏差的10 的标准偏差的10 倍。 (2)Ct值 也称循环阈值， 代表Cycle， 代表threshold。指在PCR (2)Ct值：也称循环阈值，C代表Cycle，t代表threshold。指在PCR Ct Cycle threshold 循环过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的 循环次数。在实际操作中， 循环次数。在实际操作中，这个时刻也就是每个反应管内的荧光信 号到达设定的域值的时刻,可见Ct值取决于阈值。 Ct值取决于阈值 号到达设定的域值的时刻,可见Ct值取决于阈值。
探针设计一般应符合以下条件： 探针设计一般应符合以下条件： (1)GC碱基含量在40% 60%。 GC碱基含量在40%(1)GC碱基含量在40%-60%。 避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是G （2） 避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是G。 避免5'端为G 因为G对荧光可能有抑制作用， 5'端为 （3）避免5'端为G， 因为G对荧光可能有抑制作用，尽量 个数多于G 使C个数多于G。 长度应在15--25个碱基左右，以保证结合的特异性。 15--25个碱基左右 （4）长度应在15--25个碱基左右，以保证结合的特异性。 探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出约10℃ Tm值要比引物的Tm值至少高出约10℃。 （5）探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出约10℃。 另外，探针与引物不能形成二聚体， 另外，探针与引物不能形成二聚体， 位置与上游引物尽量 接近但不要重叠。 接近但不要重叠。
图.LUX 引物工作原理
为了帮助保护您的隐私， PowerPoint 禁止自动下载此外部图片。若要下载并显示此图片，请单击消息栏中的 “选项 ”，然后单击 “启用外部内容 ”。
Lux引物 引物
LUXTM 技术的优势
1.通过/dlux-easy-to-use methode设计适合客户的实验的LUXTM Primer。 2.购买已经验证，即用的LUXTM Primer－这些引 物只适合看家基因（40＋）和人类基因。 40 3.通过和Invittrogen Custom LUXTM Primer服务中 心联系，由专家给您设计适合您实验的新的引 物。
SYBR GREEN
FRET探针
Taqman
分子信标
LUX 引物
性质
可逆荧光
积累荧光
熔点分析
体有影响）
引物＋2探 针
引物＋探 针
引物＋探 针
引物（非特异性 扩增或引物二聚 体无影响）
探针
不需要
需要
需要
需要
不需要
通用性
通用
专用
专用
专用
专用
1.TaqMan探针方法的作用原理: 1.TaqMan探针方法的作用原理: TaqMan探针方法的作用原理 本方法的原理主要是利用Taq 酶的5'→3' 5'→3'外切核酸酶活性并在 本方法的原理主要是利用Taq 酶的5'→3'外切核酸酶活性并在 PCR过程中反应体系加入一个荧光标记探针 TaqMan探针5'端标以荧 过程中反应体系加入一个荧光标记探针。 探针5' PCR过程中反应体系加入一个荧光标记探针。TaqMan探针5'端标以荧 光发射基团，3'端标以荧光猝灭基团 该探针在PCR 端标以荧光猝灭基团。 PCR过程中不能被延 光发射基团，3'端标以荧光猝灭基团。该探针在PCR过程中不能被延 当探针保持完整时，3'端猝灭基团抑制5'发射基团的荧光发射 端猝灭基团抑制5'发射基团的荧光发射。 伸。当探针保持完整时，3'端猝灭基团抑制5'发射基团的荧光发射。 PCR的退火期 探针与引物所包含序列内的DNA 的退火期。 DNA模板发生特异性杂 在PCR的退火期。探针与引物所包含序列内的DNA模板发生特异性杂 延伸期引物在Taq酶作用下延DNA模板延伸，当到达探针处， Taq酶作用下延DNA模板延伸 交。延伸期引物在Taq酶作用下延DNA模板延伸，当到达探针处，Taq 酶发辉5'→3'外切核酸酶活性，继而发生置换。切断探针后， 5'→3'外切核酸酶活性 酶发辉5'→3'外切核酸酶活性，继而发生置换。切断探针后，发射 基团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。 基团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。这时荧光探测系统便会检 测到光密度有所增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断， 测到光密度有所增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，并 伴有一个荧光信号的释放。由于理论上被释放的荧光基团数目和PCR 伴有一个荧光信号的释放。由于理论上被释放的荧光基团数目和PCR 产物数量是一对一的关系， 产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团的数目也成 正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量。 正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量。由于扩增产物较短 时效率较高，故扩增长度一般为50 150bp 50—150bp。 时效率较高，故扩增长度一般为50 150bp。
