实验1拟南芥室内培养观察与农杆菌转化拟南芥
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法制备转化用的农杆菌菌液准备：1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。
2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。
1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。
3．步骤：共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。
28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。
用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。
转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。
4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
（注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。
2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。
3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。
4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。
5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。
花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥（2）拟南芥种植取Columbia生态型的拟南芥种子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min，10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1%的Top agar混匀，平铺在1/2 MS 培养基上，4℃保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18℃、RH为70%条件下培养。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌渗透转化拟南芥
1）取含有重组质粒的农杆菌，在含有相应抗生素的YEP（LB也可以）平板上划线，28℃培养2-3d。
2）取划线的农杆菌单菌落，接种在3ml含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，250rpm，振荡过夜培养。
3）在400-500ml 含相应抗生素的YEP培养基中，接种3ml过夜培养的起始农杆菌液，并在28℃摇床上振荡过夜，培养至细菌OD600值大于2.0。
4000rpm离心
10min收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液（1/2MS，50g/L蔗糖，0.5g
MES，pH=5.7-5.8，250ul/L silwetL-77(0.02%silwet)）中，此时的OD600值约
为0.8。
一般来说，400ml YEP过夜培养的农杆菌应至少可以渗透转化6钵植株。
4）在一个开口的大器皿（如500ml烧杯）内倒入200-300ml的悬浮有农杆菌的渗透液。
5）将生长有拟南芥的培养钵（盛花期拟南芥，最好在转化前修剪掉果荚和已经开放的花）小心地反扣在上述器皿内，让拟南芥的花芽完全浸入农杆菌悬浮液中
大约1min，将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净。
6）将处理过的植物用塑料盖盖上避光大约24h培养。
7）将植物放置在适宜的条件下培养3-4周，收集种子，进行下一步的筛选处理。
转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
Silwe-77t：加300微升/L 浸30s 50-100微升/L 浸3分钟。
农杆菌转化拟南芥
农杆菌转化拟南芥1．农杆菌感受态制备①从YEB平板培养基上挑取农杆菌单克隆，接种于5 mL YEB （含50µg/mL 利福平）液体培养基中，28ºC，200 rpm，过夜培养；②取2 mL过夜培养液接种于50 mL上述含有利福平的YEB液体培养基中，28ºC，200 rpm，摇床培养至OD达到0.5；③菌液冰浴30 min，转至预冷的50 mL离心管中，4ºC，5000 rpm，离心10 min，收集菌体；④ 2 mL预冷的50 mM 无菌CaCl2溶液（含15%甘油）悬浮菌体，即为感受态细胞；以100 µl/管分装，液氮速冻后，保存于-70ºC冰箱，备用。
