农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法制备转化用的农杆菌菌液准备：1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。
2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。
1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。
3．步骤：共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。
28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。
用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。
转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。
4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
（注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。
2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。
3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。
4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。
5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。
花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥（2）拟南芥种植取Columbia生态型的拟南芥种子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min，10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1%的Top agar混匀，平铺在1/2 MS 培养基上，4℃保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18℃、RH为70%条件下培养。
拟南芥（Arabidopsisthaliana）遗传转化实验技术原理
拟南芥（Arabidopsisthaliana）遗传转化实验技术原理拟南芥是植物领域应用较为广泛的模式生物。
由于具有较小的基因组（135 Mbp），生命周期短，可以在多种环境下生长，一直被视为研究植物遗传学、进化、种群遗传学和植物生长发育的系统。
农杆菌介导的蘸花法是目前相对成熟、应用较为广泛的拟南芥稳定遗传转化方法。
转化步骤大致如下：拟南芥（T0代）的花序浸没在一定浓度的含有目标转化质粒的根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）（常用的根癌农杆菌菌株为GV3101）悬浮液中，然后放在一定条件下进行培养（图1 a-e）。
待植物成熟后收集T0代植物的种子，将这些种子放在含有特定抗生素的培养基上进行生长筛选（图1f），获得阳性植株。
与其他植物转化方法相比，蘸花法需要较少的人力和专用试剂，所需设备相对简单且转化效率较高（在优化的条件下大于1%）（1）。
图 1. 拟南芥蘸花法简要过程（2）。
拟南芥瞬时转化常用的有农杆菌介导的叶片转化、基因枪轰击和聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化等方法。
拟南芥的瞬时转化为研究启动子活性、蛋白的亚细胞定位和蛋白相互作用等提供了支撑。
参考文献：Ghedira R.; et al.(2013) The ef f iciency of Arabidopsis thaliana f loral dip transf ormation isdetermined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotypeof the dipped plant. Moecular Plant Microbe Interaction, 26(7), 823-832.Zhang, X.; et al.(2006). Agrobacterium-mediated transf ormation of Arabidopsis thaliana using thef loral dip method. Nature Protocols, 1(2), 641-645.。
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
