标准曲线法相对定量
qpcr相对定量原理
qpcr相对定量原理
用标准品与待测样品进行对照，建立标准曲线。
每个样本至少两个平行样，每个样做四个平行样。
按照标准曲线计算得到的结果要用定量方法进行验证，如果标准曲线不能准确地测定出待测样品的浓度，那么用qpcr测定的结果就是不准的。
检测原理
在核酸分子中，每个碱基都有一个固定的结合位点，称为“内含子”。
“内含子”按一定的规律排列起来，组成一段序列（称为“外显子”），外显子之间以非连续方式排列着。
每个外显子都含有一个核苷酸多肽，即：碱基对，具有特定的密码子编码。
由mRNA中编码蛋白质的序列（称为“外显子”）和编码RNA 中翻译的RNA序列（称为“内含子”）组成的两条cDNA分子称为mRNA和cDNA。
mRNA与cDNA之间存在着碱基配对关系（称为“配对密码”），配对密码可以是一个或几个碱基对（例如：tRNA中：1个核苷酸，mRNA中：5个核苷酸）。
—— 1 —1 —。
相对定量： ΔΔCT法和相对标准曲线法
0.13
41
相对定量结果
8
7
5.6
6
Gene Expression
5 4 3
2
1
1
8.0 0.13
Calibrator
42
t=0
t=0 t = 12 h t = 24 h t = 48 h
软件计算
为你完成所有的计算!
43
Question?
44
所以，这个公式告诉我们对照样本和处理样本之间目的 基因的倍数变化
32
ΔΔCt计算示例
Untreated Treated 1 Treated 2
Cttarg. 26.1 23.8 22.8
Ctnorm. dCt
ddCt 2(-ddCt)
16.7 9.4
0
1
16.0 7.8 -1.6
3ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
17显.7示出两5.倍1 的表达-4.差3 异. 20
39
• 还记得开始时的 相对定量 实验吗? • 我们来算一下 基因表达变化
40
相对定量结果计算
Sample
Time 0
c-myc Averag
e Ct
30.49
GAPDH Average
Ct
23.63
ΔCt c-myc -
GAPDH
ΔΔCt ΔCt treated
-ΔCt untreated
6.86
Cttarg. 26.1 23.8 22.8
Ctnorm. 16.7 16.0 17.7
ΔCt 9.4 7.8 5.1
ΔΔCt 0
-1.6 -4.3
2(-ddCt)
1 3 20
首先, 均一化所有样本 (如：对照样本 –对照样本 ). 接着, 所有样本和对照样本进行比较(未知样本 – 对照样本).
光谱分析-定量分析
光谱分析－定量分析在原子放射光谱中，谱线强度I与试样中组分浓度。
之间的定量关系可用罗马金一赛伯阅历式表示： I＝acb 式中，a为常数；b为谱线自吸系数，在大多数状况下b≈1。
常用的定量分析办法如下： 1．标准曲线法标准曲线法也称外标法，首先配制一系列不同浓度。
的标准溶液，挑选合适的光谱谱线波长，依次测定各个浓度溶液的谱线强度I，绘制以I作为纵坐标，c作为横坐标，并通过原点的标准工作曲线(图3-31)。
当试液中元素含量不很高时，罗马金公式中自吸系数b≈1，此时I与c成正比，标准工作曲线为向来线，相关系数：r≈0.999。
在相同试验条件下，测定样品溶液的谱线强度，再从标准工作曲线，查出样品溶液所含元素的浓度。
目前，原子放射光谱仪经数据处理软件可挺直打印出测定结果的分析报告。
现因为仪器的稳定性大幅提高，ICP 光源的自汲取较低，部分仪器厂商采纳两点法绘制标准工作曲线，即用一个标准溶液，一个空白溶液校准仪器，就可挺直测定样品的含量。
图3-31 Zn元素的I-c标准工作曲线当被测元素含量较高时，谱线的自吸现象较强，此时可采纳对数坐标(IgI-Igc)来绘制标准工作曲线，此时曲线的线性度获得充实，并扩大了测量的线性范围。
2．标准加入法又称标准增量法，它是一种用于检验仪器精确度的测试办法。