2．质粒转化农杆菌感受态①吸取构建好的表达载体质粒5 µl，加入到100 µl感受态细胞中，混匀；②冰浴30 min，液氮冷冻5 min，37ºC热击5 min；③加入800 µl YEB液体培养基，28ºC，200 rpm，摇床培养5 h；④离心，留200 µl上清重悬沉淀，将菌液涂于YEB固体培养基（含质粒对应的抗生素），28ºC培养2 d，挑取单克隆，检测筛选阳性克隆，摇菌后-70ºC保存，用于下一步植物转化。
3．农杆菌侵染拟南芥花序①将筛选的阳性农杆菌在YEB（抗生素）固体培养基划板培养，至长出单克隆后挑3-5个单克隆，于5 mL YEB（抗生素）液体培养基中，28ºC，200 rpm培养16 h，（以培养基变得很浑浊为准），保菌之后全部接到250-500 mL的培养基中，培养16 h以上；②5000 rpm离心20分钟，然后用转化液（1/2MS（只用大量和微量元素），添加50 g/L的蔗糖，调pH为5.8左右，然后加200 ul/L的Silwet L-77混合），剧烈悬浮沉淀至完全悬起；③在拟南芥盛花期，将悬浮液直接浸泡地上部分约1分钟，然后用保鲜膜完全包裹以保湿，放回培养室12小时以上打开保鲜膜；④待种子成熟后（半个月左右），收取种子用于下一步筛选工作。
拟南芥
拟南芥种植花序浸染法转化拟南芥（1）种植：选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土（1：1/2）作为拟南芥种植土壤。
直径9cm的花盆，每盆播种20-30颗。
播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。
（2）去顶：在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。
适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。
（3）配制浸染液：在5%的蔗糖溶液中重悬农杆菌使OD=0.8，为了保持蔗糖溶液的新鲜，可以现配现用，无需灭菌。
100-200ml浸染2-3个小盆植株，400-500ml浸染，2-3个花盆（9cm）植株。
在浸染之前加入表面活性剂至浓度0.05%（500ul/L），如果产生表面活性剂的毒性现象（浸过部分发黄或死亡），将浓度降至0.02%。
（4）浸染：将盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在农杆菌悬浮液中2-3s，同时轻轻旋转。
（5）暗培养：将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态暗室培养24h。
（6）浸染后培养：隔天浇水，保证水分充足即可。
（7）种子收集：种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。
（8）转基因种子筛选：在含有Kan抗生素的平板上培养浸染后所得种子。
40mg的种子大约200颗于含kan 10-50μg/ml 的0.5×MS培养基上春化2天，之后在持续光照条件下培养7-10天。
根据生长状况判断是否为转基因种子。
成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出4片以上真叶。
非转基因种子不能正常生长，仅能长出2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10天以后死亡。
（9）转基因植株转土栽培。
转基因种子在MS+kan平板上萌发2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养。
转基因拟南芥纯合子筛选由于农杆菌介导的花序浸染法只能将目标片段整合到一条DNA单链上，为后续生理性状实验需要，将T0代转基因种子培育至T2代，利用抗性筛选得到纯合子。
根据杂合子在发生性状分离时会产生野生型后代，而野生型种子不能在MS+Kanr（50μg/ml）平板上正常生长，进行转基因植株纯合子的筛选。
拟南芥培养及遗传转化
拟南芥待转化植株培养及遗传转化一实验目的：获得待转化拟南芥植株并进行花序浸润转化植株。
二实验材料：拟南芥种子（拟南芥的生态型最好是Col-0或者Ws-O，Nd-O，No-O），25cm3花盆，15ml离心管，10ml吸管，Agar，乙醇，次氯酸钠，利福平，Silwet L-77，营养液配方所需试剂，营养土，蛭石，塑料薄膜，托盘等。
三实验步骤：1 待转化植株培养⑴种子消毒：20μl种子装入1.5ml离心管内，加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 1%次氯酸钠，震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；均匀撒播于MS培养基平板上，注意每次洗脱用V ortxe充分混匀。
⑵春化作用：将MS培养基放到4℃冰箱中放置2天。
⑶将MS培养基放置在23 0 C/20 0 C光照培养箱16h/8h培养，在有3~5片成熟叶片后，移栽生长良好的拟南芥幼苗至用营养液浇灌过的营养土和蛭石（4:6）中生长，营养土和蛭石分装在25cm3的小培养皿中，保湿7天左右，湿度为60%~80%。