侵染液制备
1、将保存的农杆菌拿出按1：100的比例接种与5ml含抗生素的液
体YEP培养基中。
28°C、220rpm过夜培养。
农杆菌2h左右繁殖一代，培养时间较大肠杆菌长。
2、将活化好的农杆菌按1：100的比例加入100ml含抗生素的液
体YEP培养基中继续28°C、220rpm培养16h左右。
3、次日中午测菌液OD600值，用含抗生素的液体YEP培养基作为
空白对照。
OD600值达到1.0-1.3之间时，用50ml离心管，
室温4000rpm离心10min集菌。
倒掉上清，加入悬浮液重悬
菌体，调节OD600达到0.8-1.0.
悬浮液100ml为例：ddH2O 1OOml、MS 0.216g、蔗糖5g、L-77 30ul，调节PH=5.8
4、拟南芥有花序、花蕾的植株浸入悬浮好的菌液40-50s ,确保
所有的花都浸在农杆菌培养液中。
浸染后避光过夜，第二天
揭开覆膜。
正常光照培养。
每隔七天转化一次。
可转化3次
提高转化效率。
拟南芥蘸花法
农杆菌蘸花转化拟南芥法1、将低温保存的带有表达载体的农杆菌菌株，分别在对应抗性平板上划线，挑取单菌落接种于5ml的已加入对应抗生素的液体LB培养基中，28℃下250rpm振荡培养18-24h；2、然后相同条件下按照1:100接种扩大培养，总菌液体积为200ml，直到OD600值在0.8-1.0范围内；3、离心沉淀并去上清液，用等体积的5%的蔗糖溶液重悬菌体，在菌液中加入0.02%-0.04%的SilwetL-77混匀；4、将拟南芥的花序在菌液中蘸取0.5-1min即可(在转化前要先将拟南芥的角果剪掉);5、然后将拟南芥苗放置于黑暗，湿润的条件下16h，一周后，重复侵染一次；6、收种后种植后代，向12d的幼苗上喷洒54mg/ml除草剂或在将种子播种于抗性MS平板上以筛选阳性植株。
拟南芥播种1、将拟南芥种子用50%的84消毒液表面消毒6-8 min，继而用无菌水漂洗3次;2、在0.1%琼脂糖中悬浮，然后播种在抗性的MS培养基上，4ºC低温避光处理2天后，转入光照培养室生长。
3、幼苗7d左右便可筛到阳性植株，并移栽到含有蛭石的营养土中继续生长（蛭石：营养土=1：3）。
植株种植的培养箱维持22℃恒温和16h光照/8h黑暗培养的循环培养条件。
注：几种常用抗生素的工作液浓度Kanamycin 50μg/mlGentamicin 50μg/mlRifampicin 25-50μg/mlHygromycin 50μg/mlBarstar 25-50μg/ml注：MS培养基配方（1L）MS盐 4.4gMES 0.5g蔗糖10g调PH至5.8-6.0加Agar 10g(在抗性MS培养基上筛选阳性转基因植株时可不加蔗糖防止长菌)42. Schägger H, von Jagow G (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.AnalBiochem166:368–379.。
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥一、实验目的1.了解浸花法(floral tip)转化的机理；2.掌握拟南芥浸花法(floral tip)转化的技术二、实验原理拟南芥的花序大量产生时，将其在含有转化辅助剂silwet和蔗糖的农杆菌溶液中浸泡20秒，3-4周后对转化植株收种子。
在含有合适抗生素的平板上对种子进行筛选，能够健康生长的幼苗为转基因植株。
三、实验材料及仪器材料：生殖期的拟南芥植株，含目的基因质粒的农杆菌(PCAMIBIA 3301-ZEP)，无菌滤纸仪器设备：超净工作台，恒温摇床，培养箱，台式高速离心机，涡旋仪，抽滤器，高压灭菌锅，电子天平，酸度计，培养室用具：微量移液器，金属药匙，牙科手术钩或细菌涂布器，100 ml无菌三角瓶，直径9 cm 培养，200 ml及1ml tip枪头，枪形镊四、实验步骤1)当野生型株系的拟南芥植株生长了个月左右。
将其主薹剪掉，待其次生薹长出，浸染前剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花；2)将农杆菌菌液扩大培养接入到250 ml含有50 μg/ml的Kan和Rif的YEP的液体培养基中:3)将装有250 ml YEP液体培养基的500 ml三角瓶置于28℃ 200 rpm下振荡培养24 h;4)分批次将250 ml YEP液体培养基装在50 ml离心管中多次离心，每次7500 rpm离心5 min,直到把所有的农杆菌都聚集在管底；5)用5%的蔗糖溶液。
其中加了0.02%-0.05% (VV)的silwet L-77来重新悬浮聚集在管底的农杆菌，直到把浓度稀释到OD600为1.5左右即可；6)把蔗糖溶液重悬的农杆菌菌液放入50 ml 离心管中，将花盆倒转过来，将花序浸入农杆菌中20 s，轻轻转动和晃动植物，保证腋芽生长的花都能浸到液体溶液中，取出后能看见植物上有一层水膜，轻轻晃动植物3-5 s抖掉过多的液体(花在液体中浸泡时间过长有所伤害)。