(3)RNA UltraSense One-step Quantitative RT- PCR System 适用于超低量RNA摸板的灵敏扩增的 适用于超低量 摸板的灵敏扩增的 QRT-PCR系统 系统 (4)Platinum qRT-PCR Thermoscript One-step System 适用于扩增具有二级结构的RNA 适用于扩增具有二级结构的 2.二步法 二步法 (1)优化于 优化于ABI系统 优化于 系统 ① SuperScript Ⅲ Platinum two-step qRT-PCR Kit w/ROX ② SuperScript Ⅲ Platinum SYBR Green two-step qRT-PCR Kit w/ROX
(2) 适合于其他系统 ① Superscript Ⅲ Platinum one-step qRT-PCR Kit ② SuperScript Ⅲ Platinum SYBR Green one-step qRT-PCR Kit (3) Superscript Ⅲ Platinum CellsDirect 二步法 ① Superscript Ⅲ Platinum CellsDirect Two-step qRT-PCR Kit ② SuperScript Ⅲ Platinum CellsDirect Two -step qRT-PCR Kit w/SYBR Green 3. SuperScript Ⅲ 1st cDNA合成系统 合成系统 SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis superMix for qRT-PCR
经数学证明，Ct值与模板DNA的起始拷贝数（dRn） 经数学证明，Ct值与模板DNA的起始拷贝数（dRn）成反比 。 值与模板DNA的起始拷贝数
作用原理
实时荧光定量PCR常用的检测模式五种： 实时荧光定量PCR常用的检测模式五种： PCR常用的检测模式五种
TaqMan探针 （1）TaqMan探针 GreenⅠ （2）SYBR GreenⅠ （3）LUX引物 ） 引物 (4)Molecular beacon (5)荧光谐震能量传递（FRET,Roche product） 荧光谐震能量传递（ 荧光谐震能量传递
qPCR 试剂盒 1.一步法 一步法 (1)优化于 优化于ABI系统 优化于 系统 ① SuperScript Ⅲ Platinum one-step qRT-PCR Kit w/ROX ② SuperScript Ⅲ Platinum SYBR Green one-step qRT-PCR Kit w/ROX (2)适用于其他系统 适用于其他系统 ① Superscript Ⅲ Platinum one-step qRT-PCR Kit ② SuperScript Ⅲ Platinum SYBR Green one-step qRT-PCR Kit
(2) SYBR Green I荧光染料的作用原理
是一种只与双链DNA小沟结合的染料， DNA小沟结合的染料 SYBR Green I是一种只与双链DNA小沟结合的染料， 当它与DNA双链结合时，发出荧光； DNA双链上释放出 DNA双链结合时 当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出 来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内， 来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信 号强度代表了双链DNA分子的数量。 DNA分子的数量 号强度代表了双链DNA分子的数量。它的缺点是在于能 与非特异性双链DNA 如引物二聚体）结合， DNA（ 与非特异性双链DNA（如引物二聚体）结合，但是其产 生的干扰可能通过熔解曲线分析得到解决。 生的干扰可能通过熔解曲线分析得到解决。 这种检测方法无法应用于多重qPCR中 中 这种检测方法无法应用于多重
Invitrogen qPCR产品 产品 (1) superscript RT 和更好的特异性。 和更好的特异性。 可获得更高的cDNA产量 产量 可获得更高的