在生长期间适当浇灌营养液，按需要没3-4周一次（或者时间更长）。
⑷为了在每个植株上得到较多的花芽，当大多数植株第一个花序形成后剪去第一个花序，解除顶端优势，促使多个次生花序的同步出现。
当大多数花序约1~10cm高（剪主序后4~8d）时准备浸润。
表1 MS培养基注意事项：①溶化琼脂：用粗天平分别称取琼脂5.5g、蔗糖20 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入750 mL蒸馏水，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。
然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1000 mL，搅拌均匀。
②调节PH至5.7~5.8。
表2 营养液配方（无需调节PH）成分含量（mol/L）Ca(NO3)2·4H2O 1.01×10-3NH4H2PO4 1.30×10-4KNO3 5.10×10-3MgSO4·7H2O 4.98×10-4NaOH 3.13×10-5Fe-EDTA 2.24×10-5H3BO39.68×10-6Mncl2·4H2O 2.03×10-6CuSO4·5H2O 2.1×10-7MoO3 1.39×10-7Co（NO3）2·6H2O 8.59×10-8NH4NO3 2.93×10-52 农杆菌的培养取出保种的农杆菌菌液活化后，挑取农杆菌单菌落接入10mL无菌LB液体培养基中（一般含75mg/ L利福平、100mg/ L链霉素和100mg/ L卡那霉素），28℃恒温下250r/ min 振摇过夜培养。
拟南芥转基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握拟南芥转基因技术的基本原理和方法。
2. 熟悉转基因操作流程，包括目的基因的克隆、转化、筛选和鉴定等步骤。
3. 了解转基因技术在植物基因功能研究中的应用。
二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛应用的植物模式生物，具有生长周期短、繁殖速度快、基因组序列已完全解析等特点，使其成为研究植物生长发育、基因调控和生物技术的理想材料。
转基因技术是将外源基因导入植物基因组中，使其在植物细胞中表达，从而改变植物性状或赋予其新的功能。
本实验采用农杆菌介导的转基因方法，将目的基因导入拟南芥基因组中。
实验流程包括以下步骤：1. 目的基因的克隆：从基因库或基因组DNA中提取目的基因，通过PCR技术扩增目的基因片段。
2. 载体构建：将目的基因克隆到载体上，如T载体或pBI121载体。
3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥细胞。
4. 植物再生：将感染了重组载体的拟南芥叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。
5. 鉴定：通过PCR、Southern blotting等方法对转基因植株进行鉴定。
三、实验材料1. 拟南芥野生型植株（Col-0）2. 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株E. coli JM1093. 目的基因片段4. T载体或pBI121载体5. PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶等6. 培养基、抗生素、琼脂糖等四、实验步骤1. 目的基因的克隆：根据目的基因的序列设计引物，进行PCR扩增。
将扩增产物与T载体连接，转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。
2. 载体构建：将目的基因克隆到pBI121载体上，进行酶切和连接反应。
将连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。
3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥叶片。
将感染后的叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。
农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
本实验使用农杆菌介导植物的遗传转化技术，将外来基因导入到拟南芥植物中。
通过将拟南芥的幼苗浸泡在农杆菌中，再经过一定的培养条件，使外来基因被顺利地导入到拟南芥植物的细胞中，并观察到了转化成功的基因表达现象。
实验过程：
1. 构建外源基因载体——将目的基因把它克隆进载体中，构建出我们所需要的质粒；
2. 建立农杆菌表达载体——通过将农杆菌表达载体连接到质粒上，形成我们的转化载体；
3. 准备转化基质——通过将农杆菌营养培养在一定条件下，形成我们所需要的转化基质；
4. 转化拟南芥中——通过将拟南芥幼苗浸泡到农杆菌基质中，利用细胞壁酶和孔道蛋白结合作用，导入外源基因，最终实现基因转化；
5. 鉴定转化水平——通过将转化后的拟南芥植株置于含有抗生素的培养基中，筛选出转化成功的植株。
实验结果：
通过观察实验结果，我们发现拟南芥细胞成功地接受了外源基因，使其表达了目