7)浸染过得植株放置在塑料盆中并用一个高的遮光的袋子遮住植株以保持其湿度,并将盆置于弱光或黑暗的条件下一天；8）将其遮光袋拿去，移到智能气候室培养，并定期补浇营养液，直到角果成熟收获种。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法转化农杆菌：GV3101农杆菌感受态从-80℃取出，冰上融化，加入2-5ul质粒，去郭老师实验室电激转化（拿杯，洗，，吹干，预冷，加菌液，对准方向插杯，AAgr程序，激完后看时间2.2hv、5.0s 左右，每次需确定程序，需带的东西：镊子、枪、枪头、吹风机、纸、水、废液缸），激后往杯中加入200ul不含抗生素的LB，28℃，200rpm复苏30-60min，之后在含50mg/l Kan （1/1000，50mg/ml）、50 mg/l Genta（1/1000，50mg/ml）、50mg/llRif（1/200，10mg/ml）的LB选择平板上涂板，在28℃培养箱中培养2天（1天可见微小单克隆），挑单克隆划板，28℃培养箱中培养2天。
预摇：挑单克隆至30ml 含50mg/l Kan（1/1000，50mg/ml）、50 mg/l Genta（1/1000，50mg/ml）、25mg/llRif（1/400，10mg/ml）的LB 中，28℃，200rpm，24h。
扩培：以1：100扩培至含400ml的1L锥形瓶中，在28℃，200rpm培养13-16h（从冰箱中取出的菌扩培会慢些一般需要16h），至OD600达到1.5-2.0之间收菌，收菌条件5000rpm，8min。
转化植株：转化前一天晚上或是转化当天剪去植株上所有果荚和露白的花配制5%的蔗糖溶液（每种500ml），用少量蔗糖溶液摇悬起菌，在转化前再加入0.02%的Silwet L-77。
将植株茎部浸泡在菌液中50s，取出略甩一下后，放入透明塑料袋中，密封保湿。
所有转化完后，扣上黑色塑料袋和盒子，避光培养24h。
一天后，将植株直立放置，浇水培养，3天1次，保证植株水分充足。
过一周后进行再一次转化。
zqy2009-5-7。
农杆菌介导DR1372基因转化拟南芥的研究
农杆菌介导DR1372基因转化拟南芥的研究张思维;周文波;张新;陈翠娜;代其林【摘要】耐辐射奇球菌(D.radiodurans,DR)在极端胁迫条件下能够继续生存,其耐辐射奇球菌基因组中(DR R1)拥有一个独特的极端环境抗性基因组而被广泛研究.DR1372基因就是在DR R1中克隆得到的一个基因,其蛋白序列存在一个Why 功能域,此功能域可能参与了植物的抗旱过程.我们利用基因工程手段首先构建了植物DR1372-GV3103表达载体,然后利用花序浸染法成功将目的基因DR1372转入拟南芥中,最后对阳性植株进行盐胁迫,证实了DR1372基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性.初步建立了农杆菌介导DR1372基因转化拟南芥体系,为后续DR1372基因的功能研究工作提供了理论基础.【期刊名称】《绵阳师范学院学报》【年(卷),期】2013(032)002【总页数】8页(P57-64)【关键词】DR1372;载体构建;盐胁迫;拟南芥【作者】张思维;周文波;张新;陈翠娜;代其林【作者单位】西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳621000【正文语种】中文【中图分类】O175.120 引言目前，越来越多的抗旱相关基因已经被克隆，并用来提高植物的抗旱性.按照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相关基因分为两大类:第一类是编码在植物抗性中直接起保护作用的蛋白质基因，属于功能基因;第二类是编码在信号传导和逆激基因表达过程中起调节作用的转录因子基因，属于调节基因［1］.Pibn－Smits等将otsA和otsB导入烟草，在干旱胁迫下，转基因植株中海藻糖含量比对照高，叶面积增大，光合活性提高［2］.Kishor等将从乌头叶豇豆中克隆的P5CS基因与CaMV35S启动子连接转入烟草中，发现转基因烟草的脯氨酸含量比对照高10－18倍;干旱胁迫下，转基因烟草落叶少而迟，根比对照长40%，生物量增加2倍［3］.Capell等发现Adc在水稻中的超表达缓解了干旱条件下转基因水稻叶绿素的损失，并提高了水稻的抗旱性［4］.由于转录因子能在转录水平上调控一系列基因的表达，所以转化调节基因能有效地提高植物的耐旱性，与抗旱相关的转录因子有DREB、MYC/MYB、bZIP、WRKY和NAC类等，其中MYB/MYC是植物中最大的转录因子家族.Chen等发现了小麦中23个MYB转录因子，其中有4个与抗旱相关［5］.