细胞的涂片及简单染色法
细菌涂片的制备及革兰氏染色实验报告
实验三细菌涂片的制备及革兰氏染色[实验目的]1、掌握细菌涂片的制备方法及革兰氏染色。
2、学习无菌操作，树立无菌观念。
[实验原理]细菌细胞微小，无色而半透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助染色使菌体着色（由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用以及离子交换、酸碱亲和等化学作用，染料能使细菌着色，并且因细菌细胞的结构和化学成分不同而有不同的染色反应）后，使其与背景形成明显的色差，从而能较清楚的观察到细菌的基本形态和结构。
根据不同的染色反应，可作为鉴别细菌的一种依据。
微生物染料是一种带苯环的有机化合物，其分子上具有发色基团和助色基团。
前者给化合物以特有的颜色，但不能与细菌结合；后者使化合物具成盐的性质，能和菌体结合。
分为碱性染料、酸性染料和中性染料三类。
根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为三种方法即简单染色、鉴别染色和特殊染色。
革兰氏染色：1884年由丹麦病理学家C.Gram创立。
此法可将所有细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。
是细菌学上最常用的鉴别染色法，有着重要的理论和实践意义。
其染色过程是先用草酸铵结晶紫进行初染，再加媒染剂-革兰氏碘液，以增加染料和细胞的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子量较大的复合物，然后用脱色剂-乙醇脱色，最后用沙黄液复染。
凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）者即为G+菌，反之，脱色后染上复染剂颜色（红色）者即为G-菌。
其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同，通过染色加以鉴别。
革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，且类脂质含量少，经乙醇处理发生脱水作用后反而使其孔径缩小，通透性降低，结晶紫-碘形成的复合物保留在细胞内而不被脱色，结果细胞呈现紫色。
而革兰氏阴性菌的的肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂质含量较高，经乙醇处理后，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，结果细菌被脱色，再经沙黄复染后呈现红色。
细菌一般染色方法
细菌一般染色方法细菌染色是一种常用的实验技术，通过染色使细菌在显微镜下能够更清晰地观察和分析。
细菌染色通常分为简单染色、阴性染色和阳性染色三种方法。
一、简单染色方法：简单染色是最基础的细菌染色方法，主要是用一种染色剂来染色所有类型的细菌。
常用的染色剂有墨汁、甲基蓝、伊红等。
简单染色的步骤如下：1.取一片细菌涂片，将其干燥。
2.在涂片上滴加染色剂，覆盖整个片面。
3.将染色剂置于片上一分钟，用水冲洗。
4.用纸巾将涂片上的多余水份吸干。
5.镶片并观察。
简单染色可以使细菌呈现出斑点或条纹状，并能够区分一些基本形态和结构，但不能提供更多细菌信息。
二、阴性染色方法：阴性染色可使细菌显现为透明，而背景呈色的方法。
常用的阴性染色剂有阿里兹红、印度墨等。
阴性染色的步骤如下：1.将涂片上的细菌涂片均匀涂抹于载玻片上，使其成薄层。
2.滴加阴性染色剂到涂片上，使其均匀覆盖涂片表面。
3.用水冲洗染色液，并用纸巾擦干涂片。
4.镶片并观察。
阴性染色使背景呈色，使细菌透明，从而可以更清晰地观察其形态特征。
三、阳性染色方法：阳性染色可以使细菌显现为有色的圆点或杆状，常用的阳性染色剂有甲基蓝、伊红等。
阳性染色的步骤如下：1.将涂片上的细菌涂片均匀涂抹于载玻片上。
2.将染色剂滴加到涂片上，使其完全覆盖涂片。
3.置片5-10分钟，然后用水冲洗染色剂。
4.用纸巾将涂片上的多余水份吸干。
5.镶片并观察。
阳性染色可以染色细菌，使其呈现有色的形态，便于观察和鉴定。
此外，还有一些特殊染色方法，如革兰氏染色法、氢酒精酸快速染色法等。
革兰氏染色是一种经典的细菌染色方法，通过不同细菌细胞壁的染色性质来将其分为革兰阳性细菌和革兰阴性细菌。
该方法使用革兰紫染色剂和碘液，以及酒精和碳酸盐条件溶液进行染色处理。
氢酒精酸快速染色法是一种常用的快速染色方法，将细菌用甲基蓝染色液处理一段时间后，用酒精和酸性酒精进行洗涤和脱色，最后用伊红染色液着色。
这种方法可以快速地将细菌分为两种主要类型：革兰阳性细菌和革兰阴性细菌。
细菌的常用染色技术
细菌的常用染色技术简单染色法：利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
例如番红。
1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。
2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。
3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。
4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)，染l～2min。
5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。
6．干燥7．镜检复染色：利用用两种以上染料对细菌进行染色。
例如革兰氏染色法。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，需要碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。
