壳寡糖的酶法制备和分离技术可行性研究报告
酶法生产壳寡糖及其质量控制研究
江南大学硕士学位论文酶法生产壳寡糖及其质量控制研究姓名：***申请学位级别：硕士专业：食品科学指导教师：***2011-07摘要壳寡糖是一种具有独特生理活性的低聚糖，在食品、医药、农业和环保等领域有着广泛的应用价值。
酶法制备壳寡糖是一种理想的制备方法，但目前酶法制备壳寡糖的底物浓度普遍较低，一般不超过5%，这使得酶解、分离纯化、浓缩以及干燥的成本较高，影响了壳寡糖酶法生产的工业化。
为此，本论文研究了高底物浓度条件下生产壳寡糖的工艺，对酶法生产壳寡糖具有一定的理论和现实意义。
主要研究内容如下：为了提高酶解体系中底物的浓度，采用高剪切分散机对壳聚糖进行了促溶和增溶处理，将底物浓度提高到了10%以上，降低了壳寡糖酶法生产的能耗水平和生产成本。
通过考察温度、pH、酶的添加量、酶解时间及底物浓度对酶解的影响，确定了高底物浓度条件下酶法制备壳寡糖的最适条件：温度45℃，pH4.5，酶的最适添加量8U/g，底物浓度<10%，酶解时间6h。
研究了高物料浓度条件下壳寡糖的分离纯化，采用截留分子量10kDa的超滤膜对壳寡糖进行分级，得到了最适的操作参数：操作压力0.25MPa～0.3MPa，操作温度室温，料液固形物含量5%～10%。
通过静态吸附试验和动态吸附试验，研究了717阴离子交换树脂的脱酸工艺，结果表明：717阴离子交换树脂能迅速脱除酶解液中的残留醋酸，并有一定的脱色作用，脱色率达47.4%，动态吸附试验的最适上样流速为2BV/h，上样量8BV时吸附出现泄漏。
优化了壳寡糖的喷雾干燥工艺，并将喷雾干燥与冷冻干燥、真空干燥和热风干燥进行了比较。
喷雾干燥的最佳工艺参数为：固形物含量25%～30%，进风温度180℃，进料速度55mL/min。
喷雾干燥产品的色泽、溶解性、还原糖、总糖、游离氨基含量和抗氧化活性等各项指标均较接近冷冻干燥，但能耗远低于冷冻干燥，较适合工业化生产。
进行了20L规模的放大实验，结果表明：产品得率达66.5%，比低浓度条件下的制备工艺提高了16%以上，产品的质量较好。
酶法制备壳寡糖研究现状
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称寡聚氯基葡糖 、 甲壳 低 聚糖 ， 无毒 、 热 源 、 变 异 性 ， 无 无 分 子 较低 ， 水溶性 ， 旱 易被 人 体 吸 收 ， 为一 种 功 能 性 低 聚 作 糖 ， 有抑 菌 、 肿瘤 、 血栓 、 血 脂 、 节 人 体 免 疫 及 活 具 抗 抗 调 凋 化 肠 遭 舣歧 菌 等 多 种 生 理 功 能 ， ｆ 丁 受 制 备 方 法 的 限 Ｈ山 制 ， 寡 糖 价 格 ｆ分 昂 贵 ， 制 备 ‘ 一 直 是 国 内外 研 究 壳 其 法
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壳寡糖生产可行性研究报告
壳寡糖生产可行性研究报告一、项目背景和目标壳寡糖是一种从海洋生物中提取的多糖物质，具有广泛的生物活性和医药价值。
壳寡糖能够增强机体免疫力、抗菌抗病毒、抗肿瘤等作用，广泛应用于医药、保健品、化妆品等领域。
目前，壳寡糖市场需求旺盛，但国内市场供应不足，大部分壳寡糖需要依赖进口。
因此，开展壳寡糖生产项目具有广阔的市场前景和经济效益。
二、生产工艺和技术要求壳寡糖的生产主要通过从海洋生物中提取多糖进行制备而成。
首先，需要选择合适的海洋生物资源，如虾蟹壳、贝壳等；然后通过研磨、酶解、过滤等工艺将多糖提取出来；最后通过浓缩、干燥等工艺将壳寡糖制备成产品。
生产壳寡糖需要具备以下技术要求：1. 具备合适的海洋生物资源选择和采购能力；2. 熟悉多糖提取和制备工艺；3. 具备优质产品的干燥和包装技术。
三、市场分析壳寡糖具有广泛的市场需求和应用前景。
目前市场上的壳寡糖产品主要依赖进口，国内供应不足。
随着人们健康意识的增强和对功能性食品、保健品的需求增加，壳寡糖市场将持续增长。
目前，壳寡糖在医药、保健品、化妆品等领域应用较广泛，包括免疫调节剂、抗菌剂、抗肿瘤药物等。
随着壳寡糖的研究和应用深入，未来市场潜力巨大。
