农杆菌转化法将拟南芥基因导入油菜
将目的基因导入植物细胞的方法
将目的基因导入植物细胞的方法随着生物技术的不断发展，基因编辑和转基因技术在农业领域中得到了广泛的应用。
将目的基因导入植物细胞，可以使植物获得更好的抗病性、耐旱性、耐盐性等性状，从而提高植物的产量和品质。
本文将介绍几种常见的将目的基因导入植物细胞的方法。
1. 农杆菌介导的转化农杆菌介导的转化是将外源DNA导入植物细胞的一种常见方法。
农杆菌是一种土壤细菌，具有天然的基因转移能力。
它可以将Ti质粒（土壤杆菌肿瘤质粒）导入植物细胞，并在植物细胞中形成肿瘤。
利用这种特性，科学家可以将目的基因植入Ti质粒中，然后通过农杆菌介导的转化将其导入植物细胞中。
这种方法适用于多种植物，包括拟南芥、玉米、水稻等。
2. 基因枪法基因枪法是将外源DNA通过压缩气体或加速粒子的方式直接送入植物细胞的一种方法。
这种方法不需要农杆菌或其他转化载体的介入，因此可以避免由于介导体的限制而导致的转化效率低下的问题。
基因枪法可以用于多种植物，包括玉米、大豆、小麦等。
但是，由于该方法需要使用高压气体或加速粒子，因此设备成本较高，操作难度较大。
3. 电穿孔法电穿孔法是将外源DNA通过电场脉冲的方式导入植物细胞的一种方法。
在这种方法中，植物细胞被置于含有外源DNA的缓冲液中，并受到电场脉冲的作用，使得细胞膜发生短暂的孔隙，外源DNA通过这些孔隙进入细胞质。
该方法适用于多种植物，包括拟南芥、玉米、水稻等。
电穿孔法具有转化效率高、设备成本低、易于操作等优点，因此被广泛应用于植物基因转化中。
4. 直接DNA转化法直接DNA转化法是将外源DNA与植物细胞一起置于含有多种物质的缓冲液中，通过一系列的化学反应和电化学反应使外源DNA进入植物细胞的一种方法。
该方法适用于多种植物，包括拟南芥、玉米、水稻等。
直接DNA转化法具有操作简单、无需特殊设备等优点，但转化效率相对较低。
总之，将目的基因导入植物细胞是一项重要的技术，可以为农业生产提供更多的选择。
不同的转化方法各有优缺点，选择适合的方法需要考虑多种因素，包括植物种类、实验目的、设备和技术条件等。
农杆菌介导法将fpf1基因导入油菜的研究初报
农杆菌介导法将fpf1基因导入油菜的研究初报近年来，随着转基因技术的发展，农业生产力增加的问题也越来越受到重视。
然而，研究人员发现，目前主要的转基因技术都有一定的局限性，它们不能解决农作物生长发育、抵抗病虫害以及适应新的环境的问题。
因此，研究人员正在努力开发新的转基因技术来解决这些问题。
一种新的转基因技术是农杆菌介导法，它可以有效地将植物所需的基因移植到另一个基因组中。
最近，国内研究者在探究农杆菌介导法将fpf1基因导入油菜的研究初报上取得了积极的结果。
本文将概述这一研究内容，并就其对农业生产的意义进行分析。
农杆菌介导法将fpf1基因导入油菜的研究内容FPF1是绿植基因家族成员，可以在多种生理环境中调节花色、光合作用和抵抗胁迫，从而提高植物的生产效率。
本研究利用农杆菌介导法将fpf1基因插入油菜基因组中，并通过实验发现fpf1基因可以有效地抑制油菜植株的叶绿素含量，提高植株的耐旱性，明显提高植株的生长速度和抗逆性。
以上实验结果表明，fpf1基因可以有效地提高油菜的种植效率，使油菜更快、更有效地完成其生长发育过程，从而为油菜的种植奠定良好的基础。
关于农杆菌介导法将fpf1基因导入油菜的研究的意义利用农杆菌介导法将fpf1基因导入油菜，不仅可以提高油菜的长势和抵抗性，而且还可以提高油菜的种植效率。
据估计，这将有助于提高中国油菜的种植面积，从而提高中国油菜的种植效率。
同时，把fpf1基因植入油菜也有助于提高植物抗病虫害能力，从而保护种子作物免受病虫害的侵袭，同时减少农药的使用，从而改善农业的环境质量。