耐辐射奇球菌(D.radiodurans，DR)是Anderson等科学家在1956年从经过灭菌处理的肉类中发现的一种红色非致病性球菌，目前被认为是"世界上抗性最强的细菌"，因其对电离辐射、干燥、紫外线及一些DNA损伤试剂显示超强的抗性，一直倍受生物医学界的关注［6］.White等在1999年公布了DR R1的完全基因组序列，包括两条染色体，共携带有3195个可预测基因，并对部分基因进行了评注［7］.DR R1基因组可以在一个细胞中完成DNA修复，DNA损伤信号输出，干旱和饥饿胁迫的应答，以及基因组的修复等功能.Battista等推测，在耐辐射球菌R1中的抗旱性研究将用于引导较高生物体的抗旱性研究［8］.DR1372基因是耐辐射奇球菌体内1号染色体上的一个基因，把这个基因转入大肠杆菌后进行培养，经初步定性分析发现，在大肠杆菌中有稳定细胞膜，调节细胞内外渗透压的作用，初步推测为与调节水分胁迫应答有关的基因.对DR1372蛋白序列进行分析发现，其内部存在一个WHy功能域非特异性结合位点，与HIN1蛋白中的WHy功能域结构非常相似［9］.WHy结构域存在于几大类蛋白质家族中，大约由100个氨基酸组成，这些氨基酸由亲水性和疏水性氨基酸交替排列，并且在N末端都存在一个非蛋白氮(NPN)结构.同时，研究者还在胚胎发育晚期蛋白中也发现了WHy功能域的存在，最终推测WHy结构域是参与植物水分胁迫应答以及超敏应答的一类功能域［9］.脱水素是一类亲水性蛋白质，其蛋白结构中也含有一个WHy功能域，它们在胚胎发生后期阶段产生，对低温、外源ABA、干旱、盐渍以及脱水胁迫反应迅速，进而在植株中积累［10、11］.由于WHy功能域参与了干旱胁迫应答，这些间接证据表明DR1372基因在干旱胁迫过程中也可能参与了抗旱性相关的基因.因此，本研究利用基因工程手段构建植物DR1372－GV3103表达载体，将DR1372基因转入拟南芥中，得到转基因抗性拟南芥，并对转DR1372基因拟南芥幼苗进行了盐胁迫的反应，不仅为后续的该基因研究提供了丰富的植物材料，也为DR1372的功能研究包括WHy功能域的功能研究奠定了基础，对植物育种工作也有一定的指导意义.1 实验材料1.1 植物材料拟南芥野生型col－0生态型1.2 菌株DR1372+Z3(DR菌内与干旱相关的基因DR1372与穿梭质粒pRADZ3连接转大肠杆菌)，JM109，JM109，GV31032 实验方法2.1 构建DR1372－GV3103植物表达载体2.1.1 DR1372 基因的引物设计根据DR1372基因序列，利用生物软件Primer5设计出该基因的上、下游引物(分别命名为DR1372－F，DR1372－R);根据pBI121质粒图谱，分别引入XbaI，SacI限制性酶切位点，并设计引物如下:2.1.2 PCR扩增目的基因DR1372用试剂盒(TIANGEN)提取DR1372+Z3质粒，在最优扩增体系下进行PCR扩增.电泳验证.2.1.3 质粒pBI121的提取用试剂盒(TIANGEN)提取pBI121质粒.电泳验证.2.1.4 PCR 产物胶回收PCR产物经电泳检测后，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN)回收扩增的目的片段DR1372和pBI121.电泳验证.2.1.5 DR1372基因和pBI121的酶切，连接，筛选及鉴定2.1.5.1 目的片段DR1372和pBI121质粒用XbaI，SacI(购自Takara公司)进行双酶切，37℃酶切过夜，回收目的片段.2.1.5.2 将回收的目的基因片段和pBI121质粒大骨架片段，16℃连接过夜，重组质粒转化JM109感受态细胞.2.1.5.3 阳性克隆检测:进行菌落PCR初步鉴定，将PCR检测出的阳性单克隆摇菌后送华大基因公司测序.2.1.6 挑取测序成功的JM109单菌落，继代培养，保菌.将保存菌种摇菌提取质粒，得到 DR1372－GV3103植物表达载体.2.2 花序浸染法转化拟南芥2.2.1 培养基:MS培养基中抗性筛选平板加入卡拉霉素(Kan，50 mg/ml)Hoagland＇s(霍格兰氏)液体培养基药品试剂:乙酰丁香酮(AS)Silwet－L77表面活性剂2.2.2 拟南芥种子的消毒、铺板及植株培养选取150粒拟南芥种子，用75%乙醇消毒1 min，然后用无菌水洗2遍;再用2.5%NaClO消毒5 min，用无菌水清洗5遍后，最后用加无菌水少许，放在4℃冰箱春化2 d后进行铺板.铺板前一天按照每板大约25 mL MS配制固体平板培养基，col－0生态型拟南芥种子铺于无抗性培养基上，放入光照培养箱中(22℃，16h/8h光/暗培养 (光强130 μmol·m－2·s－1)).培养10 d后把拟南芥幼苗移栽至培养土中(营养土/蛭石=2:1)，相同温度和光照条件下继续培养，每3 d浇水一次.