碱性染料初染液的象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine ）是常用的媒染剂。
脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精（ethanol）。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，而且将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液为番红。
1.载玻片固定。
在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。
2.草酸铵结晶紫染1分钟。
3.自来水冲洗，去掉浮色。
4.用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。
5.用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。
革兰氏染色步骤6则
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革兰氏染色步骤（1）革兰氏染色步骤步骤革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1、涂片固定。
2、草酸铵结晶紫染1分钟。
3、自来水冲洗。
4、加碘液覆盖涂面染约1分钟。
5、水洗，用吸水纸吸去水分。
6、加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。
7、蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。
干燥，镜检。
染色后，革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。
细菌分类：革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要等病原菌革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属（绿脓杆菌等）、莫拉菌属（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌属（淋球菌、脑膜炎双球菌等）、不动杆菌属（鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等）、克雷伯菌属（主要是肺炎克雷伯杆菌）、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾杆菌等）、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等。
革兰氏染色法的步骤（2）详细阐叙革兰氏染色法的步骤浏览次数：174次悬赏分：0 | 解决时间：2011-5-25 17:44 |提问者：肖箫2011shaw最佳答案革兰氏染色一、目的：在细胞发放之前，利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测，判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
二、原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
掌握细菌的简单染色法
思考题
简单染色:
(1) 你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节? (2) 如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？
革兰氏染色: (1) 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性?其中最关键的环节是什么? (2) 现有一株细菌宽度明显大于大肠杆茵的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大扬杆菌
和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。 (3) 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？
思考题
荚膜染色法: (1) 通过荚膜染色法染色后，为什么被包在荚膜里面的菌体着色而荚膜不着色？
芽孢染色法: (1) 说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢?
操作步骤（continued）
4、染色
操作步骤（continued）
◇ 将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。 ◇ 美蓝染色1-2min；石碳酸复红染色约1min。
5、水洗
倒去染液，用洗瓶（内装自来水）轻轻冲洗，直至涂片上流下来的水无色为止；染色废液收集在废液缸中。 Note: 水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。
革兰氏染色（Gram stain） 1984年，丹麦医生Gram采用革兰氏染色法细菌细胞壁区分为两种类型：革兰氏阴性（G+）和 革兰氏阳性（G-）
革兰氏染色步骤: 1）结晶紫初染；2）碘液媒染； 3）酒精脱色； 4）番红复染
实验原理
G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性 屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故 保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。
简单染色法步骤
简单染色法步骤一、引言染色是一种常见的实验方法，广泛应用于生物学、化学、医学等领域。