四、投资分析壳寡糖生产项目需要投入一定的资金，包括设备购置、厂房建设、人力成本等。
投资额度根据生产规模的大小而定。
投资回报主要依赖于产品销售情况和市场需求。
根据市场分析，壳寡糖有较高的市场需求，可以预期销售规模和利润较高。
五、风险分析壳寡糖生产项目面临以下风险：1. 市场风险：市场需求变化、竞争加剧等可能影响产品销售情况；2. 技术风险：多糖提取和制备技术难度较大，需要具备一定技术实力；3. 原材料风险：需要依赖海洋生物资源，可能受到资源供应限制。
六、经济效益分析壳寡糖生产项目的经济效益主要体现在销售收入和利润上。
根据市场需求和产品价格，可以预期销售收入和利润较高。
经济效益还受到生产规模、产品质量、成本控制等因素的影响。
酶解法制备壳寡糖的工艺探索
壳寡糖（COS）来源广泛、安全无毒、水溶性好，具有降低血脂、抗氧化、抑菌、抗癌肿瘤、提高免疫力等多种生物活性［1-2］。
由甲壳素脱乙酰基制得的壳聚糖分子量大，其应用受到很大限制，而酶法降解壳聚糖反应条件温和且易控制、安全性高、环境污染少［3-5］。
因此，在前人研究基础之上，本研究采用纤维素酶代替成本昂贵的专一性酶降解壳聚糖，通过正交实验，得最佳降解工艺条件，为壳寡糖的制备提供新思路。
1材料与方法1.1实验材料壳聚糖（批号：181211A，脱乙酰度> 95％），某生物科技有限公司；纤维素酶DE-52（产品编号：C8350-100，From Whatman4057-200），北京索莱宝科技有限公司；D-氨基葡萄糖盐酸盐（批号：HL180930Y），山东莱州市海力生物制品有限公司；再生纤维素透析膜（货号：QABO-SP132592-1m截留分子量1000），上海安谱实验科技股份有限公司；冰乙酸，无水乙酸钠，氢氧化钠，无水乙醇，3，5-二硝基水杨酸，焦亚硫酸钠，酒石酸钾钠，苯酚。
1.2仪器设备电子天平，电热恒温鼓风干燥箱，紫外分光光度计，pH计，旋转粘度计。
1.3实验方法溶液的配制。
0.2mol/L醋酸配制：吸取11.3mL冰醋酸溶液于1L容量瓶中，加蒸馏水定容，配制成0.2mol/L的醋酸溶液。
0.2mol/L的醋酸钠的配制：准确称量16.2g无水醋酸钠溶于蒸馏水中，移液至1L的容量瓶中定容，配成0.2mol/L的醋酸钠溶液。
pH5.2醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制：吸取0.2mol/L的醋酸溶液和0.2mol/L的醋酸钠溶液混合配制缓冲溶液，用pH计测量pH在5.2。
壳聚糖溶液的配制：准确称取1.0g壳聚糖原料溶于100mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成pH5.2的1.0%的壳聚糖溶液。
酶液的配制：准确称取0.4g纤维素酶溶于100mL 的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成pH5.2的4g/L的酶液。
DNS试剂的配制：准确称取7.5g 3，5-二硝基水杨酸（DNS试剂）和14.0g氢氧化钠充分溶解于1000mL水中，加入216.0g酒石酸钾钠、5.6mL预先在50℃水中溶化的苯酚和6.0g焦亚硫酸钠，充分溶解后，盛于棕色瓶中，放置5d稳定后，即可使用。
生物酶法制备壳寡糖的现状与未来
生物酶法制备壳寡糖的现状和展望壳寡糖(Chitosan oligosaccharide)，是以氨基葡萄糖为单体通过β-1,4-糖苷键连接的不同聚合度的混合物。
其水溶性好、功能作用大、生物活性高的低分子量产品，分子量小于3000Da。
随着对壳寡糖功能的深入研究，壳寡糖在农业、食品、日用化工、医药等各大领域有突出的效果。
农业上，壳寡糖的抑菌、抗病毒效果，可开发无公害生物农药，它的别称是氨基寡糖素。
另外，壳寡糖促进植物的营养生长，作为零污染的肥料；食品工业方面，壳寡糖具有提高免疫力，抗氧化，降三高的良好功能，是许多食品、保健品追捧的新食品原料；日用化工上，壳寡糖的吸水保湿功效，许多面膜、护肤品等都添加了壳寡糖；壳寡糖具有抗肿瘤、降血压等医疗功效，甚至可以作为疫苗的佐剂，为新药的开发提供思路和原料。
壳寡糖的功能决定着它的巨大市场需求，市场就推动了壳寡糖产业的发展。