待拟南芥开出花序准备进行浸染.2.2.3 花序浸染法浸染拟南芥:2.2.3.1 DR1372－GV3103农杆菌的培养:在200 mL LB液体培养基中加入0.2 mL DR1372－GV3103菌液，28℃ 220 rpm振荡培养15 h左右，室温下4000 rpm离心20 min，弃上清，用1/2 MS液体培养基(含AS 100 μmol/L，0.05%Silwet－L77表面活性剂)悬浮菌体，稀释到原体积的10倍，在28℃ 220 rpm振荡培养1 h，菌液浓度达到OD600=0.5时待用.2.2.3.2 浸染:将拟南芥未开花的花序浸入菌液中3－5 s，倒放24 h，并用薄膜覆盖避光24 h，然后21℃光照培养.2.2.4 收取拟南芥的T1代种子:T1代种子采收后，用含有卡那霉素的平板进行转基因阳性筛选，然后提取抗卡那霉素的拟南芥幼苗基因组进行PCR鉴定，阳性T1代幼苗开花结实后，收取T2代种子，得到纯合体转基因拟南芥种子.2.3 转DR1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应2.3.1 拟南芥种子的消毒、铺板选取T2转基因拟南芥种子约200粒，用75﹪乙醇消毒1 min，用无菌水洗2遍;再用2.5﹪NaClO消毒5min，随后用无菌水清洗5遍，再次加入无菌水放置在4℃冰箱进行春化处理2d.然后把春化后的种子铺在25 mL MS固体培养基上，转基因和非转基因拟南芥种子均铺于无卡拉霉素的培养基上，封口放入光照培养箱中培养(22℃，16/8h 光/暗培养 (光强为130 μmol·m－2·s－1)).2.3.2 对拟南芥幼苗进行NaCl盐胁迫待拟南芥幼苗在平板上长出3片叶后，在平板中加入0、100、200、250和300 mmol/L灭菌的NaCl溶液.然后观察拟南芥幼苗的生长状况.3 结果3.1 pBI121－DR1372质粒的构建3.1.1 提取含DR1372基因质粒提取DR1372质粒，其电泳结果如图A所示，我们提取的目标基因条带清晰，无弥散现象，可以用于PCR扩增.3.1.2 DR1372 基因的扩增利用DR1372－F和DR1372－R引物对DR1372基因进行PCR扩增，其电泳结果如图B.DR1372基因分子大小为495 bp，条带位置正确，并且为单一条带.然后对PCR产物进行胶回收，其胶回收电泳结果如图C.3.1.3 pBI121 质粒的提取提取pBI121质粒后进行电泳，其电泳结果如图D所示，所提取的目标基因条带清晰，无弥散现象，可以进行酶切.3.1.4 对DR1372胶回收产物进双酶切，酶切位点分别为XbaI，SacI，经电泳后(图E)再胶回收(图F).同时对pBI121质粒进行XbaI，SacI双酶切，其电泳图和胶回收情况见图G和图H.从图G和图H两个电泳图分析表明:经双酶切后，目的基因DR1372和质粒pBI121都被切开，胶回收后都能够得到清晰单一的条带，该连接了DR1372基因的质粒pBI121载体可以用于大肠杆菌和根癌农杆菌的转化.3.1.5 连接目的基因的质粒转化菌种JM109把链接了目的基因的质粒转化到JM109后，经培养后挑取抗卡拉霉素菌落直接进行PCR扩增，其扩增的部分结果如图I，表明:有多个菌落显示为阳性，把阳性克隆送去测序，测序反馈结果经过软件分析，目的序列与DR1372序列完全一致，说明DR1372外源基因成功导入到了大肠杆菌中JM109.图1 pBI121－1372质粒的构建结果Fig.1 pBI121－DR1372 clone in JM109A －I中M为DL2000 MarkerA:DR1372+Z3质粒电泳条带A:Agar gel electrophoresis of DR1372B:DR1372扩增条带B:Agar gel electrophoresis of PCR productC:DR1372 PCR胶回收验证C:Agar gel electrophoresis of DNA extractionD:pBI121质粒提取验证D:Agar gel electrophoresis ofpBI121E:DR1372双酶切电泳图E:Agar gel electrophoresis of DR1372 digested productsF:DR1372双酶切后胶回收电泳图 F:Agar gel electrophoresis of DR1372 digested products，extractionG:pBI121双酶切电泳图G:Agar gel electrophoresis of pBI121 digested productsH:pBI121双酶切胶回收验证 H:Agar gel electrophoresis of pBI121 digested products，extractionI:JM109菌落PCR验证 I:1:positive control;2:negative control;3－10:PCR products of JM109 with pBI121－DR1372 clone3.2 DR1372－GV3103植物表达载体的构建将测序正确的JM109单菌落质粒转化GV3103感受态，得到的单菌落进行菌落PCR验证，结果如图2.由图2可以选择1－2、4－6号保菌做浸染拟南芥用，阳性率为66.67%.