其中，简单染色法是最基础、最常用的染色方法之一。
本文将介绍简单染色法的步骤及其应用。
二、准备实验材料和设备1. 实验材料：待染色的样本（如细胞、组织切片等）、染色剂（如甲苯胺染料、嗜酸性染料等）、脱水、透明和固定剂（如乙醇、木质醋酸等）。
2. 实验设备：玻璃片、显微镜、显微镜镜头、显微镜载玻片、显微镜载玻片盖片、显微镜载玻片夹。
三、固定样本1. 取一小片待染色的样本，放置在玻璃片上。
2. 用透明剂和固定剂依次浸泡样本，使其固定在玻璃片上。
3. 将固定后的样本置于通风处晾干。
四、脱水处理1. 取一盛有乙醇的容器，将固定的样本放入其中。
2. 逐渐增加乙醇浓度，例如从浓度较低的乙醇（如70%）开始，逐渐转移到浓度较高的乙醇（如95%）中，最后转移到绝对乙醇中。
3. 每次转移样本之前，需在乙醇中浸泡一段时间，使其充分脱水。
五、染色处理1. 取一盛有染色剂的容器，将脱水后的样本放入其中。
2. 根据染色目的选择适当的染色剂，如甲苯胺染料用于碱性染色，嗜酸性染料用于酸性染色。
3. 将样本在染色剂中浸泡一段时间，使其充分染色。
六、清洗和封片1. 用脱离剂清洗染色后的样本，去除多余的染色剂。
2. 取一片干净的玻璃片，将样本置于其上。
3. 滴加一滴显微镜载玻片夹中的透明剂，将玻璃片盖在样本上。
4. 轻轻压平，使样本均匀分布在玻璃片上。
七、观察和分析1. 将封好的玻璃片放置在显微镜载玻片上。
2. 装上显微镜载玻片盖片，并用夹子夹紧。
3. 将载玻片放入显微镜镜头下，调节放大倍率和焦距，观察样本的染色情况。
4. 根据观察结果，进行分析和记录。
八、实验注意事项1. 在实验过程中，需佩戴手套和口罩，做好个人防护。
2. 实验材料和设备要保持清洁，避免污染。
3. 染色剂的选择要根据不同样本和染色目的来确定。
4. 染色时间和温度要控制适当，避免过度染色或不足染色。
实验二三细菌简单染色和革兰氏染色
四、实验材料
1. 显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、 接种环、载玻片、酒精灯等。 2. 石炭酸复红染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、 95％乙醇、番红（沙黄）染液 3. 菌种：表皮球菌、变形杆菌
五、实验内容与步骤
(一)细菌的简单染色步骤
涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检
1．涂片
取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌 蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌 种(表皮球菌或变形杆菌)与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上 涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。
(二)细菌的革兰氏染色步骤
涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脱色→ 水洗→复染→水洗→干燥→观察
1．取表皮球菌和变形杆菌(均以无菌操作)分别在同一张载玻 片上做涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同。
2．用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。 3．加碘液媒染1min后水洗。 4．斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色 为止，大约需时20~30s，随即水洗。
取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种(表皮球菌或 变形杆菌)与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。 实验二三细菌简单染色和革兰氏染色
(一)细菌的简单染色步骤 简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用简单染色即可。
这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7. 这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7. 由于微生物细胞含有大量水分，对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大,机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差,在普通光学 显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
血细胞常用的染色方法
血细胞常用的染色方法
导入新课
导言：在学习完显微镜使用以及血涂片制备课程之后，我们借助于显微镜观察到了细胞，但是显微镜下细胞都是圆形的，如何将这些细胞区分开呢？我们可以借助于染色技术将血细胞染上颜色，这样我们就能在显微镜下观察到它们的形态了
【板书】
五、血细胞常用的染色方法
1、瑞氏染色法
【讲解策略及方法】：图示法讲解
瑞氏染色法是临床检验血细胞检查中最常用的染色技术，简要介绍其历史再从试剂组成、染色原理、染色方法、染色结果、影响因素等方面进行讲解。
试剂组成：酸性染料伊红E-和碱性染料美蓝M+
染色原理：化学的亲合作用+物理的吸附作用（配合图例进行讲解）
染色方法：涂片、染色、水洗
染色结果：结合图例进行讲解
影响因素：pH
讲解中应注意重点突出，对染色原理、染色结果做重点讲解。
影响因素是本段的难点，可以对蛋白质的化学结构进行分析，加深学生理解。
其余略讲。
2、吉姆萨染色法
【讲解策略及方法】：简单介绍。