此法对难以制备有代表性的样品，可以抑制基体的影响；此外，对低含量的样品，它可充实测定的精确度。
它还可用于检查基体的纯度，检验试样中是否存在干扰物质，估算系统误差并提高测定的敏捷度。
标准加入法首先要举行样品的半定量测定，了解样品中待测元素的大约含量。
然后向样品中加入已知量待测元素后，再对样品举行其次次测定，可通过光强信号的增强量，作图并计算出样品中待测元素的含量。
设待测元素的浓度为cx，向样品中加入不同浓度(c1、c2、c3)的待测元素的标准溶液，然后在相同测定条件下，分离举行测定激发光谱，因I=acb，且b≈1，则在每种加入的标准溶液的浓度下，测定的谱线强度Ii与加入标准溶液的浓度ci成正比，第1页共3页。
Module 相对定量 DDCT法和相对标准曲线法
6420.6 4171.4
1000
100
10
Ct
1
10,000
Treated Ct
1000
Untreated Ct
Ct
202.3 74.6
100 10 1
Relative Quantity
40
Relative Quantity
计算举例
Insulin
18s
Untreated Qavg. 74.6 Treated Qavg. 202.3
再一次,软件的优势. . .
为你计算好所有的倍数关系.
42
不想每次试验都跑标准曲线？
• 另一个选择: 你可以非常精确的一次检测每个 基因的扩增效率…
43
不想每次试验都跑标准曲线？
• 在后续试验里执行一个 ddCt run.
44
6
不想每次试验都跑标准曲线？
• 分析时手动输入每个基因的扩增效率
●最终的相对定量计算就会把每个基因的扩增效率 考虑进去
公式: E = 10(-1/斜率) -1
17
ΔCt 验证试验
A
F
B
G
Ct
[Template]
18
A-F = ΔCt1
对应点相减
C
H
D
目的基因
I
E
J 内对照
Ct
19
对应点相减
A
F
B
G
C
A-F = ΔCt1 B-G = ΔCt2 C-H = ΔCt3 D-I = ΔCt4 E-J = ΔCt5
H
[Template]
4
示例实验
未处理 样本
处理后 样本
HPLC分离条件的优化步骤以及定量计算公式的选择
不同柱子其保留性差异很大，相同条件，不 同柱子比例会不一样。 不同色谱柱需合适的pH范围，一般在2.57.5之间，有的色谱柱比较耐碱，kromasil可以到 10，而杂化xterra在1－12,XDB在pH3-11.
3.分离条件的优化
3.1 容量因子和死时间的测量
在HPLC分析中，容量因子k′是一个非常重要的 参数，对如何选择流动相的溶剂组成、改善多组分 分离的选择性都发挥着重要的作用。 k′=t ′R／t M
式中，Ai—组分i的峰面积；
ƒ′i—i组分的质量校正因子
4.定量计算公式的选择
二、标准曲线法（外标法 / 直接比较法） 在HPLC中比较常用，是一种简便、快速的绝对 定量方法（归一化法是相对定量方法） 测定样品中组分含量时，根据峰面积和峰高在标 准工作曲线上直接查出进入色谱柱中样品组分的浓度 ，也可通过下式计算 pi / % = f i / A i(h i) 式中，A i(h i) —i组分的峰面积（峰高） f i—i组分标准工作曲线的斜率
3.分离条件的优化
2.由色谱柱的操作参数进行计算 t M =ΦηL2/△pd p2 式中，Φ为阻抗因子；η为流动相的动力黏度；L 为柱长； △p为柱压力降；d p为固定相粒径 3.依据经验公式计算 当dc/dp≥10 时，可按下述公式计算 t M： t M =L / u 对全多孔固定相 对非多孔固定相 u=1.5F/dc2 u=3F/dc2
3.分离条件的优化
对组成复杂、由具有宽范围k′值组分构成的 混合物，需用梯度洗脱技术，才能使样品中每个组 分都在最佳状态下洗脱出来。（采用梯度洗脱通常 能将组分的k′值减小至原来的1/10~1/100，从而 缩短了分析时间。）
3.4 相邻组分的选择性系数和分离度的选择
相对荧光定量PCR三种常用方法、注意事项
相对定量方法实际操作（三种常用方法）本人用的是相对荧光定量PCR法，在分子水平上比较课题中5 种新基因的表达差异。