图2 DR1372－GV3103的菌落PCRFig.2 Analysis of DR1372－GV3103M:DL2000 maker，9:阳性对照，10:阴性对照，1 －8:单克隆菌落PCRM:DL2000 Marker;9:positive control;10:negative control;1－8:PCR products of GV3103 with pBI121－DR1372 clone3.3 转DR1372基因拟南芥体系的建立及抗性植株的获得3.3.1 转DR1372基因拟南芥体系的建立利用花序浸染法侵染拟南芥未开花的花序，待拟南芥角果成熟后收取种子(浸染到收取种子的过程如图3所示).将收取的种子用50 mmol/L卡那霉素筛选，得到30株抗卡拉霉素的幼苗，提取抗性幼苗DNA，进行PCR检测，然后得到10株转DR1372基因的阳性拟南芥苗，待成熟后收种T1代种子.对T1代种子进行进一步筛选，得到纯合的转基因阳性植株T2代，T2代得到阳性苗60株，经PCR检测后得到纯合阳性植株22株，阳性率为36.7%.3.3.2 阳性植株的PCR检测对具有卡那霉素抗性的转化植株提取DNA，进行PCR扩增和电泳检测，其电泳的部分结果如图4所示，共检测出12株拟南芥有清晰的495bp大小的扩增条带，说明外源DR1372基因成功转入到野生型拟南芥中.图3 转DR1372基因拟南芥体系的建立Fig.3 Regeneration of transgenic ArabidopsisA:花序浸染后拟南芥 B:50MKan筛选T1代抗性苗 C:T1带抗性拟南芥幼苗 D:T1抗性拟南芥代成株子E:筛选T2代抗性苗 F:T2代抗性拟南芥幼苗G:T2代抗性拟南芥成株A:the impregnated Arabidopsis B:resistant shoots of T1generation C:T1generation Arabidopsis seedlingD:the mature plant of T1generation E:resistant shoots of T2generation F:T2generation Arabidopsis seedlingG:the mature plant of T2generation图4 转DR1372基因拟南芥PCR检测Fig.4 PCR test of DR1372gene in transgenic plantsM:DL2000 maker;1:阳性对照;14:阴性对照(野生型);2－13:抗性植株M:maker;1:positive control;14:Negative controls(WT);2－13:Transformed plants3.4 转DR1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应当转DR1372基因拟南芥T2代和非转基因植株种子发芽生长至第3片叶时，分别添加0、100、200、250和300 mmol/L的NaCl溶液.NaCl胁迫7d后，转DR1372基因拟南芥植株与非转基因植株的生长发育状态发生了很大的变化，并且相同浓度下转基因植株与非转基因植株的萎蔫程度也有着明显的差别(如图5).当NaCL胁迫浓度为100 mmol/L时，非转基因植株叶片开始黄化，盐环境已经对拟南芥的生长产生抑制，而转基因植株未受影响;当NaCL浓度达到200 mmol/L 时，非转基因拟南芥的叶片和茎部黄化程度加重，植株开始萎蔫，同时转基因植株部分叶片也出现黄化;当NaCL浓度达到250 mmol/L时，转基因拟南芥植株与非转基因植株都出现了不同程度的萎蔫死亡，但非转基因植株萎蔫程度要比转基因植株严重;当NaCL浓度达到300 mmol/L时，非转基因拟南芥绝大部分萎蔫死亡，转基因植株虽然叶片和茎部出现萎蔫发紫，但死亡程度较小，部分植株仍能正常生长存活，说明转基因拟南芥有一定的抗盐能力，盐胁迫环境下下，DR1372基因在一定程度上调控了植株度过盐环境.图5 转DR1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应Fig.5 Growth of transgenic and wild type Arabidopsis seedlings treated with different concentrentions of NaCL4 讨论近几年许多与植物抗旱耐盐相关基因被克隆和分析，同时通过转基因技术将这些基因转入到植物中进行异源表达，能显著提高转基因植物的抗旱耐盐能力.其中转录因子通过与相关基因的特异性结合来调控其表达，进而产生相关调控蛋白等物质增强植物在逆境中的生存能力［12］.DR1372基因的蛋白中有WHy结构域，这结构域是通过对HIN1蛋白进行分析鉴定的一种独特的结构域.Francesca D、Ciccarelli、Peer Bork［9］等人研究表明，WHy结构域在植物中具有抗水分胁迫和高敏反应等干燥应答功能.WHy功能域作为一种干燥响应蛋白，在国内的研究中外鲜有报道，在植物体内的抗水分胁迫应答机制中，是WHy功能域独自发挥了作用还是能够识别某些特定的序列而协同发挥响应，这一问题有待进一步探究. 