的蛋白。
同时，通过筛选，我们也成功得到转化成功的植株。
结论：
农杆菌介导植物的遗传转化技术是一种有效的基因转化方法，可以将外源基因导入到植物细胞中，从而实现第二代遗传分析、基因功能研究、新品种选育等方面的应用。
拟南芥遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在通过农杆菌介导法对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行遗传转化，将目的基因导入拟南芥基因组中，并通过筛选和鉴定得到转基因植株。
二、实验材料1. 拟南芥（T0代）植株2. 根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株3. 目的基因质粒（含有荧光素酶基因）4. 抗生素：卡那霉素、氯霉素5. 培养基：MS培养基、N6培养基、再生培养基6. 仪器：离心机、PCR仪、荧光显微镜等三、实验方法1. 构建重组表达载体将荧光素酶基因插入到农杆菌转化载体pCAMBIA1300中，构建重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化将重组表达载体转化根癌土壤杆菌GV3101菌株，通过平板划线法筛选阳性克隆。
3. 拟南芥转化将阳性克隆的农杆菌悬浮液与拟南芥（T0代）花序进行蘸花处理，将蘸花后的拟南芥放入MS培养基中培养。
4. 筛选和鉴定在含有卡那霉素的培养基上筛选转基因植株，通过PCR检测和荧光显微镜观察GUS 基因的表达情况，鉴定转基因植株。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，待植株生长稳定后，收集种子进行繁殖。
四、实验结果1. 构建重组表达载体成功构建了含有荧光素酶基因的重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化通过平板划线法筛选到阳性克隆，表明重组表达载体已成功转化根癌土壤杆菌GV3101菌株。
3. 拟南芥转化蘸花处理后，部分拟南芥植株在含有卡那霉素的培养基上生长，表明转基因植株已成功筛选。
4. 筛选和鉴定通过PCR检测和荧光显微镜观察，发现部分转基因植株GUS基因表达阳性，荧光素酶活性明显。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，植株生长良好，繁殖成功。
五、实验讨论1. 本实验通过农杆菌介导法成功将荧光素酶基因导入拟南芥基因组中，获得了转基因植株。
2. 在实验过程中，农杆菌转化和拟南芥转化效果良好，表明该实验方法适用于拟南芥遗传转化。
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8、高压灭菌
（1） MS培养基（121ºC,15分钟）。 （2）玻璃烧杯：200ml 2个、500ml 1个、 50ml的三角瓶
20个、培养皿8个（ 4培养皿装滤纸，6片/平皿）。 （3）枪型镊子、剪刀各2把。 （4）1ml、200ul、20ul的tip头各1盒。 (5)nney et al 2001
1、影响因素 MS salts, hormone, OD of bacteria etc.
2、 3、 4、
作业
预习：烟草叶片愈伤组织诱导和器官发生
课后各组查阅资料，设计3个不同浓度的NAA和 6-BA，用于诱导不同器官，如芽、根、叶等
叶盘法 原生质体共培养 创伤植物感染法
原生质体培 养
农杆菌介导拟南芥的转化
实验原理 农杆菌的感染与生存
农杆菌介导拟南芥的转化
实验原理
技术应用
一种方便，高效的植物转基因方法，多用于转化双子叶植物， 经过改进后也逐渐用于单子叶植物的转化。
McKinney et al 2001
拟南芥转基因技术：
发育生物学实验
2016年
实验1 拟南芥室内培养观察及 农杆菌转化拟南芥
一、拟南芥简介
二、实验技术---农杆菌介导拟南芥转化
农杆菌介导拟南芥的转化
实验目的
1、学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理 2、掌握农杆菌介导转化拟南芥 的实验方法 3、了解拟南芥的生理特点及在基因工程实验中应用。
实验材料
In planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C R Acad Sci Ser III Sci Vie Life Sci 1、影响因素
MS salts, hormone, OD of bacteria, vacuum, etc. 无影响 Plant health 非常重要因素 2、转化效率： 1% 3、转化步骤 a、Grow healthy Arabidopsis plants until they are flowering.
农杆菌GV3101重组菌株，重组双元表达载体pCAMBIA1300 ， 拟南芥
实验试剂
LB液体培养基，Kan（卡那霉素），Rif（利福平）； 转化介质 ：MS培养基、5%蔗糖，0.03%SilwetL-77，KOH调 pH 5.7。
农杆菌介导拟南芥的转化
实验原理
浸花法
双子叶植物
无宿主限制， 技术限制