实验进行很多次，感受颇深，同时遇到了一些问题：扩增效率、标准品选择（及赋值）、标准曲线、重复性等问题，希望有同行朋友一起探讨和指教。
parative Delta-delta Ct 法定量流程（RG6000 软件设置）1）.先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线,基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。
2）.同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中P1 P2公式:通过标准曲线确定两个F=2「待检样品目_待检样品看fJ L的基因平均—家基因平均一Ct值Ct值L对照组目的J基因平均Ct 值对照组看家基因平均Ct 值IComparative Delta-delta Ct 法的特点、注意事项及实际应用1). Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。
2).其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。
3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。
Rotor-Gene的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。
反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。
此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。
应用实例:如上图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因( Gene of Interest )和看 家基因(Housekeeper Gene )做标准曲线。
qpcr数据处理公式
qpcr数据处理公式qPCR（实时定量PCR）数据处理的公式包括两个主要部分：相对定量和绝对定量。
下面将分别介绍这两个部分的数据处理公式。
1. 相对定量的数据处理公式相对定量通常是对不同样品之间的基因表达量进行比较。
该方法通过测量目标基因与参考基因（通常是内部控制基因）的相对表达量来确定基因表达量的差异。
以下是相对定量的数据处理公式：- ΔCt法Ct值是实时定量PCR放大到指定阈值的周期数。
ΔCt法通过计算目标基因Ct 值与参考基因Ct值之间的差异来比较基因表达量。
公式如下：ΔCt = Ct (目标基因) –Ct (参考基因)- 2^-ΔΔCt法ΔΔCt法是一种更精确的相对定量方法，它通过计算目标基因与参考基因的ΔCt 值差异来比较基因表达量。
公式如下：ΔΔCt = (Ct (目标基因) –Ct (参考基因))样品A –(Ct (目标基因) –Ct (参考基因))样品BFold Change = 2^-ΔΔCt其中，Fold Change表示目标基因的表达量相对于参考基因的表达量的倍数。
2. 绝对定量的数据处理公式绝对定量是测量目标基因的绝对表达量（例如拷贝数或RNA浓度）。
以下是绝对定量的数据处理公式：- 标准曲线法标准曲线法是一种常用的绝对定量方法，它通过绘制已知拷贝数或RNA浓度的标准曲线来计算未知样品的目标基因拷贝数或RNA浓度。
公式如下：y = mx + b其中，y表示Ct值，x表示已知的目标基因拷贝数或RNA浓度，m表示斜率，b表示截距。
通过将未知样品的Ct值代入该方程，可以计算出相应的目标基因拷贝数或RNA浓度。
- 相对标准曲线法相对标准曲线法是一种更精确的绝对定量方法，它通过绘制已知拷贝数或RNA 浓度的标准曲线和参考基因的Ct值来计算未知样品的目标基因拷贝数或RNA 浓度。