对转化了DR1372基因的大肠杆菌进行定性分析发现，逆境下的大肠杆菌中细胞膜很稳定，其细胞膜调节细胞内外渗透压的能力很强.由此推断，将DR1372基因通过基因工程手段转入植物中，该基因可能会提高植物抗旱性，以此为基础通过培育抗旱品种，以降低干旱对农作物产量的影响.拟南芥是转基因最好的模式植物，由于其基因高度纯合，并且自花授粉，能够快速鉴定基因的相关作用.本研究通过基因工程手段成功将外源基因DR1372转入了拟南芥基因组中.实验中构建了DR1372－pBI121载体，载体上带有一个GUS基因，以及CaMV35S强启动子和NOS终止子，能够稳定调控DR1372基因在植物中的表达.利用冻融法将植物表达载体DR1372－pBI121载体导入农杆菌GV3103，最后利用根癌农杆菌介导法成功将外源基因DR1372整合到拟南芥.对DR1372基因拟南芥幼苗进行盐胁迫反应，发现转基因植株与非转基因植株在盐胁迫反应过程中，当NaCL浓度较小时，虽然植株的生长都受到了抑制性影响，但转DR1372基因拟南芥植株的抑制作用明显小于非转基因植株，当浓度达到300 mmol/L时，非转基因植株基本萎焉死亡，而部分抗性植株仍能存活生长，说明DR1372基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性.本实验通过基因工程手段，成功得到转DR1372基因阳性植株，盐胁迫处理发现阳性植株比非转基因植株有更强的耐盐功能，这为后续该基因或类似功能基因的抗旱、抗盐性研究提供了丰富的植物材料和理论依据.参考文献:［1］李晓慧，董明伟，刘康.植物抗旱基因及其功能研究进展［J］.江苏农业科学，2009，5(4):73－77.［2］Pilon－Smits E A H，Ebskamp M J M，Paul M J，et al.Improved performance of transgenic fructanaccumulating tobacco under drought stress［J］.Plant Phyiol，1995，107:125 －130.［3］Kishor P B K，Hong Z，M iao G，Hu C A，et al.Overexpression of pyrroline carboxylase synthase increase proline production and confersosmotolerance in transgenic plants［J］.Plant Physiol，1995，108:1367 － 1394.［4］Capell T，Escobar C，Liu H，et al.Overexpression of the oatarg in inedecarboxylase cDNA in transgenic rice affects normal development patterns in vitro and result in putrescine accumulation in transgenic plants ［J］.Theor Appl Genetics，1998，97:246－254.［5］Chen J.and Wang Z.Y.Progress in the study of plant mybtranscription factors，Zhiwu Shengli Yu Fenzi Shengwuxue Xuebao(Journal of Plant Physiology andMolecular Biology)，2002，28(2):81 －88.［6］Anderson，A.W，Nordon，H.C，Cain，R.F.，et al.Studies on a radio－resistant micrococ－cus.I.Isolation，morphology，cultural characteristics，and resistance to gamma radiation［J］.Food Technol，1956，10:575 －578.［7］White O，Eisen J.A，Heidelberg J.F，et al.Genome sequence of the radio－resistant bacterium Deinococcus radiodurans R1［J］.Science，1999，286:1571 －1577.［8］Cominelli E，Sala T，Calvi D，et a.l Over exp ression of theArabidopsis AMYB 41 genealters cell expans ion and leaf surface permeability［J］.Plant Journal，2008，53(1):53 －64.