结论农杆菌介导法将fpf1基因导入油菜的研究为转基因技术的发展和应用提供了一个新的路径，具有重要的实用价值和推动意义。
通过这项技术，可以在油菜中提高抗病虫害能力，增加农作物的生长速度和抗逆性，提高农作物的生产效率，改善农业的环境质量，使更多的农产品获得良好的品质。
有关转基因技术的研究仍有很多问题需要解决，因此未来的研究需要加强，以期在更多的农作物品种上取得成功。
eha105 拟南芥原理
EHA105 拟南芥原理详解拟南芥简介拟南芥（学名：Arabidopsis thaliana）是一种小型的模式植物，属于十字花科，是研究植物生物学和遗传学的重要模式生物。
拟南芥的基因组相对简单，具有短的生命周期和快速的生长速度，使其成为研究植物基因功能和表达调控的理想模型。
拟南芥转化技术拟南芥转化技术是将外源基因导入拟南芥植株中，使其表达特定的基因或蛋白质。
其中，EHA105是一种常用的拟南芥转化介导体，通过农杆菌介导的转化方法将目标基因导入拟南芥。
拟南芥转化技术的基本原理如下：1.农杆菌介导的转化：农杆菌是一种常见的土壤细菌，具有天然的遗传转化能力。
利用农杆菌的特性，可以将目标基因导入拟南芥细胞中。
转化过程中，农杆菌通过寄生在植物细胞上的线粒体和质体，将外源基因导入植物细胞的染色体中。
2.构建转化载体：为了将目标基因导入拟南芥细胞中，需要构建一个转化载体，其中包含了目标基因的DNA序列。
转化载体一般由多个功能模块组成，包括选择标记基因、启动子、终止子等。
选择标记基因可以在转化后的拟南芥中表达，用于筛选转化成功的植株。
3.转化条件优化：转化过程中，需要优化一系列的条件，以提高转化效率。
包括农杆菌的培养条件、拟南芥的生长条件、转化载体的浓度和转化时间等。
通过优化这些条件，可以提高转化效率，增加转化成功的概率。
4.筛选转化植株：转化后的拟南芥植株需要经过筛选，以确定哪些植株成功地导入了目标基因。
常用的筛选方法是通过选择标记基因的表达来鉴定转化植株。
选择标记基因一般与目标基因共同构建在转化载体中，通过选择标记基因的表达来判断转化是否成功。
5.遗传稳定性验证：转化后的拟南芥植株需要进一步验证其遗传稳定性。
通过后代分析，确定转化基因是否稳定地遗传给下一代。
通常，通过PCR、Southern blot等方法来检测目标基因的存在，并验证其在后代中的稳定性。
EHA105的特点和应用EHA105是一种常用的拟南芥转化介导体，具有以下特点和应用：1.高转化效率：EHA105具有较高的转化效率，可以在较短的时间内实现大量的拟南芥转化。
农杆菌介导的高赖氨酸基因在油菜中的转化的开题报告
农杆菌介导的高赖氨酸基因在油菜中的转化的开题报告
作为一种重要的油料作物，油菜具有广泛的应用前景。
然而，传统育种方法耗时耗力，效率低下，而利用遗传工程手段进行改良则成为了优选的选择。
农杆菌介导的基因转
化技术作为一种可重复、可控、可靠的遗传工程手段在农作物改良中得到了广泛应用。
本研究旨在利用农杆菌介导的高赖氨酸基因在油菜中的转化，以提高油菜的营养价值
和抗逆能力。
具体研究内容包括以下几个方面：
1.高赖氨酸基因的克隆和构建载体：通过NCBI数据库检索高赖氨酸合成相关的基因序列，利用PCR技术将其扩增出来，然后将其插入到适合农杆菌介导转化的植物表达载
体中，最终构建出高赖氨酸基因携带的载体。
2.农杆菌介导转化油菜根垂直培养法：使用含有高赖氨酸基因载体的农杆菌进行转化，在油菜种子上进行感染，然后放入含有适宜激素和抗生素的培养基中，进行繁殖，得
到转化后的油菜幼苗。
3.转化效率的评价：采用PCR技术或蛋白质表达分析等方法，对转化后的油菜幼苗进
行基因水平和表型水平的鉴定和评价，以此来评估农杆菌介导转化油菜的效率和稳定性。