目前壳寡糖工业化的生产主要是两种方法：一、物理化学法，通过机械粉碎虾蟹壳，用强碱去蛋白，无机酸脱盐制成壳聚糖，再用微波辐射或强酸降解壳聚糖生产壳寡糖；二、生物酶法，用生物酶降解壳聚糖生产壳寡糖。
物理化学法生产壳寡糖，高污染低质量受到了政府的制约和市场的淘汰，现市面上优质的壳寡糖产品绝大多数是生物酶法生产。
对于第二种方法生产壳寡糖有如下展望。
第一、发现并利用具有更优性质的生物酶目前，商业化的水解酶有溶菌酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶、半纤维素酶对甲壳素和壳聚糖的水解有或多或少的催化效果 [1]. 这些非特异性酶连同特异性的甲壳素酶、壳聚糖酶、糖基转移酶等混合使用很可能开辟最优生物酶法制备壳寡糖的新道路。
虽然不同的非特异性酶有用来以壳聚糖或甲壳素为原料制备壳寡糖，但由于此类酶的水解能力有限，所以探寻更优特质水解酶是有市场需求的。
譬如，分支酶Branchzyme，可作用于壳聚糖并生成聚合度为2-20的壳寡糖，其中聚合度3-8的比例非常高[3]。
研究甲壳素或壳聚糖降解时中会发现，最初的步骤都是考虑将它们溶解，如果有能够直接降解结晶多糖的酶那就是省时高效的工业简化。
壳寡糖的酶法制备和分离技术可行性实施报告
2008年度新苗人才计划项目项目名称：壳寡糖的酶法制备和分离技术的研究一、立项背景及意义壳寡糖(Chitooligosaccharide)，又名甲壳低聚糖，是由氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的聚合度约为2-20的低聚糖，其分子量低于5000，具有稳定的三维结构。
壳寡糖可运用壳聚糖经过生物酶技术降解制得。
壳聚糖广泛存在于自然界的虾壳、蟹壳和真菌中，虽然有特殊的生物活性，但由于其分子量大、水溶性差，在人体不易被吸收而使其应用受到限制。
作为一种生物技术产品，壳寡糖几乎包括了所有壳聚糖的所有优点，它具有良好的生物相容性和生物降解性、亲水性、吸附性、生物学活性等多种理化特征以及天然、高效、毒副作用少、抗药性不显著、性能多样等特点。
科学研究表明，壳寡糖的功能作用和生物活性比起壳聚糖将提高数十倍、应用领域更加广泛、人体吸收率近100%（壳聚糖吸收率6.48%），而且增加了促进钙吸收的新的功能作用，具有较高的科技含量和附加值，发达国家称其为“软黄金”。
壳寡糖具有三调（免疫调节、调节pH值、调节荷尔蒙）、三降（降血脂、降血糖、降血压）、三排（排胆固醇、排重金属离子、排毒素）、三抑（抑制癌细胞、抑制癌细胞转移、抑制癌毒素）等功能，同时，还具有抗自由基、防辐射、抗炎、止血以及促进伤口愈合等功能。
壳寡糖及其衍生产品可广泛应用于医药、保健、食品、日化、农业等领域。
在医药保健领域具有提高免疫、活化细胞、调节血糖血脂血压胆固醇、预防治疗癌症、强化肝功、促进钙吸收、增殖肠道有益菌等功能；在食品饮料领域是一种良好的健康食品添加剂，可增殖乳酸菌、双歧杆菌等人体有益菌100倍以上；在日化领域具有营养皮肤、抑菌、保湿等功能，性能优于传统的透明质酸等产品；在农业领域可激活植物免疫系统和酶系活性，能促进植物生长、提高作物产量和品质、增强抗病力、增殖生物菌肥有益菌群等，具有药肥双效功能，被誉为“不是农药的农药，不是化肥的化肥”，市场前景极其广阔。
壳寡糖制备实验报告
一、实验目的本实验旨在通过酶解法制备壳寡糖，并对其结构、性质及活性进行初步研究。
二、实验原理壳寡糖是壳聚糖经酶解得到的低分子量多糖，具有多种生物活性。
本实验采用壳聚糖为原料，利用壳聚糖酶对其进行酶解，得到壳寡糖。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）壳聚糖：纯度≥95%，分子量10000-20000；（2）壳聚糖酶：活力≥5000 U/g；（3）其他试剂：NaOH、HCl、蒸馏水等。
2. 实验仪器：（1）恒温恒湿箱；（2）磁力搅拌器；（3）离心机；（4）紫外-可见分光光度计；（5）高效液相色谱仪；（6）凝胶渗透色谱仪。