［9］Francesca D.Ciccarelli and Peer Bork .The WHy domain mediates the response to desiccation in plants and bacteria［J］.Discovery Note，2005，8:1304 －1307.［10］Ingram J，Bartels D.The molecular basis of dehydration tolerance in plants［J］.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1996，47:377－403. ［11］刘广宇，魏令波，陈吉龙，等 .植物脱水素研究进展［J］.生物工程进展，2001，21(2):35－38.［12］陈丽萍，何道一.植物抗旱耐盐基因的研究进展［J］.生物工程进展，2010，29(3):542－549.。
农杆菌侵染拟南芥方法
农杆菌侵染拟南芥方法植株准备：养的壮壮的，可以适时打顶，剪掉顶端，长更多侧枝。
1.冻融法转化农杆菌1.1 目的质粒与农杆菌GV3101感受态混匀，冰上共孵育5-30min, 液氮中冻5min, 37℃5min, 冰上2min, 加入无抗性LB 28℃恢复培养2-4h, 涂相应抗性板，28℃培养24-48h.2. 摇菌2.1 PCR鉴定单克隆，挑选阳性单克隆接入2-3ml相应抗性LB中，小摇至橙黄色，约24-48h。
如果是保种的菌，最好也要小摇。
2.2 按0.5%-1%接种量接入~150ml相应抗性LB中，过夜至橙黄色。
2.3 收菌，5000rpm,10min（最好用250ml的离心瓶，50ml的离心管也可）。
菌体沉淀用等体积（大摇菌的LB体积, 不是沉淀的体积，收菌的时候在瓶子上画个线即可）5%蔗糖溶液（水溶）重悬，手晃、枪吹打、涡旋均可。
加入~0.1% （0.5‰上下100倍均可）Silwet,摇匀。
3.侵染3.1 待侵染的植株剪去果荚和开放的花。
植株在前一天浇足水。
（可侵染前一天剪，不剪也是可以的）3.2侵染液（5%蔗糖重悬的菌液）倒入比较浅的容器（枪头盒盖子、15cm培养皿或其他类似盒子均可）中。
3.3将保鲜膜铺在桌子上或地上，将植株的花序和茎（茎上的腋芽）浸入侵染液，静置30-60s,拿出放置于保鲜膜上，包起来（包住盆的一部分和植株全部），平着放入黑色塑料袋内或者盆内（遮光即可）。
18-22h后，揭去保鲜膜，正着放置生长即可。
如此时发现还有明显菌液，可晃一晃去除，令植株的花序不要黏在一起。
揭保鲜膜最好不要超过20h, 超过24h，花序蔫掉的比率会大大增加。
3.4 侵染后7-10天后可以进行第二次侵染。
这次坚决不能剪果荚和花二次侵染前提是植株的花序顶端还很壮，还能开好多花，否则就等着花序蔫掉吧，切记切记。
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农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌渗透转化拟南芥
1）取含有重组质粒的农杆菌，在含有相应抗生素的YEP（LB也可以）平板上划线，28℃培养2-3d。
2）取划线的农杆菌单菌落，接种在3ml含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，250rpm，振荡过夜培养。
3）在400-500ml 含相应抗生素的YEP培养基中，接种3ml过夜培养的起始农杆菌液，并在28℃摇床上振荡过夜，培养至细菌OD600值大于2.0。
4000rpm离心
10min收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液（1/2MS，50g/L蔗糖，0.5g
MES，pH=5.7-5.8，250ul/L silwetL-77(0.02%silwet)）中，此时的OD600值约
为0.8。
一般来说，400ml YEP过夜培养的农杆菌应至少可以渗透转化6钵植株。
4）在一个开口的大器皿（如500ml烧杯）内倒入200-300ml的悬浮有农杆菌的渗透液。
5）将生长有拟南芥的培养钵（盛花期拟南芥，最好在转化前修剪掉果荚和已经开放的花）小心地反扣在上述器皿内，让拟南芥的花芽完全浸入农杆菌悬浮液中
大约1min，将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净。
6）将处理过的植物用塑料盖盖上避光大约24h培养。
7）将植物放置在适宜的条件下培养3-4周，收集种子，进行下一步的筛选处理。
转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
Silwe-77t：加300微升/L 浸30s 50-100微升/L 浸3分钟。