4.抗逆能力和营养价值的测定：对转化后的油菜幼苗进行逆境胁迫试验和化学成分测
定等实验，以验证高赖氨酸基因的表达是否能够提高油菜的抗逆能力和营养价值。
通过以上研究，本项目旨在验证高赖氨酸基因在油菜中的转化效果和提高油菜的营养
价值和抗逆能力。
这对于油菜品种的改良以及开发更为优质的油菜产品具有重要意义。
花分生组织决定基因APETALA1转化油菜
（ｎｔｕｅｏ ｇｏｂ ｔ ｈ ｏ ｇ ， ｉｎｓ ｃｄｍ ‘ｇｉｕ ｕａ ｃ ｎｅ， ａ ｎ １０ ４ ｈｎ ） Ｉｓｔｔ ｆＡ ｒ—ｉ ｅ ｎｌ ｙ Ｊａ ｇｕＡａ ｅ ｙｏ Ａ ｒ ｌ ｒｌ ｉ ｃｓＮ ｇ２０ １ ，Ｃ ｉ ｉ ｏｃ ｏ ｊ ｃｔ Ｓｅ ａ
Ａ ｓ ａ ｔ Ｔ ｅ Ｐ Ｔ Ｌ １（ Ｐ ）ｇｎ ｆ ｒｂ ｏｓ ａｉｎ ｐ ｃ ｅ ｆ ｗ ｒ ｒ ｔｍ ｉｅ ｔｙａ ｄ ｉ ｒ ｕｒ ｒ ｂ ｔ ｃ ： ｈ Ｅ Ａ Ａ Ａ １ ｅ ｅｏ Ａ ａ ｉ ｐｉ ｔ ｌ ａ ｓ ｅｉ ｓ ｏ ｅ ｍｅｉ ｅ ｎｉ ｎ ｑ ｉ ｄｆ ｒ Ａ ｄ ｓｈ ａ ｉ ｌ ｆ ｓ ｄ ｔ ｓｅ ｅ ｏ
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维普资讯
江 苏农 业 学报 （ ｉｎｓ ．ｆＡ ｒＳｉ）２ ０ ，３ ６ ：６ ５ ７ Ｊ ｇｕ， ｏ ｇ． ｃ ，０ ７ ２ （ ） ５４～ ６ ａ ．
花 分 生 组 织 决定 基 因 Ａ 船
（ 江苏省农业科学 院农业生物技术研究所 ， 江苏 南京 ２０ １ ） １０ ４
拟南芥基因的克隆和在油菜花中的表达
m iR395d前体基因的 前体基因的PCR扩增结果 前体基因的 扩增结果
3. PCR产物的回收与测序 产物的回收与测序
PCR 产 物经 琼 脂糖凝 胶电泳回收试剂盒回 收 后 与 克 隆 载 体 pMD19 TVector连接, 转化DH5α感受态细胞, 在含有Isop ropyl2β2D 2thiogalactoside( IPT G) 、 X2gal 和 Amp 的 LB平板上挑选单克隆, 单克隆经鉴定后送金 思特生物公司测序。
1. 拟南芥 拟南芥DNA的提取 的提取
法从幼嫩的拟南芥叶片中提取DNA。 用CTAB法从幼嫩的拟南芥叶片中提取 法从幼嫩的拟南芥叶片中提取 。
拟南芥m 拟南芥 iR395d前体茎环发夹图 前体茎环发夹图
2.拟南芥 iR395d前体基因的克隆 拟南芥m 拟南芥 前体基因的克隆
参照拟南芥miR395d前体基因序列设计引物, 为了便于 miR395d过表达载体的构建, 在上游引物的5′端加入了B glⅡ酶切位点, 下游引物5′端加入了SpeⅠ酶切位点, 以拟 南芥DNA为模板, PCR扩增466 bp左右的miR395d前体 基因。引物序列如下: 上游引物S1: 上游引物S1: 5’AGATCTATGTCACCCATCCTATCTTCCTCA23′ 下游引物S2: 下游引物 5′ACTAGTCAACCTCGATCCTCTTA2ACCTGTA23′ PCR反应体系 10 ×缓冲液(含Mg2 + ) 5µL, 10 mmol·L - 1 反应体系: 反应体系 dNTP 2µL, 10µmol·L - 1引物各2 µL, cDNA 第1 链模板2 µL, Taq酶( 5 U ·µL - 1 ) 1 µL, ddH2O 38 µL。扩增条件如 下:94 ℃ 4 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30个 循环; 72 ℃ 7 min。
油菜植株的农杆菌介导转化及其抗虫性研究
导人农作物 ． 可提高转基 因植物对害虫的抗性 。因此转 基 因技 术在农业上 的应 用前景 十分广阔 。虽然世界上