四、实验方法1. 壳聚糖酶解：（1）称取一定量的壳聚糖，加入适量的蒸馏水，搅拌溶解；（2）将溶液pH调至7.0；（3）加入适量的壳聚糖酶，于50℃、pH 7.0的条件下酶解3小时；（4）酶解结束后，用离心机离心分离，取上清液即为壳寡糖溶液。
2. 壳寡糖纯化：（1）将壳寡糖溶液用乙醇沉淀，离心分离；（2）将沉淀用蒸馏水溶解，再次用乙醇沉淀，离心分离；（3）将沉淀用蒸馏水溶解，冷冻干燥，得到壳寡糖固体。
3. 壳寡糖结构鉴定：（1）红外光谱分析：对壳寡糖进行红外光谱分析，确定其官能团；（2）高效液相色谱分析：对壳寡糖进行高效液相色谱分析，测定其分子量；（3）凝胶渗透色谱分析：对壳寡糖进行凝胶渗透色谱分析，确定其聚合度。
4. 壳寡糖活性测定：（1）抑菌活性测定：采用纸片扩散法，测定壳寡糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等细菌的抑菌活性；（2）抗氧化活性测定：采用DPPH自由基清除法，测定壳寡糖的抗氧化活性。
五、实验结果与分析1. 壳寡糖结构鉴定：（1）红外光谱分析：壳寡糖在红外光谱中呈现典型的多糖特征峰，如C-O伸缩振动峰（1040 cm-1）、C-H伸缩振动峰（2920 cm-1）等，表明其结构中含有糖环、羟基等官能团；（2）高效液相色谱分析：壳寡糖分子量为2000-5000，表明其分子量分布较窄；（3）凝胶渗透色谱分析：壳寡糖聚合度为2-20，表明其聚合度分布较宽。
(V)超声波辅助酶法制备壳寡糖及抗氧化活性研究
帖 ５
（１０Ⅷ；一卿扣冀毯硝
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４０ ４５ ５０ ５５ ６０ ６５ ７０ ７５
３．１．２反应体系ｐＨ影响 果胶酶在不同ｐＨ的缓冲体系中水解壳聚糖 的效果变化如图２所示，从图可知反应体系ｐＨ 值对酶解效果有显著影响。产物中还原糖浓度随 着ｐＨ的上升呈现先上升后下降的趋势，在４．０～ ５．０范围内，随着ｐＨ升高，还原糖浓度逐渐上 升，５．０时还原糖浓度最高，当ｐＨ超过５．０之 后，还原糖浓度开始下降。该果胶酶的适用温度 范围为４．０～６．０，在超声波的作用下，该酶作用 于壳聚糖的最适ｐＨ为５．０。 ３．１．３反应体系温度影响 果胶酶在不同超声温度下水解壳聚糖的效果 如图３所示，处理液中还原糖浓度随着温度的上
ｗａｓ
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ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄ—
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境无污染ｐ。４１。
同温度下处理一段时间，随后提高处理液温度
至９０℃灭酶活，高速离心取上清液，测定还原 糖含量，作为壳寡糖产率计算依据∞一Ｊ。上清 液用１０ ｕｍ微孔滤膜过滤除杂，过滤液用旋转 蒸发仪浓缩至原体积的１／３后，真空冷冻干燥 得到壳寡糖。 ２．２．２还原糖含量测定 采用ＤＮＳ法测定处理液中还原糖浓度一Ｊ。取
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壳寡糖的酶法制备和分离技术可行性
研究报告
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新苗人才计划项目
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项目名称:壳寡糖的酶法制备和分离技术的研究
一、立项背景及意义
壳寡糖(Chitooligosaccharide),又名甲壳低聚糖,是由氨基葡萄
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糖经过β-1,4-糖苷键连接而成的聚合度约为2-20的低聚糖,其分子量低于5000,具有稳定的三维结构。
壳寡糖可运用壳聚糖经过生物酶技术降解制得。
壳聚糖广泛存在于自然界的虾壳、蟹壳和真菌中,虽然有特殊的生物活性,但由于其分子量大、水溶性差,在人体内不易被吸收而使其应用受到限制。