公式如下：y = mx + bΔCt = Ct (目标基因) –Ct (参考基因)ΔΔCt = ΔCt (样品) –ΔCt (标准曲线)Fold Change = 2^-ΔΔCt其中，y表示Ct值，x表示已知的目标基因拷贝数或RNA浓度，m表示斜率，b表示截距，ΔCt表示目标基因与参考基因的Ct值差异，ΔΔCt表示未知样品与标准曲线的ΔCt值差异，Fold Change表示目标基因的表达量相对于参考基因的表达量的倍数。
相对定量pcr标准曲线
相对定量pcr标准曲线相对定量PCR标准曲线。
相对定量PCR是一种常用的分子生物学技术，它可以用来比较不同样本中特定基因的表达水平。
在进行相对定量PCR实验时，标准曲线是非常重要的，它可以帮助我们准确地计算出待测样本中目标基因的表达量。
本文将介绍相对定量PCR标准曲线的构建方法和分析步骤，希望能对相关实验人员有所帮助。
1. 标准曲线的构建。
在构建相对定量PCR标准曲线时，首先需要准备一系列已知浓度的标准样品。
这些标准样品中含有目标基因的不同浓度，通常是通过连续稀释的方法得到。
接下来，将这些标准样品进行PCR扩增，并测定其相对荧光强度。
通过荧光强度和标准样品的浓度之间的关系，可以构建出标准曲线的方程式，从而实现对未知样品中目标基因表达量的定量测定。
2. 标准曲线的分析。
一旦标准曲线构建完成，就可以用它来分析待测样品中目标基因的表达量了。
首先，将待测样品进行PCR扩增，并测定其荧光强度。
然后，将得到的荧光强度值代入标准曲线的方程式中，就可以计算出待测样品中目标基因的相对表达量。
需要注意的是，为了保证结果的准确性，每个待测样品都需要进行多次重复实验，以确保数据的可靠性。
3. 实验注意事项。
在进行相对定量PCR实验时，有一些注意事项需要特别关注。
首先，标准曲线的构建需要使用精确的浓度稀释系列，以确保曲线的线性范围和斜率的准确性。
其次，在进行PCR扩增时，需要严格控制反应条件的一致性，包括温度、时间和试剂的使用量等。
最后，在测定荧光强度时，要注意排除任何可能影响测量结果的干扰因素，确保数据的准确性和可靠性。
4. 结语。
相对定量PCR标准曲线的构建和分析是PCR实验中的重要环节，它直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
通过本文的介绍，希望读者能够对相对定量PCR 标准曲线有一个清晰的认识，能够在实验中熟练地进行标准曲线的构建和分析，从而获得准确的实验数据。
在实际操作中，要严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性和可重复性，为科研工作提供可靠的数据支持。
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标准曲线法相对定量
标准曲线法是一种相对定量的分析方法，常用于测定样品中的目标物质含量。
该方法基于样品与已知浓度的标准品之间的比较，通过建立标准曲线来推断未知样品中的目标物质含量。
实施标准曲线法的步骤如下：
1. 准备一系列已知浓度的标准品溶液。
这些标准品的浓度应当覆盖待测物质的预计浓度范围。
2. 使用适当的分析方法（如吸光光度法、荧光法等）测定每个标准品的信号强度，例如吸光度或荧光强度。
3. 绘制标准曲线。
将标准品的浓度作为横坐标，对应的信号强度作为纵坐标，在坐标图上绘制出标准曲线。
通常使用线性回归或其他拟合方法对标准曲线进行拟合。
4. 测定待测样品的信号强度。
使用同样的分析方法测定待测样品的信号强度。
5. 使用标准曲线推断待测样品中目标物质的浓度。
根据待测样品的信号强度，在标准曲线上找到对应的浓度值。
相对定量是指通过比较待测样品与标准品之间的信号强度或峰面积来推断待测样品中目标物质的相对含量，而不是直接给出绝对浓度值。
这是因为标准曲线法无法消除实验中的误差和变异性，因此只能提供相对的结果。
需要注意的是，标准曲线法的准确性和可靠性取决于标准品的准确性、分析方法的精确性以及实验条件的控制等因素。
在使用标准曲
线法进行定量分析时，应当严格按照标准操作程序和质控要求进行实验，以获得可靠的结果。