转基 因油菜的种植面积 已高达 ３ ０万公顷 ，但 直到 目 ６ 前国外 尚无真 正具有应 用价 值的抗 虫转 基因油 菜 ， 国
内也仅仅是在最近 几年才成功将苏 云金杆 菌杀虫晶体
摘 要： 采用 农杆 菌介 导法把 质粒 ｐ ｌ０ 一 ｈ－ ｍ （ 虫 、 病 ） Ｂ ｌ１Ｃ ￣Ｂ ｋ 抗 抗 导入 油菜 ， 得抗 卡那 霉 素植 株 １３ 。经 Ｐ Ｒ 检测 ， 取 ８棵 Ｃ 在 １７ 转 化植株 中检测 到待 检 成分 的存 在 ， 化率 为 ５．％。 活虫 喂养 试验 表 明 ， ０株 转 ８ ５ 大部分 转化植 株 对 油菜 菜粉 蝶具 有 较强 抗性； 同对 照植株 比较 ， 虫存 活率 明显减 少 ， 活幼 虫 的发 育也 受到 不 同程度 的影 响。 同 时 Ｅ ＩＡ检 测 的结 果也 证 明 目 幼 存 ＬＳ
体。
１ ． 根瘤农 杆菌培养及 油菜外植体 转化 ．２ ２
挑取所 用
农杆菌 质粒 单菌 落 ， 接种 在 Ｐ Ｂ培 养基 中 （８ ，４ Ｅ ２ ℃）２ ３ ６小时后 ， 离心收 集细菌 ， 并将细 菌重新悬浮 于 ＭＳ培 养基中 ２ ℃继续培养 ６ ８小时 ．使细菌活化并逐 步适 ８ 应转化时 的培养基条件 。 将制备好的 已经预培养 ２天 （ Ｍ 在 Ｓ培养基上 ） 的 外植体浸泡在 农杆菌液 （ 菌液 Ｄ ＝ ． Ｄ ｏ ５或 ０１ 中 ５ ８ ０ ．） — 分钟 ， 用滤纸吸干外植体 表面 上附着 的农杆 菌 ． 放置于 ＭＳ培养 基上共 培养 ２天 ，然 后转 移到含 有卡 那霉素 （５ ｇＬ 和羧 卞青霉 素 （０ ｍ ／） Ｍ ２ｍ ／） ５ ０ ｇＬ 的 Ｓ培养基 上继续
农杆菌介导法将fad2基因的ihpRNA表达框转入甘蓝型油菜
序列表达框的特定条带 。初步证 明目的基 因序列 已经整合到 了油 菜的基因组 中。
关键词 ： 转基 因油 菜 ；农杆菌 ；油酸脱饱 和酶基 因 ；ｉｐ Ｎ ｈ Ｒ Ａ表达框
中图 分 类 号 ： Ｓ６ ．０ ．３ ５５ ４ ３５ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ： １０ ４４ ０ ２０ ） ２０ ３ －６ ０ ０ ４ （ ０ ８ ０ －１００
Ｔ ａ ｓ ｒｉｇ ａ ｎ ｅｔｄ Ｒｅ ｅ ｔＥ ｐ ｅｓ ｎ Ｃ ｓｅｔ ｆ ａ ２ Ｇｅ ｅ ｉｔ ｒ ｎｆ ｒ ｎ Ｉｖ ｒｅ ｐ ａ ｘ ｒ ｓｉ ａｓｔ ｏ ｄ ｎ ｎｏ ｅ ｎ ｏ ｅ ｆ Ｂ ａｓ ａ ｎｐ ｓｂ ｇ ｏ ａ ｔｒ ｍ ｍｅａ ｉｎ ｒｓｉ ａ ｕ ｙＡ ｒｂ ｃ ｉ ｔ ｆ ｃ ｓ ｃ ｅｕ ｕ ｅ
（ 江苏省农业科学院经济作物研究所 ， 江苏 南京 ２ ０ １ ） １０ ４
摘要 ： 为获得转基 因高油酸油菜新种质 ， 以甘蓝 型油菜 品种 宁油 １ ２号带 柄子 叶为转基 因受体 ， 通过 与含有 油酸脱饱 和酶基因 （ ２ ｈ Ｒ Ａ表达载体 （ Ｃ ＦＲ ｏ ） 丘ｄ ）ｉｐ Ｎ ｐ Ｎ Ｉ ｎｓ 的农 杆菌 Ｌ Ａ ４ ４共培养 ， Ｂ ４０ 将油菜 丘ｄ ２基因 的反 向重 复 序列表达框转入宁油 １ ， ２号 获得 转基 因植 株。结果表 明 ： 日龄 的带柄子 叶在含有 ２ ４Ｄ １ｍ ／ ４ ，． ｇ Ｌ的共 培养基 中预
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拟南芥 miR 395d前体基因过表达载体构建
• 重组 pMD19T质粒 双酶切 回收 插入表达载体pCAMBIA1304 PCR验证 得到条带（ 850bp） miR395d前 体基因已成功导入农杆菌,可用于油菜转化。