作为一种生物技术产品,壳寡糖几乎包括了所有壳聚糖的所有优点,它具有良好的生物相容性和生物降解性、亲水性、吸附性、生物学活性等多种理化特征以及天然、高效、毒副作用少、抗药性不显著、性能多样等特点。
科学研究表明,壳寡糖的功能作用和生物活性比起壳聚糖将提高数十倍、应用领域更加广泛、人体吸收率近100%(壳聚糖吸收率6.48%),而且增加了促进钙吸收的新的功能作用,具有较高的科技含量和附加值,发达国家称其为”软黄金”。
壳寡糖具有三调(免疫调节、调节pH值、调节荷尔蒙)、三降(降血脂、降血糖、降血压)、三排(排胆固醇、排重金属离子、排毒素)、三抑(抑制癌细胞、抑制癌细胞转移、抑制癌毒素)等功能,同时,还具有抗自由基、防辐射、抗炎、止血以及促进伤口愈合等功能。
壳寡糖及其衍生产品可广泛应用于医药、保健、食品、日化、农业等领域。
在医药保健领域具有提高免疫、活化细胞、调节血糖血脂血压胆固醇、预防治疗癌症、强化肝功、促进钙吸收、增殖肠道有益菌等功能;在食品饮料领域是一种良好的健康食
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品添加剂,可增殖乳酸菌、双歧杆菌等人体有益菌100倍以上;在日化领域具有营养皮肤、抑菌、保湿等功能,性能优于传统的透明质酸等产品;在农业领域可激活植物免疫系统和酶系活性,能促进植物生长、提高作物产量和品质、增强抗病力、增殖生物菌肥有益菌群等,具有药肥双效功能,被誉为”不是农药的农药,不是化肥的化肥”,市场前景极其广阔。
当前壳寡糖产品的年需求量在6000吨以上。
在精细化工领域,由于壳寡糖的绿色天然的特性符合世界日化产品的发展趋势,含天然活性物质的化妆品顺应回归自然、科学美容的消费趋势,欧洲现已有60多个与壳寡糖相关的化妆品品牌,年需求壳寡糖1500吨。
中国化妆品年销售额从1982年的2亿元人民币发展到的400亿元,居亚洲第二位。
在生物医药领域,从中国产业发展研究中心统计可知, 中国医药生物技术工业总产值将达到400亿-500亿元。
在保
健食品领域,韩国于1996年即批准壳寡糖为功能性保健食品,中国现在已有许多保健品及药品等年需求壳寡糖上百吨的保健食品生产厂家,国内许多医药保健品公司正在申报壳寡糖保健食品文号,预计年需求量将以高于30%的速度递增。
在农林畜牧领域,因壳寡糖具有良好的抗病虫害功能,且有安全、微量、高效、成本低等优势,可使水果、蔬菜、粮食增产10%-30%,因而能够应用于生物农药产品,部分替代化学农药。
当前中国农业病虫害共余种,受灾面积数10亿亩。
因此壳寡糖在农林畜牧上的应用对中国的农业可持续发
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展具有重要意义,以壳寡糖为基础的生物农药将有广阔的发展空间。
科技部已将”壳寡糖新产品的开发应用”列为国家”九五”攻关计划项目和”十五”招投标项目,要求建立数条年产500吨以上的壳寡糖生产线,到总产值可达1100亿-1300亿元,从而满足国
内市场的需求。
壳寡糖的级别不同,售价差额较大。
农业专用壳寡糖市场价为400元/公斤;食品级壳寡糖市场价为600元/公斤;而化妆品级壳寡糖市场价为150元/公斤。
随着壳寡糖应用范围的不断扩大,加之作为一种性能优异的基础原料,市场需求量将呈稳步上升趋势。
同时,壳寡糖作为一种中间原料,出口市场稳定。
近年来,随着我省海产品加工业的发展,特别是甲壳素综合利用产业的兴起,我省逐步成为东南亚地区海产品加工利用中心和主要的甲壳素产业发展基地。
全省甲壳素制品的直接经济总产值约10亿元左右(与其相关的、间接的纺织、食品、医药、化工等行业的产值达数百亿元)。
在此基础上,本项目从壳聚糖的局限性出发,着重研究了经过专一性酶法技术降解壳聚糖,制备聚合度均一的壳寡糖产品,将使产品的附加值得到大幅度地提升。
因此,本项目的实施,对于有效利用甲壳素资源,促进我省甲壳素行业健康发展,意义重大。
由于项目原料来源方便、价格低廉,将大大降低了加工企业的生产成本,满足了市场紧缺,且安全无公害,推广应用前景广阔,对全国的水产加工业发展具有重要影响。
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