• 预期结果： • 油菜外植体经预培养、农杆菌侵染、共培 养、脱菌培养、生根培养等一系列过程后 部分长成了潮霉素抗性植株。
谢谢
目的基因的获取
• 模板DNA的提取 （CTAB法） 引物的设计
上游引物5′端 加BglⅡ酶切位 点,下游引物 5′端加入 SpeⅠ酶切位点 ，拟南芥DNA 为模板
PCR扩增
466 bp左右 的miR395d 前体基因
上游引物S1:5′-AGATCTATGTCACCCATCCTATCTT CCTCA-3; 下游引物S2:5′-ACTAGTCAACCTCGATCCTCTTA-ACCTGTA-3′ 。
载体的构建
• 1. PCR产物的回收与测序
• PCR产物 琼脂糖凝胶电 回收 克隆载体
泳回收试剂盒 pMD19TVector
连接
DH5α感受 态细胞
转化
含有Isopropyl-β- D 挑选单克隆 thiogalactoside(IPTG)、Xgal和Amp的LB平板
鉴定
测序
2.拟南芥miR395d前体基因过表达载 体构建
用农杆菌介导法将拟南芥miR395d 基因转入油菜中的方法研究
组员：
内容目录
一.目的基因的来源 二.转基因过程 模板DNA的提取 引物的设计 PCR扩增 目的基因的获取
连接 载体的构建 转化 检测 三.遗传转化 1.农杆菌培养 2.无菌苗培养 四.转化 五.检测
目的基因的来源
• 1.miRNA在调节植物对环境胁迫如干旱、盐 害和养分胁迫反应等方面起着重要的作用 • 2.油菜与拟南芥同属于十字花科,亲缘关系 比较近,且miR395在各物种间序列保守。 • 3.采用PCR法从拟南芥中克隆到miR395d前 体基因。
• 双酶切
限制性内切酶 BglⅡ→pCAMBIA1304； SpeⅠ→pre-miR395d
凝胶电泳 T4DNA连接酶 16℃过夜
• 回收
连接
表达
载体（pCAMBIA1304- miR395d）
Байду номын сангаасPCR和序列测 定
3. 根癌农杆菌介导法转化油菜
农杆菌的培养
含pre-miR395d过表达载体的农杆菌 (5 mL)LB+20 mg·L-1Rif+50 mg·L-1 Kan液体培养基 28 ℃振荡培养1d 40 mL新鲜的上 述液体培养基中振荡培养3 ～ 5 h 对数 生长期 离心弃上清 5倍体积的 MS液体培养基悬浮菌液备用
4.转基因油菜PCR检测
• 油菜总DNA
CTAB法 对照
• PCR（850bp）
阳性：模板质粒pCAMBIA 1304-miR395d ; 阴性：未经转化的油菜基因组DNA 拟南芥 miR 395d。
• 上游引物S3:5′-TGTGATGGTCCGATTGAG-3′, • 下游引物S2:5′-ACTAGTCAACCTCGATCCTCTTAACCTGTA-3′
无菌苗的培养
油菜种子 70%乙醇表面消毒30 s 1 g·L-1 HgCl2 消毒5 min 冲洗 种子萌发(MS) 25 ℃光照培养 7d
转化
• 子叶和下胚轴 预培养基黑暗预培养 3d 浸入侵染液（子叶浸泡5 min, 下胚 轴浸泡30 s） MS固体培养基黑暗培养 2d 脱菌培养基6d 筛选培养 基 15 d 换1次培养基 约1 ～ 2 cm的绿芽切下转入壮苗培养基 分化芽苗长至3 ～ 5 cm时转入生根培养基(1 /2MS)中
BglⅡ和SpeⅠ 目的片段
转基因油菜 PCR检测
• 提取潮霉素抗性植株及阴性对照的DNA , 以 质粒DNA为阳性对照, 进行PCR扩增 ,扩增产 物用 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测。
• 抗性植株中, 有能扩增出与质粒DNA大小一 致850bp左右的条带 ,说明拟南芥 miR395d 前体基因已整合到油菜基因组中。